CN114369550B

CN114369550B - 一株促燕麦生长的解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN114369550B
Application number: CN202210002973.3A
Authority: CN
Inventors: 谢永丽; 陈兰; 武玲玲; 王添; 杨雪
Original assignee: Qinghai University
Current assignee: Qinghai University
Priority date: 2022-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2042-01-04
Also published as: CN114369550A

Abstract

本发明公开了一株促燕麦生长的解淀粉芽孢杆菌及其应用，该菌株GLN18分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2017年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.15051，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。研究表明，本发明的筛选的菌株具有显著的拮抗病原真菌活性，能够产生脂肽类化合物具有显著的抑病原细菌活性；该菌株GLN18具有良好的耐逆性如耐盐性、耐低温和耐碱性；该菌株还具有良好的溶磷能力和降解纤维素活性。实验结果证明，该菌株GLN18对燕麦具有显著的促生效应。

Description

一株促燕麦生长的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株促燕麦生长的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

芽胞杆菌是一类重要的植物根际促生菌，因能产生抗逆性强的芽胞而抵抗不良环境，是一类被广泛研究并应用于生物肥料和生物农药领域的生防细菌。芽胞杆菌能高效利用植物根系分泌物，快速生长繁殖，有效定殖在植物根际或根表等，通过产生多类促生和抑菌物质，以及诱导植物抗病性等，在促进植物生长及保护植物健康中发挥着重要作用。芽胞杆菌能产生激素类如吲哚乙酸、多胺类如亚精胺等、挥发性物质如2,3-丁二醇等，以及植酸酶和嗜铁素等促进植物生长；芽胞杆菌也可通过固氮、溶磷等的作用机制，通过增强植物对矿质元素的吸收而促进植物生长；芽胞杆菌还能产生脂肽类化合物如surfactin、fengycin和iturin，或聚酮类抑菌物质如bacillaene、difficidin和macrolactin，这些物质在防治植物病害中至关重要。

燕麦(Avena sativa)为禾本科燕麦属草本植物，是优良的草料兼用栽培作物，具有耐寒、耐旱、耐盐碱的特点，在青藏高原高寒环境中具有独特的生存及适应能力。其茎叶嫩而多汁，适口性好，营养价值高，青贮或干草都可作为家畜饲料，是提高牧区抗灾保畜能力以及稳定和推进畜牧业发展的重要基础。青海高原缺氧、低温、强紫外线的极端环境使牧草生长缓慢、产草量低，同时过度放牧、鼠虫害等作用加剧天然草地退化，导致“黑土滩”大量出现。燕麦须根系发达，可减少无效蒸发和地表径流，是青藏高原保护生态环境和防止水土流失的重要栽培牧草，利用栽培燕麦扩大草场面积，是实现草场可持续发展的有效措施。

因此，筛选一株解淀粉芽孢杆菌，利用该根围促生菌芽胞杆菌促进燕麦生长、提高燕麦生物量，改善生态环境，在青海省草业发展中极其重要。

发明内容

本发明公开了一株促燕麦生长的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一株促燕麦生长的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18，该菌株GLN18分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2017年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.15051，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18在防治作物病害中的应用。

所述的作物病害优选为由病原真菌禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)、互隔交链孢霉(Alternaria alternata)和黑曲霉(Aspergillus niger)，以及病原细菌大白菜软腐病菌(Erwinia amylovora)中的至少一种引起的作物病害。

上述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18在促进作物生长中的应用。所述的作物优选为燕麦。

一种促燕麦生长的菌剂，该菌剂中包含有上述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18。

一种促燕麦生长的微生物菌肥，该微生物菌肥中包含有上述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18。

上述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18在制备用于促燕麦生长的微生物菌肥中的应用。

上述的菌剂或上述的微生物菌肥在促燕麦生长中的应用。

一种促燕麦生长的方法，为以下(1)～(3)中的至少一种：

(1)采用权利要求1所述菌株的发酵液对燕麦种子进行浸种处理；

(2)采用权利要求1所述菌株的发酵液对燕麦幼苗进行灌根处理；

(3)采用权利要求3所述的微生物菌肥对燕麦进行施肥。

本发明的有益效果：

本发明筛选了一株促燕麦生长的解淀粉芽孢杆菌，研究表明，本发明的筛选的菌株具有显著的拮抗病原真菌活性，能够产生脂肽类化合物具有显著的抑病原细菌活性；该菌株GLN18具有良好的耐逆性如耐盐性、耐低温和耐碱性；该菌株还具有良好的溶磷能力和降解纤维素活性。实验结果证明，该菌株GLN18对燕麦具有显著的促生效应。

