CN107384793A - 一种可降解羽毛菌株的筛选方法及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可降解羽毛菌株的筛选方法，具体步骤包括从鸡场堆积病死鸡尸的地点取土壤样品；富集；初筛；复筛；分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取单菌落进行平板划线；划线培养所得单菌落即为可降解羽毛菌株ABTNL‑4。本发明还提供了可降解羽毛菌株的应用方法，以羽毛粉为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述培养基中加入可降解羽毛菌株ABTNL‑4，37℃培养，即可实现羽毛降解。本发明方法羽毛的降解率可高达95％，微生物法降解羽毛，较物理化学法降解羽毛来说，反应条件温和，耗能少，经济环保的同时还避免了大部分氨基酸的损失,提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。

Description

一种可降解羽毛菌株的筛选方法及应用方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地说，涉及一种可降解羽毛菌株的筛选方法及应用方法。

背景技术

羽毛是鸟类和禽类表皮细胞角质化的衍生物，占其体重的10％。据统计，我国家禽年出栏量：2010年110.1亿只，2011年113.3亿只，2012年120.8亿只，2013年119.0亿只，2014年115.4亿只，2015年143.52亿只。按此趋势发展，家禽的羽毛产量持续增长。

羽毛的主要成分90％以上为角蛋白，羽毛属于天然角蛋白质，一种硬蛋白，很难被消化利用，导致蛋白资源的严重浪费。

数据显示，在中国，羽毛年产量可高达1100万t；而废弃羽毛的年产量可高达10万t。这些废弃羽毛主要的处理方法为填埋、焚烧，给生态环境带来严重的挑战。

国内外很早就开展了羽毛废弃物的资源化利用，但采用的方法主要是物理法—高温高压、膨化；化学法—酸碱水解。这些方法在加工过程中存在很大的缺点：高耗能，污染环境，同时所得的羽毛粉的营养价值损失严重，可利用率低。这些条件限制严重制约了技术的应用与普及。而微生物法降解，条件比较温和，显著地缩短了发酵周期，反应条件温和，耗能少，经济环保的同时还避免了大部分氨基酸的损失,提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种可降解羽毛废弃物的方法，实现降成本、低能耗、同时避免环境污染。

为了达到上述目的，本发明提供了可降解羽毛菌株的筛选方法，具体步骤为：

1、从鸡场堆积病死鸡尸的地点取土壤样品若干，称取样品1g，溶于20-30ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；

2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的20-30ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；

所述富集培养基的组成成分为：每1000ml的蒸馏水中加入：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，pH 7.4-7.6

3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；

所述液体筛选培养基的配比为每1000ml水中加入氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.3-0.5g，磷酸二氢钾0.3-0.8g，羽毛粉6.0-20.0g，pH 8.0-8.5；

4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水后进行梯度稀释，稀释至10^-5-10^-8倍，将稀释液涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；

所述复筛过程采用的固体筛选培养基的配比为：每1000ml水中加入氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.3-0.5g，磷酸二氢钾0.3-0.8g，羽毛粉6.0-20.0g，琼脂粉10.0-20.0g，pH 8.0-8.5；

5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取单菌落进行平板划线；划线培养所得菌落即为可降解羽毛菌株ABTNL-4；

6、菌种保藏：从步骤5划线平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取菌液与已灭菌的50％的甘油以1:1的比例混匀于冻存管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。

优选方式下，步骤4复筛中稀释过程，稀释到10^-6或10^-7倍。

本发明还提供了一种上述可降解羽毛菌株的应用方法，以羽毛粉为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述培养基中加入菌株ABTNL-4，37℃培养，即可实现羽毛降解。

优选方式下，上述可降解羽毛菌株的应用方法，具体操作为，取菌株ABTNL-4置于含有羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，即可实现羽毛降解；

所述菌株ABTNL-4的菌株浓度为10⁸～10⁹CFU/ml；

所述发酵培养基的配比为每1000ml水中加入硫酸镁0.04-0.3g，氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.2-0.6g，磷酸二氢钾0.3-0.9g，氯化钙0.01-0.1g，羽毛粉6.0g-20.0g，调节pH至8.0～8.5。

