CN110591943B - 一株产复合酶枯草芽孢杆菌,组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌，含该菌的益生菌剂组合物以及枯草芽孢杆菌和其益生菌剂组合物在发酵棕榈粕中的应用。本发明还提供制备发酵饲料益生菌剂组合物的方法。本发明还提供了通过紫外线诱变育种筛选获得高产β‑甘露聚糖酶、蛋白酶和β‑葡聚糖酶枯草芽孢杆菌突变株的方法。本发明提供的枯草芽孢杆菌不仅产生的β‑甘露聚糖酶、β‑葡聚糖酶和蛋白酶活性高，同时对大肠杆菌具有较强的抑制作用。采用含该菌株的益生菌剂及其组合物发酵棕榈粕，可显著提高发酵样品的粗蛋白、小肽和氨基酸含量高，同时产生较高的β‑甘露聚糖酶、β‑葡聚糖酶和蛋白酶活性，并可部分替代豆粕用于饲养动物。

Description

一株产复合酶枯草芽孢杆菌,组合物及其应用
技术领域：
本发明属于生物饲料领域，具体地说涉及一种枯草芽孢杆菌，以及该枯草芽孢杆菌的产复合酶性能，和其在发酵棕榈粕等饲料中的应用。
背景技术：
棕榈粕(PKE/PKC)是棕榈仁脱壳榨油的过程中提取的副产物，可通过有机溶剂法或机械法获得(Lga O,等.Applied Biochemistry and Biotechnology,2004,118(1-3):73-79)。PKC的含油量、粗蛋白及粗纤维含量较高，平均约10％和14.4％，可为饲用提供充足的代谢能量来源；PKC还含有丰富的矿物质元素如钙、磷、铁、锌等，以及B、E族维生素(Amustaff A B,等.ASEAN food journal,1991,6(3):102-103)；更多研究表明，PKC富含亚油酸，以及甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸等氨基酸(Siew W L等.PorimTechnology,1989,14:2-3)。同时，其具有含水量低，无黄曲霉毒素污染等特点，适用于水产、禽类、反刍类等各种畜牧养殖，常温、通风和干燥条件下可存放7～10个月(李玉鹏,等.饲料研究,2018,43(02):15-18)。然而，PKC的纤维含量相对较高(纤维素：11.6％；半纤维素类：57.8％的甘露聚糖和3.7％的木聚糖)，其中最主要的抗营养因子——甘露聚糖，与水接触呈凝胶状，增加了食糜的粘度，阻碍了动物对营养物质的消化和吸收(Suraini A A,etal.Asian Journal of Scientific Research,2008,1(4):385-393.)。已有研究表明，通过β-甘露聚糖酶处理PKC，可降低其非淀粉多糖含量，提高消化吸收率；酶解产生大量功能性低聚寡糖，繁殖增加益生菌，产生维生素，提高动物免疫力等。有效提高了PKC的营养价值和能量利用率，提高经济效益(Sundu B,Kumar A,et al.World’s Poultry ScienceJournal,2006,62(6):316-325.)。
麸皮是一种广泛使用的常规饲料原料。小麦麸中的阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖和纤维素等抗营养成分大大降低了饲料消化利用率，严重时甚至引起畜禽生产性能、胴体质量下降。因此，在含有小麦麸的饲料中常通过添加木聚糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶来提高饲料利用率。(李玉林，等。中国畜牧杂志，2012，48(8))。
在动物饲料中添加微生物酶制剂，其可以补充动物内源酶的缺乏，并降解特定的饲料成分，在某种程度上调节了原始的消化系统和动物的消化能力，提高饲料利用率，节省饲料资源，无毒副作用(冯定远.饲料工业,2011,566(17):1-5.)，无药物残留和耐药性等不良影响，绿色环保。饲用酶制剂包括单一酶制剂和复合酶制剂两类，其中复合饲用酶制剂的市场应用前景更广阔，主要分为以下两种：(1)通过混合几种单一酶制备的饲料酶制剂；(2)由能够产生多种酶系统的单一微生物制成的饲料酶制剂(郭珺,等.饲料研究,2011,64(02):30-32.)，后者因不用考虑多菌种的协同和复配作用而具有更好的发展前景。
蒋佳璇等从其新鲜粪便中分离耐酸、耐胆盐的芽孢杆菌，进一步筛选能同时产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的菌株，最后进行生化鉴定和基于16S rDNA序列的分子鉴定为3种芽孢杆菌(动物营养学报2016，28(11):3542-3548)。王朋朋等从牛瘤胃液中筛选出一株性状优良、产蛋白酶和淀粉酶活力较高的菌株，经初步鉴定为枯草芽孢杆菌。结果表明：该菌株产蛋白酶和淀粉酶的最适时间分别在培养的48h和96h，蛋白酶和淀粉酶的最高酶活力分别为221.57U/mL和54.06U/mL(中国畜牧杂志，2009，45(21)：48-51)。
