CN105733999A - 一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16及其应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ?3?16及其应用，本发明菌株于2016年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO.12086，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ?3?16发酵培养获得的粗酶液可用于降解羊毛和羽毛，在畜禽废弃物降解、生物脱毛方面都有潜在应用价值。

Description

一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16及其应用
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
我国是畜禽养殖大国，每年产生大量畜禽养殖废弃物，包括家禽羽毛、猪、牛、羊等的皮毛和蹄角等，这些固体废弃物长期堆放造成土壤侵蚀、重金属累积、病原微生物大量繁殖、有害气体释放，带来严重的环境问题。作为畜禽养殖大国，我国也一直面临着饲料资源短缺的困境，特别是蛋白质饲料资源自给问题异常突出。目前，羽毛、动物血液、昆虫、蚯蚓等一些非常规蛋白质饲料资源已引起世界各国的广泛关注(张心如等，养殖与饲料，2014,4:21-28)。家禽羽毛中蛋白质含量超过80％，必须氨基酸组成丰富并且富含常量元素、微量元素、维生素和生长因子，被认为是一种有独特价值的优质蛋白饲料(陈常栋，付立新，黑龙江农业科学，2012,1:144-147)。
家禽羽毛、羊毛、动物皮毛、蹄角的主要成分是角蛋白。角蛋白是硬性蛋白，结构致密复杂，很难被普通的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等水解，只能被称作“角蛋白酶”的蛋白酶所水解。因此，角蛋白酶在角蛋白的降解和循环利用中发挥着重要作用。研究表明，利用角蛋白酶作为饲料添加剂，既能使羽毛等废弃物来源的非常规蛋白质饲料得到更有效的降解，水解产物可提高饲料的营养价值和动物的消化吸收效率(Gupta and Ramnani,Appl Microbiol Biotechnol.2006,70:21-33)；此外，角蛋白酶可以降解朊蛋白，因此可用作高级饲料添加剂，消除饲料中的朊蛋白污染，生产安全饲料(Suzukiet al.,J Biosci.2006,102:73-81)。开发针对畜禽养殖废弃物处理的高效角蛋白酶制剂，不但可以实现废弃物的无害化处理，减少环境问题，同时也可以实现废弃物的高值化利用，缓解蛋白质饲料资源短缺的困境。
虽然目前已筛选到大量角蛋白降解菌，但相对来说菌株产酶效率不是很高，原始酶的产量远远不能满足工农业和医药领域的需求，但因此还需要进一步筛选高产菌株，优化发酵条件，提高角蛋白酶的产量和活性；市售酶制剂产品大多售价昂贵，酶活不高，作用位点单一，不能满足羽毛、皮毛、蹄角等废弃物高效转化的需要。为了提高畜禽养殖废弃物的转化效率，急需筛选和鉴定新型的、具有更高活力的角蛋白酶资源。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(B.subtilis)FJ-3-16及其应用，从家禽屠宰场长期堆放羽毛废弃物的土壤中筛选到一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16，能在羽毛作为唯一碳源氮源的培养基中生长并高效降解羽毛。本发明菌株于2016年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCCNO.12086，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Bacillussubtilis。
本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16的发酵培养基的配方(g/L)为：玉米粉20，大豆粉20，麸皮10，KH2PO4 1.0，K2HPO4 3.0，CaCl2 1.0，NaOH调pH 7.5；培养温度为25-35℃；发酵培养的接种量为6％(体积比)，培养时间为72h。
本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16发酵培养后粗酶液的制备方法：用纱布过滤掉发酵后培养基渣滓，11000rpm离心15min，收集发酵液上清即为粗酶液；制备的粗酶液催化角蛋白水解的最适酶活温度为55℃，最适pH为9.0～9.5，制备的粗酶液属于中温碱性蛋白酶。此外，经检测，粗酶液对羊毛和羽毛均有降解作用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明获得的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16，发酵培养后获得粗酶液总酶活达到73820.16U，对羊毛和羽毛均有非常好的降解作用。
附图说明
图1为B.subtilis FJ-3-16在以羽毛为唯一碳源和氮源的FM1培养基中对羽毛的降解图；
图2为进化树分析菌株B.subtilis FJ-3-16的进化位置图；
图3为菌株B.subtilis FJ-3-16的粗酶液在45℃，180rpm条件下，48h对羽毛的酶解图；
图4为菌株B.subtilis FJ-3-16的粗酶液在45℃，180rpm条件下，48h对羊毛的酶解图
