CN105087444A - 高效降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高效降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌及其应用。该解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)ASAGF142，其保藏编号为CGMCC？No.9464。本发明还提供了含有该保藏菌株的菌剂及其制备方法。此外，本发明还提供了所述菌株或菌剂在降解玉米赤霉烯酮中的应用。本发明所述菌株能够在短时间内将20μg/ml玉米赤霉烯酮完全降解，降解率100％。

Description

高效降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，其化学名为6-(10-羟基-6-氧基碳烯基)-β-雷锁酸-μ-内酯，是一种具有二羟基苯甲酸内酯结构的雌激素类真菌毒素，通常由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、克地镰刀菌(Fusariumcrookwellense)等多种镰刀霉菌产生并释放到环境中。ZEN是世界上污染范围最广泛的一种真菌毒素，在欧洲、南美洲、北美洲、亚洲、非洲以及大洋洲等世界各地的谷物以及农副产品中都能检测到ZEN的存在。ZEN是由Baldwin等最先从发霉玉米中分离得到，现已知其存在11种以上的衍生物。ZEN在玉米中可以11.8mg/kg的极高浓度出现，在燕麦、小麦、大麦和高粱中也被广泛检出。ZEN一般通过污染的植物饲料等进入食物链，从而奶制品、牛肉和羊肉等中也可能以较高浓度出现，某些食物中ZEN的污染量甚至高达289mg/kg。长期以来，有关ZEN污染危害的报道很多，其具有类雌激素活性，能引起种猪等家畜或家禽生殖周期紊乱、家畜家禽早熟，给种植养殖业带来巨大损失。ZEN还具有强致癌性，导致动物和人乳腺癌、食管癌等发病率增加，成为现今癌症发病率节节上升的原因之一。目前ZEN的检测方法已较为成熟，但有关ZEN去除、转化等方面的问题迫在眉睫。

迄今为止，国内外玉米赤霉烯酮的脱除方法主要有物理处理、化学方法和生物法三大类。虽然物理、化学法处理脱毒有一定程度的效果，但其仍然存在着很多不足，比如脱毒效果不理想，可能造成若干重要营养物质的损失，化学脱毒剂残留，成本较高，等等。利用生物手段进行真菌毒素的降解则是近年来科技界研究的热点和焦点。生物方法是在温和的条件下进行处理，从而使毒素的毒性减小，具有对原料的感官性状、适口性、营养物质影响较小等优点。目前大部分国家对食品、谷物、饲料当中的ZEN含量都作了十分严格的规定，例如澳大利亚规定谷物中ZEN的含量不能超过50ng/g，意大利规定在谷物和谷类产品当中ZEN的含量不能超过100ng/g，而在法国，植物油和谷类当中ZEN的含量必须低于200ng/g。

综上所述，为解决农产品、饲料原料及饲料中ZEN污染问题，有必要从自然资源中分离筛选安全、高效降解玉米赤霉烯酮的微生物菌种，进一步研究其生物特性，毒素降解特性及降解机制，研发适用于饲料行业的玉米赤霉烯酮微生物脱毒剂，保证动物产品的食品安全，减少种植业和养殖业的经济损失。现有技术中，“一株食品级黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解的应用”(中国专利公开号CN103937681A)中，将黑曲霉在适宜条件下培养5d，向其中加入终浓度为2ug/ml的玉米赤霉烯酮，48小时，降解率达到89.56％；“一株铜绿假单胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用”(中国专利公开号CN103981134A)中，将该铜绿假单胞菌适宜条件下和终浓度为2μg/ml玉米赤霉烯酮培养72小时，降解率92.75％；“一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用”(中国专利公开号CN103981133A)中，将该株解淀粉芽孢杆菌在适宜条件下培养24小时，和终浓度为5μg/ml玉米赤霉烯酮加入MM培养基共培养72小时，降解率为95.99％。