通过固态发酵法使用工业废物(如PKC)生产微生物菌体蛋白饲料，可产生各种功能性物质，有效抑制动物肠道内致病菌的生长繁殖，吸附霉菌等有害微生物，增强动物免疫力。通过β-甘露聚糖酶处理棕榈粕，可以降低非淀粉多糖的含量，提高其能量利用率，产生大量功能性低聚寡糖，提高动物的免疫功能；提高消化吸收率，增加益生菌，产生维生素等，具有很强的发酵可塑性。(向冰冰,等.农产品加工,2009,172(5)2:85-87)。研究筛选高产复合酶益生芽孢杆菌，并利用其发酵降解棕榈粕，具有提高适口性、降低生产成本等优点，具有极大的发展潜力。周凯等报道了利用产甘露聚糖酶枯草芽孢杆菌等多菌种发酵白酒酒糟制备多酶益生菌饲料发酵工艺，但制备的发酵料酶活不高。多酶益生菌饲料中甘露聚糖酶酶活(11.62±0.26)U/g、蛋白酶酶活(15.27±0.16)U/g)(饲料工业，2016，37(12)：42-46)。赵华等利用黑曲霉和枯草芽孢杆菌等复合益生菌固态发酵改善甘薯渣营养价值(动物营养学报2015，27(4):1191-1198)。刘桂香等采用米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌等多菌种联合发酵以棕榈粕、豆粕、玉米、麸皮、次粉等调配的粗饲料。最终获得的发酵饲料富含蛋白质、淀粉酶、蛋白酶以及益生菌的生物活性饲料,产品呈愉悦酸味和芳香味,颜色为浅棕色。终产品蛋白质质量分数为32％,比原料提高了59％；淀粉酶活103U/g,蛋白酶活123U/g(粮食与饲料工业，2016，3：43-47)。曾亚桐等报道了枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母混合发酵豆粕能够大幅度提高降解抗营养因子的速率(天津科技，2018，45(6)：54-57)。
单一酶制剂仅对单一种类的底物有催化功能，不能满足动物的营养需要，目前，复合酶制剂在饲料中的应用研究越来越多，多种酶按比例配制可实现组合效应，其在生产实践中的应用效果优于单一酶制剂。在玉米－豆粕型日粮中添加复合酶制剂，可促进饲料养分的消化，显著提高仔猪的日增质量，提高饲料转化效率，减少腹泻的发生(刘利，等.家畜生态学报，2015，36(3))
中国专利(201210010890.5)公布了一种一菌多酶菌株及其筛选方法和应用，但未见对葡聚糖酶活的报道。中国专利(201210531670.7)公布了一种发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。中国专利(201711262757.8)公布了棕榈生物饲料添加剂制备方法及含该添加剂的生物饲料。中国专利(201610795033.9)公布了一种棕榈粕发酵饲料及其制备方法。中国专利(201310738229.0)公布了一种含中性蛋白酶的小麦日粮酶及其制备方法。中国专利(201310633814.4)公布了一种仔猪复合益生菌剂产品及方法。
生产上需要能够产多种酶活较高的适合于棕榈怕等饲料原料发酵的益生菌株。目前已报道的枯草芽孢杆菌菌株存在的不足之处是产复合酶的菌株中酶活普遍不高，能够产β-葡聚糖酶的菌株很少。汪梦昀等(饲料工业，2019:40(5)：23-33)报道了一株产耐碱性β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌WMYB-2的分离鉴定及发酵条件优化。该菌株在含魔芋胶的摇瓶培养基中发酵36h，β-甘露聚糖酶活力达到361.02U/mL，并具有较高的蛋白酶活力，但该菌株存在的不足是产β-葡聚糖酶活性不高。目前尚未见到同时具备产β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶活性均很高的野生型枯草芽孢杆菌或其突变株的报道。也未见具有发酵棕榈粕产生较高的小肽和氨基酸含量的益生枯草芽孢杆菌的报道。
发明技术内容：
本发明的一个目的是提供一种具有产复合酶(β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶及蛋白酶)活性、可高效降解棕榈粕，并可抑制大肠杆菌生长的枯草芽孢杆菌菌株。
本发明的另一个目的是提供枯草芽孢杆菌发酵棕榈粕制备含复合酶活性的微生物饲料方法。
本发明的再一个目的是提供制备枯草芽孢杆菌固体菌剂的方法。
本发明的再一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌及菌剂在发酵棕榈粕生产动物饲料中的应用。
