CN112795520B - 一种用于粪肥降解的芽孢杆菌 - Google Patents

一种用于粪肥降解的芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于粪肥降解的芽孢杆菌，属于微生物技术领域。所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)Owin‑2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2021021；保藏日期：2021年1月6日；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。本发明公开的芽孢杆菌Owin‑2可很好的应用于畜禽粪肥的处理，能够快速消除恶臭，24小时降解率达到90％，彻底实现“零污染、零排放、无臭味”。

Description

一种用于粪肥降解的芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种用于粪肥降解的芽孢杆菌。
背景技术
随着畜禽产品市场需求的不断扩大，养殖业的发展规模也在不断的扩大。无论是养殖企业还是散户养殖每天都会产生大量的粪污废弃物，以一个5000头生猪养殖规模的养殖场为例，每天大约会产生30吨左右粪污，成为养殖场的重大负担，这些粪污如果不能及时处理将会带来严重的环境污染。粪污目前主要的处理方式是作为有机肥直接使用，但不经过发酵降解的有机肥中有害菌较多，营养物质利用率较低，对土地的增肥效果有限，无法发挥最大肥力，同时，粪污的臭味持续时间长，造成长时间的空气污染。
发明内容
为解决现有技术中的问题，本发明专利提供了一种用于粪肥降解的芽孢杆菌，能够快速的用于畜禽粪污的降解，短时间内即可除臭，效果显著，所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)Owin-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2021021；保藏日期：2021年1月6日；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
同时本发明公开了一种含有上述芽孢杆菌(Bacillus sp.)Owin-2的畜禽粪肥处理用菌剂。
所述的畜禽粪肥处理用菌剂，包含:170g的Na2HPO4·7H2O，1.107g的MgSO4·7H2O，30g的KH2PO4，0.9864g的CaCl2·6H2O，5g的NaCl，50g的葡萄糖，10g的NH4CI，50g的CasaminoAci，10L蒸馏水H2O，以及1x1010cfu/ml的芽孢杆菌Owin-2。
本发明还提供了上述畜禽粪肥处理用菌剂在畜禽粪肥降解中的应用，将含有芽孢杆菌Owin-2的菌剂以液体的形式喷洒在畜禽粪降解堆上，并充分翻搅均。
或者将上述含有芽孢杆菌Owin-2的畜禽粪肥处理用菌剂，以冻干粉的形式与载体物料混合构成降解堆，所述载体物料选自秸秆、锯末、稻草、稻壳、花生壳、砻糠、麸皮、鱼粉、米糠中的任意两种以上的混合物。
进一步的，上述含有芽孢杆菌Owin-2的畜禽粪肥处理用菌剂与载体物料的比例为1:100～1000。
相对于现有技术，本发明专利提供的一种用于粪肥降解的芽孢杆菌的进步之处在于：通过微生物降解有机物的原理，使粪污降解为水蒸汽、二氧化碳等无害气体后挥发，短时间内即可消除恶臭，24小时降解率达到90％以上，彻底实现“零污染、零排放、无臭味”，与载体物料混合构成降解堆在使用2-3年内不用增加、更换垫料，每4-6个月补充一次菌剂即可，应用方便，降解完的畜禽粪肥可直接应用于农作物的土壤增肥。
附图说明
图1是3各菌种消除尿素的时量曲线图
图2是3种菌对尿素的消除率示意图
图3是3种菌消除氨水的时量曲线图
图4是3种菌对氨水的消除率示意图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例仅仅是本发明创造一部分的实施例，而不是全部。基于本发明创造中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明创造保护的范围。
实施例1
取畜禽粪污集中处理厂的腐熟粪污样品10g于三角瓶中，加入100ml生理盐水，搅拌均匀，于恒温水浴摇床中振摇30分钟，备用；
按比例配制芽孢杆菌固体培养基，并于120℃灭菌30分钟,培养基的组成包括酵母膏10g、蛋白胨10g、琼脂10g、葡萄糖10g、硫酸镁1g、氯化钠1g、氯化钙1g、磷酸钠3g。
将灭菌好的培养基铺到6个平皿中，凝固后备用；用接种环蘸取粪污样品分别在6个平皿中进行划线培养；
将划线的平皿倒置于37℃的培养箱中，培养72小时；升温至45℃再培养24℃；挑取平皿上的芽孢杆菌落作进一步的纯化，完成菌落的初步筛选。
制备驯化液体培养基包含牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g和水1000ml，分装于多个摇瓶中，并于120℃灭菌30分钟。
选取长势良好的筛选菌落分别接种于3只装有液体培养基的摇瓶中，于45℃恒温水浴摇床中振荡培养，培养24小时；
24小时后，选取少许菌落接种于3只新的装有液体培养基的摇瓶中，于50℃恒温水浴摇床中振荡培养，培养24小时；
24小时后，选取少许菌落接种于3只新的装有液体培养基的摇瓶中，于55℃恒温水浴摇床中振荡培养，培养24小时；
24小时后，选取少许菌落接种于3只新的装有液体培养基的摇瓶中，于60℃恒温水浴摇床中振荡培养，培养24小时；
24小时后，选取少许菌落接种于3只新的装有液体培养基的摇瓶中，于62℃恒温水浴摇床中振荡培养，培养24小时；
重复如上操作，每次移种后，培养温度提高2℃，直至于70℃恒温水浴摇床中振荡培养24小时；
在70℃环境下，连续传代培养7代，直至菌落生长速度与37℃时相同。
待菌种进入对数生长期后，将菌种接种到新的含有3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠的液体培养基上，70℃摇床培养，24小时后加入1ml的醋酸，并每隔12小时加入1ml的醋酸，连续添加两次；
培养48小时后收集菌种稀释，接种于新的液体培养基上继续进行摇床培养，12小时后加入2ml醋酸，24小时后再加入2ml醋酸；
36小时后收集菌种，同条件下连续传代培养5代。稀释后使用接种环接种于固体培养基上进行多次划线培养，直至长出单株菌落，固体培养基含有酵母膏10g、蛋白胨10g、琼脂10g、氯化钠5g。
得到的菌株革兰氏阳性，杆状，无荚膜，产芽孢，芽孢呈椭圆形至柱状。送青岛西弥斯检测技术服务有限公司进行16srDNA检测，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16SrRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′和F27:5′-AGA GTT TGATCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增条件为：95℃预变性3min，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，所得序列如序列表SEQ No.1所示。Blast结果同源性最高的为芽孢杆菌，命名为芽孢杆菌Owin-2。