本发明所用的微生物菌株ABTNL-4是在鸡场病死鸡尸堆积点的土壤中分离得到的，经过16SrRNA，BLAST，clustalx-2分析以及系统发育树的构建及形态学、生理生化鉴定结果，将该菌株定命名为Bacillus thuringiensis ABTNL-4，该菌经发明人检测在培养48h后对羽毛的降解率高达95％。

相比于现有技术，本发明的优势在于：

1、本发明采用的微生物菌株ABTNL-4，该菌株可以从鸡场病死鸡尸堆积点的土壤中筛选获得，培养原料简单易得、来源广泛。

2、本发明菌株筛选过程中提供了多种培养基，使菌株的筛选过程更加高效准确，各筛选步骤得到的菌株纯度高，应用效果好。

3、本发明所涉及的Bacillus thuringiensis ABTNL-4，可应用于降解羽毛，48h降解率可达到95％。同时，利用现代生物技术——基因工程、代谢组学、生物系统学等高科技技术，还可进一步提高该菌株的羽毛降解率，并通过降解产物而获得高附加值的营养成分，使该菌株的工业发展前景更加广阔。

4、本发明采用的微生物菌株ABTNL-4，该菌株不但降解羽毛周期短，而且降解效率高，可有效解决废弃羽毛的资源浪费问题，得到可利用的氨基酸和多肽，减少环境污染；同时由于降解产物中所含附加营养成分较高，因而满足了工业化生产。

5、本发明微生物法降解羽毛，与物理化学法相比，无需提供设备，使能耗大大降低，同时，发酵周期短，降解效率高，避免了大部分氨基酸的损失，提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。

附图说明

图1为微生物菌株Bacillus thuringiensis ABTNL-4的扫描电镜照片；

图2为ABTNL-4的系统发育树；

图3为实施例4中在微生物菌株Bacillus thuringiensis ABTNL-4的作用下48h羽毛的降解情况。

保藏信息

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ABTNL-4，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，于2014年11月21日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.10036。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

以下具体实施方式为对本发明的上述内容做进-步的详细说明，但并不意味着本发明上述主体的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：羽毛降解菌种的筛选1

从普兰店某鸡场采集病死鸡尸堆积点土壤。

通过富集培养和初筛、复筛、进一步分离纯化得ABTNL-4菌株。

试验装置与羽毛处理

粉碎羽毛的实验装置：220V，3.6KW的高速多功能粉碎机。

羽毛处理：家禽活宰点收集到的羽毛经流水冲洗干净，55℃烘干4-7天，备用。羽毛经粉碎机粉碎，过100目筛子，供固体培养使用。

富集培养基的配制：向含有1000ml蒸馏水的锥形瓶中分别加入牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，然后在磁力搅拌器上搅拌溶解，溶解后用2mol/L的NaOH溶液调节pH为7.4-7.6。加盖密封，121℃，高温湿热灭菌20min。

培养基的分装：取已灭菌的富集培养基20ml置于已灭菌的50ml的离心管中备用。

筛选培养基的配制：以羽毛作为唯一的碳源氮源，只有可以利用羽毛的微生物菌株才能在该培养基上生长。根据液体筛选培养基的配方所需，称取氯化钠0.6g，磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.5g，溶解后，再加水至1L。pH 8.0-8.5取100ml于250ml的锥形瓶中，再加入羽毛0.8g。以此逐个分装。121℃，高温湿热灭菌20min。

固体筛选培养基的配制：在以上液体筛选培养基的基础上再加入琼脂粉20.0g即可。然后置于灭菌锅中，121℃，高温湿热灭菌20min。

具体的筛选步骤如下：

1、从普兰店某鸡场采集病死鸡尸堆积点取土壤样品若干，称取样品1g，溶于25ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；

2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的25ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；

3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；

4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中进行梯度稀释，然后选取10^-6，涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；