本发明公开了一株新的枯草芽孢杆菌，由经土壤分离枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WMYB-2诱变产生，其特征在于,该菌株为枯草芽孢杆菌wmyb212株(Bacillussubtilis wmyb212),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019650。保藏日期是2019年8月19日。中国典型培养物保藏中心位于湖北省武汉市武昌区武汉大学校内，电话：027-68752319，EMAIL：cctcc@whu.edu.cn.在本发明公开后，第三方研究者可依法从保藏机构获取菌种再现本发明的技术内容。
枯草芽孢杆菌wmyb212株从海南土壤分离并经紫外线诱变筛选获得。该菌株有如下特征：
枯草芽孢杆菌wmyb212株形态特征是：菌落呈乳白色，不透明，表面光滑湿润，中间和边缘厚薄不一、略微凸起，边缘粗糙呈锯齿状，易挑取，菌落直径大小约4.04mm，形状较规则，呈圆形，产芽孢。
枯草芽孢杆菌wmyb212株生化特征是：可利用葡萄糖，蔗糖、甘露醇、D-木糖、淀粉。能在含7％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长。
枯草芽孢杆菌wmyb212株生长特征是：牛肉膏蛋白胨平板上划线接种，分别在37℃至45℃下培养均生长良好；在pH 5.0的酸性环境中生长良好。
该菌株在液体培养基中发酵产复合酶的特征是：枯草芽孢杆菌wmyb212在魔芋微粉培养基中发酵产β-甘露聚糖酶活达420.25(U/mL),在麸皮培养基中发酵产β-葡聚糖酶活达27.70(U/mL),在蛋白胨培养基中发酵产中性蛋白酶活达72.08(U/mL)。分别比对照菌株CICC10071的酶活高29.6倍、5.1倍和2.6倍，表明该菌株具有高产复合酶的能力。
该菌株固态发酵棕榈粕的特征是：经wmyb212菌株发酵后的棕榈粕芽孢杆菌活菌数达18.6×108cfu/g；β-甘露聚糖酶活、β-葡聚糖酶活和蛋白酶活性分别达229.82U/g、25.68U/g和85.96U/g；粗蛋白和小肽含量分别为20.11％和26.45％，分别比发酵前提高了16.2％和453.3％；总氨基酸含量较发酵前提高了14.6％，其中必须氨基酸赖氨酸和蛋氨酸含量分别提高了37.8％和100％，极大提升了棕榈粕的营养价值。
枯草芽孢杆菌16S rDNA基因序列分析显示：枯草芽孢杆菌WMYB212与Bacillussubtilis CICC10071的同源性超过99％。
本发明还公开了一种含枯草芽孢杆菌WMYB212的菌剂，该菌剂组合物主要成份是枯草芽孢杆菌wmyb212株及其胞外产物和发酵基质。
本发明的还公开了枯草芽孢杆菌wmyb212及其微生物菌剂在发酵棕榈粕上的应用。
本发明的还公开了枯草芽孢杆菌wmyb212及其微生物菌剂在发酵生产畜禽动物饲料中的应用。
优先地，本发明还公开了一种含枯草芽孢杆菌wmyb212株的益生菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份(按活菌数比计)：
枯草芽孢杆菌 90％
产朊假丝酵母 10％
其中枯草芽孢杆菌为CCTCC NO:M2019650，
产朊假丝酵母为CCTCC NO:2015718。
产朊假丝酵母为CCTCC NO:2015718为一株专利保藏菌株，菌株于2015年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心。其菌株特征在专利号为201510952295.7的中国专利中已公开，第三方可依法从CCTCC取得，已处于公开状态。在本发明中采用的参比菌株均为普通微生物菌种，其中枯草芽孢杆菌CICC10071登载于中国工业微生物菌种保藏管理中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。
本发明公开的益生菌剂为固态或液态。优先的，本发明公开的wmyb212芽孢杆菌菌剂为固态。
本发明还公开了制备固态菌剂组合物的方法，包括如下步骤：
(1)wmyb212菌种活化：接种环挑取一环wmyb212菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养18-22h；
(2)种子液制备：挑取一环经活化的wmyb212菌株接入装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、170r/min培养16h备用；
(3)固体发酵培养基配制：按麸皮80％，米糠10％，玉米粉5％，豆粕5％，料:水＝1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料方盒中，121℃灭菌30min，冷却备用；
(4)固体菌剂培养：按10％接种量接入预先培养好的wmyb212种子液至固体发酵培养基中，混匀后置37℃恒温培养箱中培养48h，每12h翻拌一次；
