CN102191200A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。该解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ASAG1，其保藏编号为CGMCC No.3056，是一株生防细菌。本发明还提供了含有该保藏菌株的菌剂。本发明所述解淀粉芽孢杆菌或所述菌剂对储粮真菌具有显著抑制活性，并且对储粮真菌毒素具有消减作用。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

谷物是人们摄取营养、赖以生存的能量来源，是平衡膳食金字塔中比例最大、最为重要的物质基础。而因发霉、害虫危害导致的储粮品质劣变和损失严重危害着我国储粮安全。据联合国粮农组织（FAO）统计，每年约有25%粮食因真菌毒素污染影响食用。目前发现危害粮食储藏的真菌有150多种，并可产生200多种真菌毒素。人体摄入这些毒素之后能够导致呕吐、消化系统和神经系统症状、多种原发性癌症、甚至急性中毒死亡等。因此防止粮食霉变是保持粮食品质的重要方法之一。

目前所用的防霉方法主要是通过降低储藏水分、温度等物理作用处理粮食及其制品以防止霉菌生长，或通过添加化学防霉剂的方法控制储粮及粮食产品霉变。但是这些方法具有破坏营养、效果持续时间短、防霉不彻底和成本高等缺陷，从而造成实际防控效果不理想，另外有些化学防霉剂，本身具有一定毒性，使用不当反而会影响食用安全和污染环境。而利用一些有着抗真菌作用又对人体无害的微生物防霉则有成本低、增值快、作用效果持久、安全高效、绿色环保等优点。因此研究、开发生物防霉和利用微生物及其代谢产物防霉等技术，是提高防霉效率、减少营养损失、降低储存成本的好方法。另外某些微生物的代谢过程还可以降解粮食和饲料中的不容易被机体消化吸收的大分子，使其降解成可以被机体直接吸收利用的小分子，从而在提高粮食利用率的同时，并提升了产品价值。目前，生防菌在很多国家都已经获得使用批准，并且在很多方面都取得了实际效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对储粮真菌具有抑制作用，并且对真菌毒素有削减作用的解淀粉芽孢杆菌。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus  amyloliquefaciens），命名为ASAG1，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的一个株系，是从粮库储藏玉米中分离得到，已于2009年5月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），其保藏编号为 CGMCC No.3056。

本发明还提供一种菌剂，它的活性成分为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus  amyloliquefaciens）ASAG1，其保藏编号为 CGMCC No.3056。该菌剂可以通过现有技术中的制备方法来制备，还可以根据需要，添加可接受的辅料。

进一步地，本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌ASAG1或所述菌剂在抑制储粮有害真菌中的应用，其中，所述储粮有害真菌为黑曲霉菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌、炭黑曲霉菌、疣孢青霉菌、赭曲霉菌、黄绿青霉菌、三线镰刀菌、半裸镰刀菌、尖孢镰刀菌、灰绿曲霉菌或赤曲霉菌。

更进一步地，本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌ASAG1或所述菌剂在削减储粮真菌毒素中的应用，其中，所述储粮真菌毒素为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素或玉米赤霉烯酮。

本发明的优点是：

1. 本发明所述的解淀粉芽孢杆菌是一种生防细菌，它对储粮真菌具有显著抑制作用，对真菌毒素具有消减作用，是良好的防霉剂和真菌毒素脱毒剂。

2. 现有技术中分离出来的解淀粉芽孢杆菌菌株主要是防治大田里的真菌，没有涉及仓储，特别是储粮中的真菌，而储粮真菌，特别是霉菌与大田中的真菌有很大的不同。本发明主要针对储粮中的真菌进行防控，目前还没报道。

附图说明

图1 为本发明的菌株的染色镜像；

图2 发酵24h、48h、72h时AFT残留含量变化趋势图；

图3 发酵24h、48h、72h时OTA残留含量变化趋势图；

图4 发酵24h、48h、72h时ZEN残留含量变化趋势图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1 解淀粉芽孢杆菌ASAG1获得与鉴定