SEQ.No.1：
CCGCTCCAGAAGGTTACCTTACCGACTTCTTGTGTGCATACACACTCTCAGGGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACGACTTTATCAGATTAGCTCGCTCTCGCGAGTTGGCTTCCCTTTGTATCCTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAGAGATAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAACACACGAGCTGAACACCACCATGCACCAACTGTCATCGTTGCCCCCGAAGGGGAAACTATATCTCTACAGTGGTCAACGGGATGTCAAAACCTGGAAAGGTTCTTCGCGTTGCTCCAAATTAAACCACATGCTCCACCGCTGGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGATTTTCACTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGGGGAGTGCTTAATGCGTTACCCGCGACACTAAGGCGCGGAAACCCCCTCACACTTACCACTCATCTTTTACGGCGTGCAATACCGGGGTATCTAATCGTGTTTGCTCCCCACGCTT
实施例2
1、取扩增的实施例1分离筛选得到的芽孢杆菌Owin-2和市购的两种粪污处理用菌的菌悬液，离心，菌体分别用5％葡萄糖溶液重悬，以保证体系中无其它氮元素来源。加入一定浓度的尿素、氨水溶液后，置于37℃，220rpm摇床振摇，以相同体积的无菌体系为阴性对照。按一定时间间隔取样，用比色法测定离心所得上清中的含氮化合物含量。以5％葡萄糖溶液为空白对照。绘制含氮化合物浓度-时间曲线(时效曲线)，分析比较结果。
尿素
反应机理：尿素与PDAB反应生成柠檬黄色的对二氨基苯甲醛脲；
主要试剂：对二甲氨基苯甲醛(PDAB)溶液、硫酸；
显色时间：20min
测定波长：422nm
氨水
反应机理：铵态氮在碱性介质中与次氯酸钠作用生成靛酚蓝；
主要试剂：水杨酸、次氯酸钠溶液、氢氧化钠；
显色时间：20min
测定波长：580nm
2、菌种消除尿素溶液的定量测定
将菌密度OD600＝0.75的芽孢杆菌Owin-2和市购的两种粪污处理用菌的悬液与浓度为1000mg/L的尿素溶液混合，留取0h样品作尿素初始浓度，后放入恒温摇床37℃，220rpm培养，以无菌的5％的葡萄糖溶液混合尿素溶液为阴性对照；其余间隔取样3ml，12000rpm离心2min后取上清2.5ml，待显色完全后测定422nm处的OD值，同时测定尿素含量，确定其中的尿素的消除率。测定结果如图1、图2所示。
3、菌种消除氨水的定量测定
将菌密度OD600＝0.75的6种菌悬液与1:3200稀释的氨水溶液混合(氨浓度74.8mg/L)，分别编号Owin-1、Owin-2、Owin-3、复合菌、市购复合菌组和市购单菌组，留取0h样品作氨初始浓度，后放入恒温摇床37℃，220rpm培养，以无菌的5％的葡萄糖溶液与氨水混匀为阴性对照；其余间隔取样0.5ml，12000rpm离心2min后取上清200μl，待显色完全后测定580nm处的OD值，同时测定氨水含量，确定其中的氨水的消除率。测定结果如图3、图4所示。
由图1、图3可以看出，分离得到的芽孢杆菌Owin-2的OD值在开始出现下降后迅速回升，并一直保持在相对恒定的数值，说明芽孢杆菌Owin-2具有很好的持续性，菌体在处理的过程中能够进行有效的自我增殖，处理能力更加的持久，而市购的两组芽孢杆菌随着时间的推移，菌密度都存在明显的下降，自我增殖更新能力不足，持久性差。
从图2、图4可以看出分离得到的芽孢杆菌Owin-2对尿素和氨水的消除率一直保持稳定的增长状态。而市购的两种菌株，在初始阶段保持了一定的消除率，到后期基本不变，说明大部分菌体已基本失去活性，同时其消除率明显低于芽孢杆菌Owin-2。
实验结果表明，芽孢杆菌Owin-2体外条件下对氨水、尿素的消除能力强，且与现有市售菌相比具有明显优势，能够最大限度地消除含氮化合物，同时菌体继续保持扩增状态，持续性强。
实施例3
使用实施例1分离筛选得到的芽孢杆菌Owin-2制备液体菌剂，菌剂包含170g的Na2HPO4·7H2O，1.107g的MgSO4·7H2 O，30g的KH2PO4，0.9864g的CaCl2·6H2O，5g的NaCl，50g的葡萄糖，10g的NH4CI，50g的Casamino Aci，10L蒸馏水H2O，活菌数量超过1x1010cfu。
将制得的液体菌剂与固体载料混合构成降解堆，固体载料包括30％的秸秆、30％的花生壳、30％的麸皮、10％的米糠。液体菌剂与固体载料的混合比例为1：500，加水充分混匀，水分含量40％左右，进行发酵处理。
将1吨左右的畜禽粪污与40m3的降解堆混合，混合后对其喷淋液体菌剂，3小时后，即可明显消除恶臭，24小时后降解率可达90％。
本实施例制作的芽孢杆菌Owin-2液体菌剂经浓缩、喷雾、真空冷冻干燥后可制成菌剂冻干粉，进行长期保存，方便运输。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。
序列表
<110> 江苏欧尔润生物科技有限公司
<120> 一种用于粪肥降解的芽孢杆菌
<141> 2021-03-08
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 700
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 1
ccgctccaga aggttacctt accgacttct tgtgtgcata cacactctca ggggtgtgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgtggc attctgatcc gcgattacta 120
gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gactacaatc cgaactgaga acgactttat 180
cagattagct cgctctcgcg agttggcttc cctttgtatc ctccattgta gcacgtgtgt 240
agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300
ccggcagtca ccttagagtg cccaactaaa tgatggcaac taagagatag ggttgcgctc 360
gttgcgggac ttaacccaac atctcaacac acgagctgaa caccaccatg caccaactgt 420
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gcaataccgg ggtatctaat cgtgtttgct ccccacgctt 700