(5)干燥及粉碎：将上述发酵完毕的wmyb212固体培养物置于50℃烘箱中烘至含水率低于12％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂，装入密封塑料袋，置于干燥、阴凉处或4℃冰箱保藏；其中，菌剂样品中wmyb212芽孢杆菌的活菌数达100×108cfu/g。
(6)混合与包装：将枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2019650与产朊假丝酵母CCTCC NO:M2015718按活菌数比＝10:1比例混合装塑料袋后封口制成含wmyb212益生菌的组合物。
本发明的优点：
1、枯草芽孢杆菌wmyb212菌株具有一定的耐酸性和耐温性，能在pH 5.0的酸性环境以及温度45℃的环境下生长良好，比参比菌株耐受性好。
2、枯草芽孢杆菌wmyb212菌株产复合酶(β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶)活性高，在魔芋微粉培养基中发酵产β-甘露聚糖酶活达420.25(U/mL)，比参比菌株CICC10071酶活高29.6倍；在麸皮培养基中发酵产β-葡聚糖酶活达27.70(U/mL)，比参比菌株酶活高5.1倍；在蛋白胨培养基中发酵产中性蛋白酶活达72.08(U/mL)，比参比菌株酶活高2.6倍。
3、该菌株对大肠杆菌具有较强抑制作用，具有益生菌功能。
4、经wmyb212菌株固态发酵的棕榈粕，烘干后制备的棕榈粕发酵样品，粗蛋白、小肽、氨基酸含量高；并具有复合酶(β-甘露聚糖酶、大麦葡聚糖酶和蛋白酶)活性、含活性芽孢；同时改善苦味物质，具有较好的适口性和动物饲养效果。芽孢杆菌活菌数达18.6×108cfu/g；β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶活力达228.82U/g、25.68U/g和85.96U/g；粗蛋白和小肽含量达20.11％和26.45％，比棕榈粕原料分别提高了提高了16.2％和453.3％；总氨基酸含量比棕榈粕原料提高了14.6％，其中必须氨基酸赖氨酸和蛋氨酸含量比棕榈粕原料分别提高了40.8％和108.3％。极大提升了棕榈粕的营养价值。
5、含枯草芽孢杆菌wmyb212株的组合菌剂用于发酵棕榈时，发酵棕榈粕的粗蛋白含量和总氨基酸含量比用单一菌剂发酵时有明显提高。即枯草芽孢杆菌wmyb212株具有较强的产β-甘露聚糖酶等复合酶的能力，其组合菌剂不仅具有较强的产β-甘露聚糖酶等复合酶能力，还具有较强的提高发酵棕榈粕粗蛋白和总氨基酸含量的能力。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌wmyb212菌株的系统发育树图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1枯草芽孢杆菌高产甘露聚糖酶、葡聚糖酶突变株wmyb212的选育及鉴定
1.1枯草芽孢杆菌高产蛋白酶和β-甘露聚糖酶突变株wmyb21的选育
以枯草芽孢杆菌WMYB-2为出发菌株，将一定剂量下紫外线照射后的WMYB-2菌悬液经过适当稀释后，先涂布到含30g/L脱脂牛奶-牛肉膏蛋白胨选择培养基平板上，37℃培养24h观察透明圈显现情况，测量并记录H/C值。选取其中产生透明圈H/C值最大的20个菌株划线以获得单菌落，编号后再点种到含5g/L魔芋胶选择培养基固体平板上，37℃培养24h，用1g/L的刚果红染液进行染色10min，倒去刚果红染液，然后加入浓度为l mol/L的NaCl溶液洗涤3次,观察和测量水解圈直径H(cm)和菌落直径C(cm)。挑选出10株H/C值比出发菌株大的突变株，编号为1号-10号菌株，用于接种含0.7％魔芋胶的液体培养基进行复筛，每个菌株3个重复。经培养后测定甘露聚糖酶活性。共获得3株中性蛋白酶和β-甘露聚糖酶均比出发菌株有显著提高的突变株，其中编号为1号的突变株的β-甘露聚糖酶活高达417.81(U/mL)，比出发菌株的β-甘露聚糖酶活性提高了17.4％，中性蛋白酶活提高了21.2％，而β-葡聚糖酶活性与出发菌株相比没有明显差异，将该突变株命名为WMYB21(见表1)。
表1 3株突变菌株的酶活测定结果
Figure GDA0003346907700000081
1.2枯草芽孢杆菌高产β-葡聚糖酶突变株wmyb212的选育