与现有技术比较，本技术采用土壤中定向筛选得到的高效降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌ASAGF142，能够在短时间内(4小时)将20μg/ml玉米赤霉烯酮完全降解，降解率100％，具有降解速度快、降解完全的优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株能快速高效降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一株用于高效降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，命名为ASAGF142；该菌株是从安徽芜湖地区种植玉米的土壤中分离得到，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为：CGMCCNO.9464，分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏日期为2014年7月16日。与其它生物的情况一样，本发明具有降解玉米赤霉烯酮活性的菌株ASAGF142仍然可能发生突变或变异。因此，可以利用本领域已知的物理和化学方法得到该菌株的突变株，例如，可以通过用化学药剂如亚硝基胍(NTG)及其它化学诱变剂，或用物理方法如紫外、Co₆₀辐照处理得到其突变株，这些诱变突变株，只要保留了降解玉米赤霉烯酮这样一个能力特征，也属于本发明的一部分。

本发明还提供一种菌剂，它的活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ASAGF142(保藏编号为CGMCCNo.9464)或其衍生的突变株。本发明提供上述菌剂可以为液态菌剂也可以为固态菌剂，并通过现有技术中已公开的制备方法来制备。具体地，本发明提供上述菌剂的制备方法，该方法包括：

(1)将保藏编号为CGMCCNo.9464的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ASAGF142或其衍生的突变株在固体培养基上活化；

(2)将活化后的菌株接种于种子培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；

(3)将所述种子液接种于发酵培养基中，培养至稳定期，制得液态菌剂。

进一步地，本发明还可以将上述液态菌剂直接喷雾干燥，或将液态菌剂与吸附剂混合后干燥，制得固态菌剂。其中，所述液态菌剂与吸附剂的重量比为1:2-10，所述吸附剂可以是玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、凹凸棒土、蛭石、轻质碳酸钙或泥炭中的一种或几种。

进一步地，在上述制备方法中，用来培养解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基(FM)可以有多种形式的，但是综合考虑生产成本、细胞生物量、脱毒活性等方面，优选某些培养基，例如，解淀粉芽孢杆菌ASAGF142优选碳源为乳糖，但也可以选用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘油、果糖、半乳糖、糖蜜等。解淀粉芽孢杆菌ASAGF142优选氮源为牛肉膏，但也可以选用酵母膏、蛋白胨、酵母提取物、玉米浆等。可掺入培养基中的营养无机盐有能够产生下列离子的常规可溶性盐：锌离子、钠离子、镁离子、钙离子、铁离子、氯离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等。

进一步地，所述的种子培养基和发酵培养基(FM)需要121℃高温湿热灭菌后冷却至30～35℃使用。

进一步地，所述活化后的菌种按种子罐中种子培养基的0.5～10％接种量接种入种子罐；所述种子液按发酵罐中发酵培养基的0.5～10％接种量接种入发酵罐。

进一步地，发酵培养条件为：无菌空气的通气量为1:0.5～1.2，搅拌速度为50～300转/分，培养温度约30～37℃，液态菌剂中活细胞数量至少达到10⁷CFU/ml。

本发明要求保护所述解淀粉芽孢杆菌ASAGF142、其衍生的突变株及上述菌剂在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

具体地，在降解玉米赤霉烯酮时，采用如下(a)或(b)方式中的任一种：

(a).将液态菌剂按照质量比1:1的配比喷施于玉米赤霉烯酮污染的谷物或者饲料及饲料原料或其它农副产品，降解玉米赤霉烯酮，所述液态菌剂的活细胞数量至少达到10⁷CFU/ml。

(b).将固态菌剂按照质量百分含量为1-5％的添加量加入到谷物或者饲料原料及饲料中，混合均匀，降解玉米赤霉烯酮，所述固态菌剂的活细胞数量至少达到10⁸CFU/g。

所述谷物为玉米、大麦、稻谷、小麦或高梁。所述饲料原料及饲料为玉米、大麦、稻谷、小麦或高梁等饲料原料及它们加工而成的饲料。所述其它农副产品为农产品加工副产物如酒糟、果渣、淀粉渣等。

本发明的优点在于：本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.9464的解淀粉芽孢杆菌对玉米赤霉烯酮有高效快速的降解作用。使用保藏编号为CGMCCNo.9464的解淀粉芽孢杆菌生产降解玉米赤霉烯酮的固态或液态微生物菌剂，可以直接作为饲料添加剂加入饲料中使用，也可以将微生物菌剂接种到饲料原料或饲料中进行固态发酵去除玉米赤霉烯酮，具有生产使用成本低、简单、易操作，菌种安全，玉米赤霉烯酮降解安全、高效等优点。本发明提供的菌株和菌剂可以用于谷物、饲料、饲料原料中玉米赤霉烯酮的去除，对于解决饲料及其原料中毒素污染问题，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产和动物产品的食品安全、提高畜牧业经济效益具有重要的意义。