一、解淀粉芽孢杆菌ASAG1的获得与鉴定

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌，是从粮库储藏玉米中分离得到。其菌株的形态如下：革兰氏阳性菌，细胞形态杆状，形成芽孢，接触酶和氧化酶反应均为阳性。利用碳水化合物产酸试验：淀粉水解、水解酪素及水解明胶均为阳性。最佳培养基配方：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L，琼脂15克，自然pH。培养温度28~32 ℃。

本发明所述的ASAG1菌株其16S rDNA序列如序列表SEQ ID No：1所示。

二、解淀粉芽孢杆菌ASAG1的保藏

通过上述鉴定结果，确认菌株ASAG1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus  amyloliquefaciens)的一个株系，命名为ASAG1，于2009年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），其保藏编号为 CGMCC No.3056。

实施例2 解淀粉芽孢杆菌ASAG1的培养

（1）斜面培养：培养时间2~3天，培养基成分（1升）：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L，琼脂15克，自然pH，培养温度28~32 ℃。

（2）种子培养：超净工作台中从斜面挑取经活化的单菌落接入种子培养液中，28℃摇菌1~2天，转速200 r/min，得到种子液；

种子培养液成分（1升）：葡萄糖20g/L、牛肉膏5g/L、7水合硫酸镁1g/L、硫酸铵1g/L、碳酸钙3g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、马铃薯200g/L，pH值7.0~7.2。

（3）发酵：按5%接种量，将上步骤获得的种子液接入发酵培养基中，28℃振荡培养2~3天，转速200 r/min，得到解淀粉芽孢杆菌ASAG1发酵液。其中，发酵培养基的配方同种子培养基。

实施例3 解淀粉芽孢杆菌ASAG1对真菌的拮抗实验

将实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌ASAG1发酵液以12000 r/min离心10 min，上清液用0.2 μm无菌微孔滤膜过滤除菌后，采用牛津杯定量法做抑制试验，测量抑菌圈直径大小，以确定该菌株对12种常见储粮有害真菌的抑菌效果。

其中黑曲霉菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌、炭黑曲霉菌、疣孢青霉菌、赭曲霉菌、黄绿青霉菌使用察氏培养基，三线镰刀菌、半裸镰刀菌、尖孢镰刀菌使用PDA培养基，灰绿曲霉菌使用高盐察氏培养基，赤曲霉菌使用浓糖察氏培养基做抑菌试验。

试验所用菌种来源：

黑曲霉菌（Aspergillus.niger CGMCC3.4463）

黄曲霉菌（Aspergillus.flavus CGMCC3.4410）

赭曲霉菌（Aspergillus.ochraceus CGMCC3.4520）

灰绿曲霉菌（Aspergillus.glaucus  CGMCC3.3980）

烟曲霉菌（Aspergillus.fumigatus CGMCC3.3552）

赤曲霉菌（Aspergillus.ruber CGMCC3.3956）

黄绿青霉菌（Penicillium.citreo-viride CGMCC3.4038）

疣孢青霉菌（Penicillium.verruculosum CGMCC3.4297）

半裸镰刀菌（Fusarium.semitectum CGMCC3.0719）

尖孢镰刀菌（Fusarium.oxysporum CGMCC3.2830）

三线镰刀菌（Fusarium.tricinetum CGMCC3.4731）

以上菌种均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其中黄曲霉菌、赭曲霉菌、三线镰刀菌为产毒株。炭黑曲霉菌(Aspergillus.carbonarius) 由中国农业大学赠予。

所述察氏培养配方：硝酸钠3 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、7水合硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂20 g/L。

所述高盐察氏培养基：硝酸钠3 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、7水合硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L、蔗糖30 g/L、氯化钠60 g/L、琼脂20 g/L。

所述浓糖察氏培养基：硝酸钠3 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、7水合硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L、蔗糖200 g/L、琼脂20 g/L。