为了获得同时具备高产β-甘露聚糖酶和高产β-葡聚糖酶的优良枯草芽孢杆菌菌株，本发明对获得的高产β-甘露聚糖酶率突变株WMYB21进行第二次紫外线诱变育种，从中筛选出高产β-葡聚糖酶的突变株。具体方法为：以枯草芽孢杆菌WMYB21为出发菌株，将一定剂量下紫外线照射后的WMYB21菌悬液经过适当稀释后涂布到含5.0g/Lβ-葡聚糖的筛选平板上，37℃培养48h，长出单菌落后用刚果红染液进行染色，挑选形成透明圈的菌落，测定透明圈直径与菌落直径之比，挑取直径比值较大的单菌落，经扩大培养和活化后，分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃，170rpm条件下振荡培养后，按5％接种量依次转接到蛋白酶和β-甘露聚糖酶和含10g/L的β-葡聚糖液体培养基进行复筛，每个菌株3个重复，三角瓶，接种量为10％(v/v)，摇床200r/min，37℃培养60h。取发酵液于10000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液，按照DNS法测定β-甘露聚糖酶活性、福林-酚试剂法测定蛋白酶活性。经酶活测，共获得5株β-葡聚糖酶比出发菌株有显著提高的突变株，其中编号为2号的突变株的β-葡聚糖酶活高达27.70(U/mL)，比出发菌株的β-甘露聚糖酶活性提高了17.4％，而其中性蛋白酶和β-葡聚糖酶活性与出发菌株WMYB21相比没有明显差异，将该突变株命名为wmyb212(见表2)。
表2 5株突变菌株的酶活测定结果
Figure GDA0003346907700000091
本发明人将通过两次紫外诱变选育的一株新的枯草芽孢杆菌wmyb212株(Bacillus subtilis wmyb212)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019650。保藏日期是2019年8月19日。中国典型培养物保藏中心位于湖北省武汉市武昌区武汉大学校内，电话：027-68752319，EMAIL：cctcc@whu.edu.cn.
1.3枯草芽孢杆菌WMYB212株的鉴定：
通过形态特征观察、生理生化测定及16S rDNA基因序列分析结果对wmyb212进行鉴定。在鉴定中，本实验选择枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CICC10071菌株作为对照菌株。枯草芽孢杆菌为常用普通微生物菌种，登载于中国工业菌种保藏中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。
1.2.1枯草芽孢杆菌wmyb212株形态特征是：菌落呈乳白色，不透明，表面光滑湿润，中间和边缘厚薄不一、略微凸起，边缘粗糙呈锯齿状，易挑取，菌落直径大小约4.04mm，形状较规则，呈圆形，产芽孢。
1.2.2通过16S rDNA序列分析进行系统发育地位鉴定：
将分离纯化得到的细菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃，170rpm的条件下振荡培养16h，再利用细菌基因组试剂盒提取基因组DNA。
采取试剂盒抽提得到细菌DNA后，通过PCR扩增16S rDNA，配置50μL的反应体系，细菌的16S rDNA引物为27F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。
PCR循环程序为：94℃预变性5min，94℃50s，54℃50s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增得到的细菌PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序，测序的长度在1400bp左右，测序结果采用BioaEdit软件序列图谱人工校对拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列数据库中进行同源序列搜索比对。根据同源序列搜索结果，选取测试菌株关系较近的模式菌株的16S rDNA序列区序列，用MEGA软件采取邻接法构建系统发育树。
实验得到1042bp的基因序列，在Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，wmyb212与Bacillus subtilis CICC10071的同源性超过99％，符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株见差异不超过1％的标准。图1是根据16S rDNA序列构建的系统发育树。
1.2.3：枯草芽孢杆菌WMYB212株的生理生化实验测定结果：见表3。根据16S rDNA序列分析结果和生理生化实验测定结果，参照文献报道(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社,2001,267-295.),可判断S10菌为枯草芽孢杆菌。
表3枯草芽孢杆菌wmyb212株的生理生化实验结果
测定项目 结果 测定项目 结果
接触酶 + 葡萄糖 +
厌氧生长 － 木糖 +
甲基红试验 + 甘露醇 +
硝酸盐还原 + 蔗糖 +
45℃生长 + 甘油 －
pH 5.0生长 + 分解酪素 +
7％NaCl生长 + 淀粉水解 +