附图说明

图1ASAGF142在ZEN浓度为20μg/mL的FM(发酵培养基)中4小时后毒素降解效果。

图2ASAGF142液体反应体系下，降解效果。

图3ASAGF142液态菌剂对谷物中玉米赤霉烯酮的降解效果。

图4ASAGF142固态菌剂对谷物中玉米赤霉烯酮的降解效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ASAGF142的获得与鉴定

从安徽芜湖地区玉米地里采集土样，通过96微孔板为培养载体，首先采用5次连续玉米赤霉烯酮毒素浓度梯度的富集培养法，获得具有降解玉米赤霉烯酮的菌悬液，然后将菌悬液按稀释涂布法以合适的稀释度涂布在LB琼脂平板(酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，NaCl1％，琼脂粉1.6％，pH7.2，121℃灭菌25min)上，挑取生长分离程度良好且菌落形态特征、颜色不同的菌落，在玉米赤霉烯酮浓度为10μg/mL的LB液体培养基酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，NaCl1％，琼脂粉1.6％，pH7.2，121℃灭菌25min)中进行脱毒试验，甲醇提取残留玉米赤霉烯酮并进行HPLC检测，验证各个纯培养物的玉米赤霉烯酮降解效果，最终成功获得能够降解玉米赤霉烯酮的菌株ASAGF142，挑取ASAGF142单菌落于LB液体培养基中，培养至对数期中期时，用50％的甘油溶液(甘油：水＝1:1)与培养物等体积混合后置于-80℃保存。

ASAGF142菌株的鉴定

克隆菌株ASAGF142的16SrDNA、GyrB序列并对该16SrDNA、GyrB序列进行测序(见序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2)，把测序结果在Genbank进行BLAST比对分析序列同源性，得到了菌株ASAGF142的形态生物学鉴定结果、生理、生化特征结果(表1)和系统分类学地位鉴定结果，最终菌株ASAGF142鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

表1

将该解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株ASAGF142送交中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.9464。为简化说明，以下叙述中，将本发明所提及的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株ASAGF142用ASAGF142表示。

实施例2ASAGF142在发酵培养基(FermentationMedium，以下简称“FM”)中的脱毒效果

将活化后的ASAGF142以1％的接种量接种至含有20μg/mL玉米赤霉烯酮的50mL的FM液体培养基中，在220转/分的振荡条件下进行脱毒培养，定时取出用甲醇抽提残余玉米赤霉烯酮，最终培养物中玉米赤霉烯酮的剩余含量经HPLC检测结果表明：FM中的玉米赤霉烯酮均完全降解，ASAGF142在4小时后，ZEN降解率均达100％(见图1)。并绘制液体反应体系下，上述菌株的降解效果图(降解曲线)(见图2)。

实施例3ASAGF142液态菌剂的制备

固体培养基组分及配比：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，NaCl1％，琼脂粉1.6％，pH7.2～7.4，121℃下高温蒸汽灭菌25min。

种子培养基组分及配比：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，NaCl1％，pH7.2～7.4，121℃下高温蒸汽灭菌25min；发酵培养基组分及配比：ASAGF142：乳糖2％、牛肉膏1％、NaCl5mM/L、Tween400.005％，调pH至7.2。

菌种活化：将保藏号为CGMCCNo.9464的ASAGF142接种于固体培养基上，于37℃条件下培养2天，并测定其玉米赤霉烯酮降解性能，再接种于试管斜面上备用。

种子培养：从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基中，于37℃条件下培养至对数期，制得备用菌种；然后，用100升的种子罐，种子培养基投料量70升，投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至37℃后，将上述培养好的菌种以体积比2％的接种量接种入种子罐，搅拌速度为220转/分，培养温度37℃，无菌空气通入量为1:1(体积比)，约24～40小时培养至对数生长期，获得种子液。