图5为菌株B.subtilis FJ-3-16的粗酶液在45℃，180rpm条件下，24h对对羊皮的脱毛作用图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 B.subtilis FJ-3-16的分离纯化
牛奶平板：质量分数为10％的脱脂奶粉116℃灭菌30分钟后与牛肉膏蛋白胨培养基按照1:9比例混合，混匀后倒平板。
羽毛、羊毛、羊皮购买自屠宰场，用肥皂水搓洗，清水冲净、烘干后备用。
FM1羽毛液体培养基(g/L)：NaCl 0.5，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.4，MgCl2·7H2O 0.1，CaCl2 0.06，NaOH调pH 7.5。分装30mL/100mL三角瓶。高压蒸汽灭菌后加入羽毛底物约20mg。
称取1g土壤样品，放入盛10mL灭菌生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，震摇使土样与水充分混合。取1mL土壤悬液加入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液。以此类推制成10-2～10-6几种稀释度的土壤溶液。将上述不同稀释度的溶液样品取100μL涂布牛奶筛选平板(或者LB平板)，每稀释度涂布3个平板。将平板倒置于30℃培养箱中培养24h。
挑选平板上长势良好、水解圈清晰的菌落在牛奶筛选平板上连续划线3次对菌株进行纯化，淘汰传代过程中产圈能力不稳定及生长能力较弱的菌株。通过测量牛奶平板上透明圈直径(the hydrolytic zone diameter)与菌落直径(thecolony diameter)的比值H/C，粗略评估菌株产蛋白酶能力。纯化好的菌株镜检为单菌落后，制成甘油管保存在-80℃。
挑取菌株单克隆接种于LB液体培养基，30℃过夜培养后转接至新鲜LB培养基中至对数生长期(OD600＝～0.8)。将菌液按2％(v/v)接种量接种于羽毛作为唯一碳源和氮源的培养基FM1中，30℃，180rpm震荡培养，定时观察羽毛降解情况。
角蛋白酶酶活测定：
取1mL稀释好的粗酶液加入1mL质量分数为2％的keratin底物(TCI公司，K0044)，在55℃反应1h后加入2mL 0.4M TCA终止反应，11000rpm离心2min后取上清1mL，加入5mL 0.4M Na2CO3和1mL Folin试剂，在40℃显色20min后在660nm比色。在660nm每分钟吸光值升高0.1定义为1个酶活单位(U)。
实验结果：FJ-3-16菌株在牛奶筛选平板上长势良好，培养12h出现水解圈，水解圈清晰，培养24h，H/C比值为3.5，且保持稳定，多次传代后仍能稳定产酶。
在FM1培养基中，能利用羽毛作为唯一的碳源和氮源生长并分泌胞外角蛋白酶，培养基由清澈变浑浊，摇匀后可见均匀菌悬液，结果显示，菌株Bacillussubtilis FJ-3-16在30℃，180rpm条件下48h将一根完整羽毛降解为碎片，如图1所示。取发酵液测胞外角蛋白酶酶活8U/mL。
分离纯化后获得的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16于2016年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO.12086，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2 B.subtilis FJ-3-16菌种鉴定
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉5.0、NaCl 10.0，pH 7.5。如用于转化子筛选，培养基中加入终浓度50μg/mL氨苄青霉素(Amp)。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉5.0、NaCl 10.0，琼脂15.0，pH 7.5。
将FJ-3-16菌株单菌落接种于5mL液体LB培养基中，37℃培养过夜。取1mL培养好的菌液，按照“百泰克细菌基因组提取试剂盒”说明书提取细菌总DNA。
设计16S通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。以细菌基因组为模板，按照TaqDNA聚合酶说明书中的PCR体系及程序，PCR获得DNA片段。PCR体系如表1所示，PCR程序如表2所示：
表1
表2
利用DNA胶回收试剂盒(Omega)回收DNA片段，操作按试剂盒说明书进行。回收的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用Solution I连接酶(大连宝生物)连接至载体pMD19-T easy(大连宝生物)载体上。连接体系10μl：DNA片段4μl，pMD19-T easy载体1μl，Solution I 5μl。连接条件：16℃，8h。连接产物转化E.coli DH5а感受态细胞，转化方法按照《分子克隆实验指南》(第三版)(萨姆布鲁克，拉塞尔著，2002)说明进行。按照pMD19-T easy载体序列设计引物M13F：CAGGAAACAGCTATGAC，M13R：GTTTTCCCAGTCACGA，利用菌落PCR方法筛选转化子，PCR体系及程序同上述。转化子测序在铂尚生物技术(上海)有限公司完成。
测序共测得16S rRNA序列全长1514bp。将序列在NCBI数据库中BLAST比对分析