实例2枯草芽孢杆菌WMYB212株生长耐受性及抑菌能力比较
2.1枯草芽孢杆菌WMYB212株生长耐受性比较
将菌株CICC10071和枯草芽孢杆菌wmyb212接种子液，在37℃、170r/min培养16h，随后按接种量5％转接至初始pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃、170r/min振荡培养24h。测定各样品菌株生物量OD600。将菌株CICC10071和枯草芽孢杆菌wmyb212接种子液，在37℃、170r/min培养16h，按照接种量5％转接至牛肉膏蛋白胨液体培养基，分别置于37、40、45、50、55℃，170r/min振荡培养24h。测定各样品菌株生物量OD600，结果见表4。
表4不同芽孢杆菌菌株生长耐受性比较
Figure GDA0003346907700000111
2.2枯草芽孢杆菌WMYB212抑制大肠杆菌能力比较
用牛津杯法对芽孢杆菌的抑菌能力进行测定。将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌wmyb212接种子液，在37℃、170r/min培养16h，吸取0.1mL大肠杆菌无菌滤液均匀涂布于LB平板上，用无菌镊子取出灭菌牛津杯(外径d＝8.00mm)，并轻压以小心地固定在平板表面。每个牛津杯加入0.15mL芽孢杆菌无菌滤液。然后将培养皿置于30℃恒温培养24h，测抑菌圈直径(包括牛津杯直径)。wmyb212与参比菌株Bacillus subtilis CICC10071对大肠杆菌抑菌圈直径值(D-d)结果见表5。由表5可知，枯草芽孢杆菌WMYB212抑制大肠杆菌的能力比参比菌株明显强。
表5芽孢杆菌对大肠杆菌的抑菌圈直径(D-d)值
Figure GDA0003346907700000112
实施例3枯草芽孢杆菌wmyb212株产酶能力比较分析
3.1枯草芽孢杆菌wmyb212菌株的液态发酵样品制备方法
(1)wmyb212菌种活化：用接种环挑取一环wmyb212菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，在恒温培养箱中37℃培养20h。
(2)种子液的制备：挑取一环经活化的wmyb212菌株接入装有100mL的牛肉膏蛋白胨三角瓶液体培养基中，37℃、170r/min摇床培养24h备用。
(3)液态发酵培养基制备：
a.β-甘露聚糖酶液态发酵培养基：魔芋微粉10.0g/L，大豆蛋白胨10.0g/L、CaCl20.6g/L、K2HPO4 0.8g/L、MgSO4·7H2O 1.0g/L，pH 7.5，装液量40mL/250mL三角瓶，121℃灭菌20min后冷却待用。
b.大麦葡聚糖酶液态发酵培养基：麸皮4.0g/100mL、大豆蛋白胨10.0g/L、KH2PO41.5g/L、CaCl2 0.3g/L、MgSO4·7H2O 1.0g/L，pH 7.0，装液量100mL/250mL三角瓶，121℃灭菌20min后冷却待用。
c.蛋白酶液态发酵培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，蔗糖10.0g/L，磷酸氢二钠4.0g/L，硫酸镁0.2g/L，pH 7.2，装液量100mL/250mL三角瓶，121℃灭菌20min后冷却待用。
(4)液态发酵方法及发酵效果测定：按5％接种量接种WMYB-2种子液于a、b、c三种液体发酵培养基中，37℃、170r/min分别发酵36、48、48h。
(5)检测样品制备：发酵液10000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。
3.2 3株枯草芽孢杆菌液态发酵的产酶能力比较
将wmyb212与参比菌株CICC10071分别接种于魔芋微粉培养基(a)、麸皮培养基(b)、蛋白胨培养基(c)三种发酵培养基中，37℃、170rpm振荡培养，取样测定各菌株发酵液的酶活性结果见表6。由表可知，枯草芽孢杆菌WMYB-2的产复合酶能力明显强于参比菌株CICC10071。
表6 3株芽孢杆菌液态发酵产酶的活力测定结果
Figure GDA0003346907700000121
实施例4 WMYB212芽孢杆菌固体菌剂及其组合物的制备方法
按照如下步骤进行：
(1)wmyb212菌种活化：接种环挑取一环wmyb212菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养18-22h；
(2)种子液制备：挑取一环经活化的wmyb212菌株接入装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、170r/min培养16h备用；