5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取了单菌落进行平板划线；

6、菌种保藏：从固体平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取600μl于600μl已灭菌的50％的甘油混匀于冻存管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。

实施例2：羽毛降解菌种的筛选2

从普兰店某鸡场病死鸡尸堆积点采集土壤样品。

通过富集培养和初筛、复筛、进一步分离纯化得ABTNL-4菌株。

试验装置与羽毛处理

粉碎羽毛的实验装置：220V，3.6KW的高速多功能粉碎机。

羽毛处理：家禽活宰点收集到的羽毛经流水冲洗干净，55℃烘干5-7天，备用。羽毛经粉碎机粉碎，过100目筛子，供固体培养使用。

富集培养基的配制：分别称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，加入到含有1000ml蒸馏水的锥形瓶中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，溶解后用2mol/L的NaOH溶液调节pH为7.4-7.6。加盖密封，121℃，高温湿热灭菌20min。

培养基的分装：取已灭菌的富集培养基25ml置于已灭菌的50ml的离心管中备用。

筛选培养基的配制：以羽毛作为唯一的碳源氮源，只有可以利用羽毛的微生物菌株才能在该培养基上生长。根据液体筛选培养基的配方所需，称取氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.4g，溶解后，再加水至1L。pH 8.0-8.5取100ml于250ml的锥形瓶中，再加入羽毛1.0g。以此逐个分装。121℃，高温湿热灭菌20min。

固体筛选培养基的配制：在以上液体筛选培养基的基础上再加入琼脂粉20.0g即可。然后置于灭菌锅中，121℃，高温湿热灭菌20min。

具体的筛选步骤如下：

1、从普兰店某鸡场病死鸡尸堆积点取土壤样品若干，称取土壤样品1g，溶于20ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；

2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的25ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；

3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；

4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中进行梯度稀释，然后选取10^-7，涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；

5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取了单菌落进行平板划线；

6、菌种保藏：从固体平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取600μl于600μl已灭菌的50％的甘油混匀于已灭菌的1.5ml的离心管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。

实施例3：菌种鉴定

本发明上述可降解羽毛菌株鉴定过程具体为：

菌种鉴定：采用16SrRNA法对微生物菌株进行鉴定

菌种鉴定结果：PCR扩增、测序：该菌株以肉汤培养基为底物培养至指数生长期，离心收集菌体，用PCR仪进行煮沸获取总DNA，16S rRNA PCR反应体系所用引物为通用引物(27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)。

PCR反应体系

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min；第2步循环29次；72℃10min，电泳观察。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

根据上海生工生物工程技术服务有限公司的测序结果，进入NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)进行BLAST比对，然后进行clustalx-2.0，MEGA5.0构建系统发育树，结果如图2所示。

经测定，本发明所述的菌株具有以下微生物学特性：

形态学的特性：微生物菌株在肉汤固体培养基培养过夜，菌落呈现为圆形,白色,边缘光滑,不透明.菌体在显微镜下观察呈椭圆形杆状,大小为(1.2～1.8)μm×(3.0～5.0)μm。

扫描电镜观察：取对数生长期菌液，离心收集菌体，以PBS缓冲液(pH7.2)冲洗，样品送大连海洋大学做喷金处理，处理后的样品送大连交通大学进行扫描电镜观察并拍照。如图1所示

培养学特性：以1％的羽毛粉作为唯一的碳源和氮源，再选取基本培养基进行好氧培养。

上述所述的基本培养基的配比为：每1000ml蒸馏水中加入氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.3g，磷酸二氢钾0.4g，琼脂粉20.0g，pH 8.0-8.5。

综上所述各项指标可得知所筛到的可降解羽毛的菌株为Bacillusthuringiensis，并命名为Bacillus thuringiensis ABTNL-4。

实施例4：微生物菌株ABTNL-4的应用1

菌种的复苏：从-80℃的冰箱中取出已冻存的菌种，待其慢慢融化，取100μl于20ml已灭菌的NB培养基中，37℃，160r/min的摇床中培养过夜。

从培养过夜的NB培养基中取出100μl于100ml含有1g羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，实时观察检测羽毛粉的降解情况。培养过夜的微生物菌株ABTNL-4的菌株浓度达到10⁸-×10⁹CFU/ml。