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝Blast Search&LINK_LOC＝blasthome)，序列一致性较高的均为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，identity为99％。利用Clustalx X1.83软件对序列一致性较高的菌株的16S rRNA进行多重比对，利用MEGA 6.0软件的邻接法(Neighbor-Joining Method)绘制序列进化树，如图2所示。
实施例3 B.subtilis FJ-3-16产酶条件优化
(1)培养基的选择
实验方法：
FM1羽毛液体培养基(g/L)：NaCl 0.5，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.4，MgCl2·7H2O 0.1，CaCl2 0.06，NaOH调pH 7.5。分装30mL/100mL三角瓶。高压蒸汽灭菌后加入羽毛底物约20mg。
FM2羽毛发酵培养基(g/L)：蛋白胨5.0，葡萄糖10，K2HPO4 3.0，KH2PO4 1.0,NaOH调pH 7.5，分装100mL/500mL三角瓶，后加入羽毛5，高压蒸汽灭菌后备用(Tiwary E,Gupta R.Bioresource Technol.2010,101:6103-6110)。
FM3发酵培养基(g/L)：玉米粉20，大豆粉20，麸皮10，KH2PO4 1.0，K2HPO4 3.0，CaCl2 1.0，NaOH调pH 7.5，分装50mL/500mL三角瓶，高压蒸汽灭菌后备用。
挑取B.subtilis FJ-3-16菌株单克隆接种于LB液体培养基，30℃过夜培养后转接至新鲜LB培养基中至对数生长期(OD600＝～0.8)。将菌液按2％接种量分别接种于FM1、FM2、FM3培养基中，30℃，180rpm震荡培养48h，取发酵液上清测胞外角蛋白酶酶活，酶活分别为8U、16.67U和100U。该结果表明：在以羽毛这类不可溶、难降解的底物作为唯一碳源/氮源的培养基中，B.subtilis FJ-3-16也能够生长并分泌角蛋白酶，但产酶效果不好；参考文献中的FM2培养基配方，B.subtilis FJ-3-16产酶量也不高；在FM3发酵培养基中B.subtilis FJ-3-16产酶量是FM2培养基的～6倍，因此选择FM3培养基做进一步条件优化。
(2)培养基pH和培养温度
调FM3培养基初始pH至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，选择培养温度25℃、30℃、35℃，菌株在不同pH培养基、不同培养温度下培养48h后测定胞外角蛋白酶酶活，结果表明培养基pH和培养温度对产酶量影响不大。
(3)接种量和培养时间
按体积分数为2％、4％、6％接种量接种，将对数期种子液接种至FM3发酵培养基中，30℃，180rpm培养，定时取样测定胞外角蛋白酶酶活。结果表明6％接种量条件下培养72h酶活达到最高。
经过初步条件优化，1L B.subtilis FJ-3-16发酵液中角蛋白酶粗酶液的总酶活达到73820.16U。
实施例4 B.subtilis FJ-3-16胞外粗酶液性质及应用
培养结束后，用纱布过滤掉培养基渣滓，11000rpm离心15min，收集的发酵液上清即为粗酶液。
经测定，粗酶液催化角蛋白水解的最适酶活温度55℃，最适pH 9.0～9.5，属于中温碱性蛋白酶。
粗酶液对羊毛、羽毛都有降解作用，羊毛如图3所示，羽毛如图4所示；此外粗酶液对羊皮还具有脱毛作用，如图5所示。这表明B.subtilis FJ-3-16在畜禽废弃物降解、生物脱毛方面都有潜在应用价值。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16，其特征在于，菌株Bacillus subtilis FJ-3-16于2016年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.12086，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16发酵培养基，其特征在于，发酵培养基的配方(g/L)为：玉米粉20，大豆粉20，麸皮10，KH2PO4 1.0，K2HPO4 3.0，CaCl2 1.0，NaOH调pH 7.5。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16在如权利要求2所述发酵培养基中发酵培养温度为25-35℃。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16在如权利要求2所述发酵培养基中发酵培养的按体积比为6％的接种量接种，培养时间为72h。
5.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16发酵培养获得的粗酶液。
6.如权利要求5所述粗酶液的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
用纱布过滤掉发酵后培养基渣滓，11000rpm离心15min，收集发酵液上清即为粗酶液。
7.如权利要求6所述制备方法获得的粗酶液在催化角蛋白水解时，最适酶活温度为55℃，最适pH为9.0～9.5。
8.如权利要求6所述制备方法获得的粗酶液属于中温碱性蛋白酶。
9.如权利要求6所述制备方法获得的粗酶液在降解羊毛和羽毛方面的应用。
10.如权利要求6所述制备方法获得的粗酶液在畜禽废弃物降解、生物脱毛方面的应用。
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