(3)固体发酵培养基配制：按麸皮80％，米糠10％，玉米粉5％，豆粕5％，料:水＝1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料方盒中，121℃灭菌30min，冷却备用；
(4)固体菌剂培养：按10％接种量接入预先培养好的wmyb212种子液至固体发酵培养基中，混匀后置37℃恒温培养箱中培养48h，每12h翻拌一次；
(5)干燥及粉碎：将上述发酵完毕的wmyb212固体培养物置于50℃烘箱中烘至含水率低于12％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成wmyb212固体粉末状菌剂，装入密封塑料袋，置于干燥、阴凉处或4℃冰箱保藏；采用稀释平板测数法检测样品中WMYB212芽孢杆菌的活菌数达100×108cfu/g。
(6)混合与包装：将制备好的wmyb212益生菌剂分别按一定比例添加产朊假丝酵母后包装，即得到含wmyb212益生菌的组合菌剂；
(7)芽孢杆菌制剂组合物测定结果：采用稀释平板测定实验室制备的益生菌剂组合物中枯草芽孢杆菌活菌数达到50亿/g左右。枯草芽孢杆菌wmyb212：CCTCC NO:M2015718活菌数比为10:1。
实施例5枯草芽孢杆菌wmyb212单一菌剂及其组合物在发酵棕榈粕中的应用
5.1枯草芽孢杆菌发酵棕榈粕样品的制备方法
(1)棕榈粕固态发酵培养基制备：90％的棕榈粕粉和10％的麸皮(占干基)，加入适量自来水，按料水比1:0.8调节起始含水量至47％，调节起始pH为7.0，充分混匀。
(2)固态发酵方法及发酵效果测定：按0.25％的接种量接入的枯草芽孢杆菌wmyb212固体菌剂，充分翻拌至混合均匀，于30℃恒温好氧发酵2d，60℃烘干储存，取样测定结果。2株枯草芽孢杆菌参比菌株固体菌剂的制备方法与WMYB212固体菌剂制备方法相同，固体发酵棕榈粕的接种量与WMYB212固体菌相同。
5.2发酵棕榈粕样品检测方法
(1)活菌数的测定
采用稀释平板涂布法，以牛肉膏蛋白胨培养基测定细菌活菌数。
(2)酶活性的测定
取5.0g未烘干样品到50mL蒸馏水，加入玻璃珠充分振荡1h，1000r/min离心10min，取上清液待测。
(3)粗蛋白含量的测定
使用凯氏定氮法，参见GB/T 6432-1994“饲料中粗蛋白测定方法”。
(4)小肽含量(占干基)的测定
①酸溶蛋白含量的测定：
取3.6g烘干样品至30mL 15％TCA溶液中，充分振荡30min，4000r/min离心10min，移液管移取10mL上清液于消化管中，测定方法同粗蛋白含量。
小肽(占干基％)的计算公式：
Figure GDA0003346907700000141
式中：V——样品滴定消耗盐酸体积(mL)；
V0——空白滴定消耗盐酸体积(mL)；
CHCl——标准盐酸浓度(mol/L)；
m——取样质量(g)；
6.25×0.014——蛋白质转换系数。
②小肽(占蛋白质％)的计算公式：
Figure GDA0003346907700000142
(5)氨基酸含量的测定：送至武汉轻工大学分析测试中心，通过HPLC法检测发酵样品的氨基酸组成和含量。
5.3不同枯草芽孢杆菌菌株发酵棕榈粕样品检测结果
不同菌株发酵棕榈粕样品各项指标检测结果见表7。发酵后芽孢杆菌wmyb212的活菌数达19.2×108cfu/g；β-甘露聚糖酶活、β-葡聚糖酶活和蛋白酶活性分别达229.82U/g、25.68U/g和85.96U/g；粗蛋白和小肽含量为20.11％和26.45％，比发酵前提高了16.2％和453.3％。
表7不同枯草芽孢杆菌棕榈粕固态发酵样品指标检测结果比较
Figure GDA0003346907700000151
5.4 wmyb212菌株与产朊假丝酵母按不同比例混合发酵棕榈粕效果比较
将枯草芽孢杆菌wmyb212和产朊假丝酵母CCTCC NO：M 2015718活化后，分别以活菌数比例为1：0、1：1、1：10和10：1进行混合接种固态发酵棕榈粕。由表8可以看出，随着混合菌种中酵母菌的接种量不断增大，发酵棕榈粕的粗蛋白含量不断升高，pH明显下降，但β-甘露聚糖酶和蛋白酶活性有明显下降。当枯草芽孢杆菌wmyb212和产朊假丝酵母CCTCC NO:M2015718接种比例为10:1时，发酵棕榈粕的粗蛋白含量达22.01％，比接种单一的枯草芽孢杆菌WMYB212发酵样的粗蛋白明显提高，而β-甘露聚糖酶和蛋白酶活性仍无明显降低，而发酵料的pH值由7.0降至6.0，显著增加了发酵棕榈粕的酸度，这有利于提高饲料的适口性和储存期。
表8 WMYB212与产朊假丝酵母菌不同混合比例对棕榈粕发酵的影响
WMYB212：CCTCC 2015718 1:0 1：1 1:10 10:1
粗蛋白含量(％) 20.11 21.45 22.03 22.01
β-甘露聚糖酶(U/g) 229.82 165.90 102.75 228.68
蛋白酶(U/g) 85.96 67.98 54.36 84.73