附图说明

图1为菌株GLN18拮抗病原真菌活性；

其中，A.拮抗禾谷镰孢菌；B.拮抗锐顶镰孢菌；C.拮抗互隔交链孢霉；D.拮抗黑曲霉。

图2为菌株GLN18产生的脂肽化合物活性检测；

其中，A.脂肽化合物血平板活性检测；B.脂肽化合物对大白菜软腐病菌的抑制活性。

图3为菌株抑菌活性测定；

其中，A.产蛋白酶活性；B.产淀粉酶活性；C.产β-1，3-葡聚糖酶活性。

图4为菌株GLN18在解磷培养基上形成的透明圈；

其中，A.解有机磷能力；B.解无机磷能力。

图5为菌株GLN18在CMC-Na培养基上形成的透明圈。

图6为菌株GLN18促燕麦幼苗生长。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1菌株筛选及功能验证

1.菌株来源：

芽胞杆菌菌株GLN18分离自青海省果洛州年宝玉则高寒草甸植被根围。

2.菌株GLN18的分子鉴定

对芽胞杆菌菌株GLN18进行16S rDNA序列与gyrB基因鉴定，比对分析菌株的16SrDNA序列与gyrB基因序列分析结果，菌株GL18与B.amyloliquefaciens HS8的16S rDNA序列序列相同(或一致)性为99％，与B.amyloliquefaciens BCRC14193的gyrB基因序列相同(或一致)性为95％，比较两种鉴定结果，菌株GL18鉴定为解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens(表1)。

表1.菌株GLN18的16S rDNA和gyrB序列比对结果

Table 1 List of isolates closest affiliation to 16S rDNA and gyrBgene sequencing of GLN18.

3.菌株GLN18拮抗病原真菌活性

菌株GLN18对分离自小麦的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、分离自梭罗草的锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)、分离自老鹳草的互隔交链孢霉(Alternariaalternata)、分离自高山嵩草的黑曲霉(Aspergillus niger)均表现出良好的拮抗活性。其中菌株GLN18对黑曲霉的抑菌圈平均直径为18mm，较大程度抑制病原菌的生长和扩散，表现出显著拮抗活性(图1)。

4.菌株GLN18产生的脂肽类化合物分析

4.1菌株GLN18产生的脂肽类化合物

通过MALDI-TOF-MS质谱分析发现，菌株GLN18可产生脂肽化合物Surfactin、Iturin、Fengycin。

4.2脂肽类抗生素抑血平板实验

通过血平板透明圈法检测菌株GLN18产生的脂肽类抗生素的活性，结果显示菌株GLN18提取的脂肽化合物粗提物，在血平板上形成直径12mm的透明圈，表明脂肽化合物具有抗生素活性，可通过与红细胞膜上的磷脂双分子层相互作用形成离子通道，破坏膜结构，使细胞内容物释放，引起血细胞死亡(图2A)。

4.3脂肽类化合物抑病原细菌活性

将菌株GLN18产生的脂肽化合物点样于含大白菜软腐病菌(Erwinia amylovora)NA培养基平板上，可抑制的大白菜软腐病菌(Erwinia amylovora)的生长，形成抑菌圈(图2B)，推测菌株GLN18产生的的拮抗活性与其产生的脂肽化合物活性有关。

5.菌株GLN18抑菌活性

将菌株GLN18接种抑菌活性检测培养基上，结果显示，菌株GLN18具有产蛋白酶、淀粉酶、β-1,3-葡聚糖酶的能力。

菌株GLN18在蛋白酶检测培养基上产生明显透明圈，平均直径为56mm(图3A)；用革兰氏碘溶液对接种了GLN18的淀粉酶检测培养基进行染色，菌落周围出现一个清晰的透明圈(图3B)；用0.1％刚果红溶液对接种了GLN18的β-1，3-葡聚糖酶检测培养基进行染色，可见一个清晰的色圈产生(图3C)。