Claims (6)

1.一种用于粪肥降解的芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.)Owin-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2021021；保藏日期：2021年1月6日；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
2.一种畜禽粪肥处理用菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述的芽孢杆菌Owin-2。
3.根据权利要求2所述的畜禽粪肥处理用菌剂，其特征在于，所述菌剂包含:170g的Na2HPO4·7H2O ，1.107g的MgSO4 ·7H2 O，30g的KH2PO4，0.9864g的CaCl2·6H2O，5g的NaCl，50g的葡萄糖，10g的NH4CI，50g的Casamino acids，10L蒸馏水H2O，以及1x1010cfu/ml的芽孢杆菌Owin-2。
4.如权利要求3所述的畜禽粪肥处理用菌剂在畜禽粪肥降解中的应用，其特征在于，将含有芽孢杆菌Owin-2的菌剂以液体的形式喷洒在畜禽粪降解堆上，并充分翻搅均。
5.如权利要求3所述的畜禽粪肥处理用菌剂在畜禽粪肥降解中的应用，其特征在于，将菌剂以冻干粉的形式与载体物料混合构成降解堆，所述载体物料选自秸秆、锯末、稻草、稻壳、花生壳、砻糠、麸皮、鱼粉、米糠中的任意两种以上的混合物。
6.根据权利要求5所述的畜禽粪肥处理用菌剂在畜禽粪肥降解中的应用，其特征在于，菌剂与载体物料的比例为1:100~1000。
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