pH 7.0 5.5 5.0 6.0
由wmyb212单一菌剂和组合菌剂接种的固态发酵棕榈粕样品的氨基酸组成及含量检测结果见表9，其中组合菌剂发酵样品的总氨基酸含量由11.86％提高到13.59％，提高了14.6％，其中对饲料营养价值具有重要提升作用的必须氨基酸赖氨酸由0.49％提高到0.69％，蛋氨酸由0.12％提高到0.25％，分别提高了40.8％和108.3％。
表9 WMYB212单一菌剂和组合菌剂固态发酵棕榈粕样品氨基酸检测结果
Figure GDA0003346907700000161
5.4发酵棕榈饲养仔猪试验结果及分析
为了测试枯草芽孢杆菌wmyb212组合菌剂发酵的棕榈粕的饲养效果，选择50头健康的仔猪，随机分为5组，每组10头重复。五组分别饲喂豆粕、25％棕榈粕替代豆粕、50％棕榈粕替代豆粕、25％发酵棕榈粕替代豆粕、50％发酵棕榈粕替代豆粕。各组试验猪自由采食和饮水。每日上午7:00加料和水，试验期为30天。试验过程中无猪死亡。试验结果见表10。由表10可见,棕榈粕发酵与否对仔猪平均日增重和料肉比有显著影响(p≤0.005),豆粕的替换量(25％与50％)极显著影响采食量。用发酵棕榈粕替代豆粕的25％对仔猪的生产性能无显著影响。表明采用wmyb212组合菌剂发酵的棕榈粕具有较好的替代豆粕的功能。
表10两因素(棕榈粕与发酵棕榈粕)两水平(替代豆粕25％与50％)试验仔猪生产性能比较
Figure GDA0003346907700000171

Claims (7)

1.一株产β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶的复合酶，并能发酵降解固态棕榈粕的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)wmyb212，其特征在于,该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019650。
2.一种含权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌wmyb212的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为枯草芽孢杆菌wmyb212菌体及其代谢产物。
3.一种含权利要求1中所述枯草芽孢杆菌wmyb212的益生菌剂组合物。
4.根据权利要求3中所述的益生菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份，枯草芽孢杆菌，其活菌数比是90％，产朊假丝酵母，其活菌数比是10％，其中枯草芽孢杆菌是保藏号为CCTCC NO:M2019650的菌株，产朊假丝酵母是保藏号为CCTCC NO:M2015718的菌株。
5.根据权利要求3中所述的益生菌剂组合物，其特征在于所述的益生菌剂组合物为固态菌剂。
6.制备权利要求4中所述的益生菌剂组合物的方法，包括如下步骤：
(1)wmyb212菌种活化：接种环挑取一环wmyb212菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养18-22h；
(2)种子液制备：挑取一环经活化的wmyb212菌株接入装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、170r/min培养16h备用；
(3)固体发酵培养基配制：按麸皮80％，米糠10％，玉米粉5％，豆粕5％，料:水＝1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料方盒中，121℃灭菌30min，冷却备用；
(4)固体菌剂培养：按10％接种量接入预先培养好的wmyb212种子液至固体发酵培养基中，混匀后置37℃恒温培养箱中培养48h，每12h翻拌一次；
(5)干燥及粉碎：将发酵完毕的wmyb212固体培养物置于50℃烘箱中烘至含水率低于12％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂，装入密封塑料袋，置于干燥、阴凉处或4℃冰箱保藏，
其中，菌剂样品中wmyb212芽孢杆菌的活菌数达100×108cfu/g；
(6)混合与包装：将保藏号为CCTCC NO:M2019650的枯草芽孢杆菌与保藏号为CCTCCNO:M2015718的产朊假丝酵母按活菌数比＝10:1比例混合后于塑料袋中封口制成含wmyb212益生菌的组合物。
7.权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌wmyb212在发酵降解棕榈粕中的应用。
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