发酵培养：采用容积为5000升的生产罐，发酵培养基投料量3000升，在1.1kg/cm²的压力、121℃的温度下，进行高压湿热灭菌，灭菌后冷却37℃，将种子液按2％的接种量接种入发酵罐，发酵条件：无菌空气的通气量为1:1～1.2，搅拌速度为200-260转/分，培养温度37℃，培养时间约24～40小时，放罐后形成具有降解玉米赤霉烯酮能力的液态菌剂。该液态菌剂中活细胞数量至少达到10⁷CFU/ml。

实施例4ASAGF142固态菌剂的制备

将实施例3中产生出来的ASAGF142液态菌剂与麦麸或玉米芯粉按照1:5的质量比例混合均匀，在40℃以下低温干燥至水分10％以下，形成固态状，研磨成粉，分装保存，从而制得ASAGF142固态菌剂。

实施例5ASAGF142液态菌剂对谷物中玉米赤霉烯酮的降解效果

将实施例3制备的ASAGF142液态菌剂进行稀释，稀释后的液体型菌株活细胞数量至少达到10⁷个/ml，按质量比1:1的配比喷洒到污染玉米赤霉烯酮的玉米粉中作为试验组，无菌发酵培养基以同样的配比喷洒到污染玉米赤霉烯酮的玉米粉中作为对照组，每组三个重复，混合均匀后于37℃的温度下脱毒48小时后，从对照组和试验组准确称量5g样品于离心管中，加入25ml70％的甲醇至脱毒样品中，振荡使毒素充分抽提，8000转/分，离心15分钟，取上清；用玉米赤霉烯酮的酶联免疫试剂盒(购于Romer公司)检测玉米赤霉烯酮的含量，结果表明ASAGF142液态菌剂对玉米赤霉烯酮污染的玉米粉降解率达60％，而对照组无任何降解现象(结果见图3)。

实施例6ASAGF142固态菌剂对谷物中玉米赤霉烯酮的降解效果

将实施例4制备得到的ASAGF142固态菌剂按照1％、2％、3％、4％、5％的重量比添加到污染玉米赤霉烯酮的玉米粉中，发酵培养基和玉米芯粉(以1:5比例混合)混合物同样以1％、2％、3％、4％、5％的重量比加入到污染玉米赤霉烯酮的对照组玉米粉中，将对照组和试验组均按1:1的比例加入去离子水，每组三个重复，混合均匀后于37℃的温度下脱毒48小时，从对照组和试验组准确称量5g样品放入50ml离心管中，加入25ml70％的甲醇至脱毒样品中，振荡使毒素充分抽提，8000转/分，离心15分钟，取上清；用玉米赤霉烯酮的酶联免疫试剂盒(购于Romer公司)检测玉米赤霉烯酮的含量，结果表明ASAGF142固态菌剂对污染玉米粉经过48小时的脱毒，其降解率可达55％(添加比4％时)，对照组无任何降解现象(结果见图4)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (8)

1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ASAGF142，其保藏编号为CGMCCNo.9464。

2.一种菌剂，它的活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ASAGF142或其衍生的突变株，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ASAGF142的保藏编号为CGMCCNo.9464。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，该菌剂为液态菌剂或固态菌剂。

4.一种权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(1)将保藏编号为CGMCCNo.9464的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ASAGF142或其衍生的突变株在固体培养基上活化；

(2)将活化后的菌种接种于种子培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；

(3)将所述种子液接种于发酵培养基中，培养至稳定期，制得液态菌剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括将所述液态菌剂喷雾干燥，或将液态菌剂与吸附剂混合后干燥，制得固态菌剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述液态菌剂与吸附剂按1：2-10的重量比进行混合，所述吸附剂为玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、凹凸棒土、蛭石、轻质碳酸钙或泥炭中的一种或几种。

7.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ASAGF142或权利要求2所述的菌剂在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在降解玉米赤霉烯酮时，采用如下(a)或(b)方式中的任一种：

(a).将液态菌剂按照质量比1:1的配比喷施于玉米赤霉烯酮污染的谷物或者饲料及饲料原料或其它农副产品，降解玉米赤霉烯酮，所述液态菌剂的活细胞数量至少达到10⁷CFU/ml。

(b).将固态菌剂按照质量百分含量为1-5％的添加量加入到谷物或者饲料原料及饲料中，混合均匀，降解玉米赤霉烯酮，所述固态菌剂的活细胞数量至少达到10⁸CFU/g。