6.菌株GLN18的耐逆性

6.1耐盐性

将菌株GLN18的菌液分别涂板于含NaCl浓度为3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％的LB固体培养基上，置于37℃条件下培养。结果表明菌株GLN18在含NaCl浓度为3％、5％、7％、9％、11％、13％的LB平板上均可正常生长，在含NaCl浓度为15％的LB培养基上不能正常生长，表现出一定的耐盐性(表2)。

6.2耐低温

芽胞杆菌GLN18在14、18℃条件下，培养1d后长出菌圈；10℃低温条件下，其生长和扩展较快，培养2d后即出现明显的菌苔；4℃低温条件，可缓慢生长，在培养5d后出现菌苔，表现出良好的低温适生性(表2)。

表2菌株GLN18的耐盐性及低温适生性

Table2 Salt-resistance ability and low temperature adapting abilityof strain GLN18

注：+++：生长良好；++：正常生长；+：缓慢生长；-：不能生长

Note：+++：Growth well；++：Growth normal；+：Growth slowly；-：Nonviable

6.3耐碱性

菌株GLN18在pH:7-11时均能正常生长，但相对来说极端生境的芽胞杆菌耐酸碱度范围较宽；在pH小于5的强酸环境中不能正常生长，变为碱性环境时(pH 7-11)生长逐渐增强，当趋于强碱环境时，生长呈下降趋势；菌株GLN18在pH 11-13的强碱环境下仍能生长，说明菌株具有很强的耐碱能力。

7.菌株GLN18的溶磷能力

菌株GLN18具有良好的溶磷能力。将菌株接种在蒙金娜解磷培养基平板上培养7d，发现GLN18在无机磷、有机磷培养基上均能产生透明圈，形成的透明圈平均直径分别为20mm、18mm(图4)。

8.菌株GLN18的降解纤维素活性

菌株GLN18具有显著降解纤维素活性。将菌株接种在CMC-Na培养基平板中央进行培养、以Gram Iodime染色后产生明显的透明圈，其平均直径为40mm，计算A值为2.67。说明菌株产生纤维素酶将CMC-Na水解产生还原糖，使其无法附着染料而形成透明圈(图5，表3)。

表3菌株GLN18降解纤维素活性

Table 3 Cellulose degradation activities of strain GLN18

9.菌株GLN18对燕麦的促生效应

测定菌株GLN18对燕麦的促生效应。结果显示：与CK相比，菌株GLN18菌悬液(细胞浓度1×10⁷cfu/mL)浸种后的燕麦幼苗的株高、根长、鲜重均有明显提高，与对照相比分别增加69.91％、69.08％、40.74％，平均株高、根长、鲜重达到20.78cm、15.64cm、0.38g(图6，表4)。

表4菌株GLN18促燕麦幼苗生长效果

Table 4 Effect of strain GLN18 on seedlings growth

注：CK为未经菌液处理的幼苗。

Note:CK are Untreated seedlings.

Claims

1.一株促燕麦生长的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18，该菌株GLN18分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），于2017年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No. 15051，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18在防治作物病害中的应用，其特征在于：所述的作物病害为由病原真菌禾谷镰孢菌、锐顶镰孢菌、互隔交链孢霉和黑曲霉，以及病原细菌大白菜软腐病菌中的至少一种引起的作物病害。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18在促进燕麦生长中的应用。

4.一种促燕麦生长的菌剂，其特征在于，该菌剂中包含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18。

5.一种促燕麦生长的微生物菌肥，其特征在于，该微生物菌肥中包含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18。

6.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株GLN18在制备用于促燕麦生长的微生物菌肥中的应用。

7.权利要求4中所述的菌剂或权利要求5中所述的微生物菌肥在促燕麦生长中的应用。

8.一种促燕麦生长的方法，其特征在于，为以下（1）~（3）中的至少一种：

（1）采用权利要求1所述菌株的发酵液对燕麦种子进行浸种处理；

（2）采用权利要求1所述菌株的发酵液对燕麦幼苗进行灌根处理；

（3）采用权利要求5所述的微生物菌肥对燕麦进行施肥。