发酵培养基的具体成分为：硫酸镁0.1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.35g，磷酸二氢钾0.45g，氯化钙0.01g，羽毛粉10.0g，蒸馏水1000ml，pH 8.0-8.5。

实验结果：微生物菌株ABTNL-4在37℃，160r/min的条件下培养，经过48h，羽毛粉的降解率可高达95％，巯基含量可高达2.05mmol/L。从本实施例的结果可以看出微生物菌株ABTNL-4可高效率的降解废弃羽毛。

降解效果如图3所示。

实施例5：微生物菌株ABTNL-4的应用2

菌种的复苏：从-80℃的冰箱中取出已冻存的菌种，待其慢慢融化，取100μl于25ml已灭菌的基础培养基中，37℃，160r/min的摇床中培养过夜。

从培养过夜的NB培养基中取出100μl于100ml含有1.5g羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，实时观察检测羽毛粉的降解情况。培养过夜的微生物菌株ABTNL-4的菌株浓度达到10⁸-10⁹CFU/ml。

发酵培养基的具体成分为：硫酸镁0.15g，氯化钠0.6g，磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钙0.02g，羽毛粉15.0g，蒸馏水1000ml，pH 8.0-8.5

实验结果：微生物菌株ABTNL-4在37℃，160r/min的条件下培养，经过48h，羽毛粉的降解率可高达94.7％，巯基含量可高达2.02mmol/L。

从实施例4和实施例5的实验结果可以看出微生物菌株ABTNL-4可高效降解废弃羽毛，减少环境污染的同时，也实现资源的再利用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种可降解羽毛菌株的筛选方法，其特征在于，具体步骤为：

S1、从鸡场堆积病死鸡尸的地点取土壤样品若干，称取样品1g，溶于25ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中15-25min摇匀；

S2、富集：取1ml-2ml摇匀的样品液于分装好的20-30ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；

所述富集培养基的组分为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.4-7.6

S3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；

所述液体筛选培养基的配比为每1000ml水中加入氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.2-0.5g，磷酸二氢钾0.3-0.8g，羽毛粉6.0-20.0g，pH 8.0-8.5；

S4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl液体筛选培养液加入到900μl的无菌水后进行梯度稀释，稀释至10^-5-10^-8倍，将稀释液涂布于固体筛选平板上于37℃恒温培养箱中培养；

所述复筛过程采用的固体筛选培养基的配比为：每1000ml水中加入氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.2-0.5g，磷酸二氢钾0.3-0.8g，羽毛粉6.0-20.0g，琼脂粉10.0-20.0g，pH8.0-8.5；

S5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取单菌落进行平板划线；划线培养所得单菌落即为可降解羽毛菌株ABTNL-4；

S6、菌种保藏：从步骤S5划线平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取菌液与已灭菌的50％的甘油以1:1的比例混匀于冻存管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。

2.根据权利要求1所述可降解羽毛菌株的筛选方法，其特征在于，步骤4复筛中稀释过程，稀释到10^-6或10^-7倍。

3.权利要求1所述可降解羽毛菌株的应用方法，其特征在于，以羽毛粉为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述培养基中加入所述可降解羽毛菌株ABTNL-4，37℃培养，即可实现羽毛降解。

4.权利要求3所述可降解羽毛菌株的应用方法，其特征在于，具体操作为，取所述可降解羽毛菌株ABTNL-4置于含有羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，即可实现羽毛降解；

所述可降解羽毛菌株ABTNL-4的菌株浓度为108～109CFU/ml；

所述发酵培养基的配比为每1000ml水中加入硫酸镁0.04-0.3g，氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.2-0.6g，磷酸二氢钾0.3-0.9g，氯化钙0.01-0.1g，羽毛粉6.0g-20.0g，调节pH至8.0～8.5。