牛津杯定量法对除菌发酵液的抑菌试验结果，如表1所示，解淀粉芽孢杆菌ASAG1发酵液对以上12种真菌都有明显的抑制作用。

表1 除菌发酵液对12种储粮有害真菌抑制作用

储粮有害真菌	抑菌圈直径/mm
		黑曲霉菌	23
黄曲霉菌	17
		烟曲霉菌	18
三线镰刀菌	26
		炭黑曲霉菌	28
疣孢青霉菌	31
		半裸镰刀菌	23
赭曲霉菌	22
		尖孢镰刀菌	21
黄绿青霉菌	27
		灰绿曲霉菌	29
赤曲霉菌	25

结论：解淀粉芽孢杆菌ASAG1，经初步验证对储粮中的主要产毒真菌，黄曲霉菌、赭曲霉菌、三线镰刀菌都有很好的拮抗作用。

实施例4解淀粉芽孢杆菌ASAG1对储粮真菌毒素的削减试验

（1） 菌体发酵过程对毒素消减作用的试验设计

黄曲霉毒素B1（AFTB1）标准品、赭曲霉毒素（OTA）标准品、玉米赤酶烯酮（ZEN）标准均购置于SIGMA公司

A、制作阳性对照，向三支50 mL离心管分别加入2 mL培养基和40μL三种不同毒素，添加浓度如表2所示。

所述培养基的配方为：每升含：马铃薯100g、乳糖40g、蛋白胨15g、硝酸钠0.5g、7水合硫酸镁4g，PH=7.0。用于做抗菌谱实验的培养基为每升加入20g琼脂的固体。

表2 不同种类毒素添加浓度对照表

	培养基量/ml	毒素量/μl	毒素初浓度/ppm	终浓度/ppm
					黄曲霉毒素（AFT）	2	40	100	2
赭曲霉毒素（OTA）	2	40	50	1
					玉米赤霉烯酮（ZEN）	2	40	1000	20

B、三角瓶中剩余的培养基按10%的接种量加入实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌ASAG1发酵液，混匀；

C、制作空白对照，9支50 mL离心管分别加入2 mL B液，不加毒素；

D、样品制备：取三支螺口离心管分别加入15 mL B液，每管分别加入三种不同毒素300μL，混匀；

E、将D中每个样液分装6支50 mL的离心管中，每管2 mL。

（2）具体操作步骤：

a、将以上样品放于31 ℃，200 r/min摇床发酵；

b、分别于24 h、48 h、72 h各取每种毒素的C空白对照一支和E样品管两支；

c、空白对照C液中加入相应的毒素40μL，混匀；与样品管、阳性对照管一起，每管分别加入2 ml 二氯甲烷充分混匀，离心；

d、抽取下层清液约1.5 ml，真空浓缩，抽干二氯甲烷，加1.5 mL色谱级甲醇复溶，过0.45μm微孔滤膜，装液相色谱进样瓶待检。

（3）高效液相色谱检测

AFT ：Agilent Eclipse XDB-C18, 150 mm×4.6 mm(5 μm)色谱柱，流动相：水/甲醇=60%/40%，电化学衍生，荧光检测器检测Ex=360 nm Em=440 nm，柱温25 ℃，流速1.0 ml/min，进样量20μL；

OTA ：Agilent Eclipse XDB-C18, 150 mm×4.6 mm(5 μm)色谱柱，流动相：水/乙腈/乙酸=99%/99%/2%，荧光检测器检测Ex=333 nm Em=460 nm，柱温30 ℃，流速1.0 ml/min，进样量20μL；

ZEN ：Agilent Eclipse XDB-C18, 150 mm×4.6 mm(5 μm)色谱柱，流动相：水/乙腈/甲醇=46%/46%/8%, 荧光检测器检测Ex=274 nm Em=440 nm，柱温30 ℃，流速1.0 ml/min，进样量20μL。

试验结果：如图2-4所示，经过菌体发酵处理后，三种毒素均能得到有效削减，降解率都能达到70%以上，且最终浓度在国家标准的允许限量标准范围内，也即在安全范围内，其中对黄曲霉毒素的削减在解淀粉芽胞杆菌发酵的72 h内呈现一个梯度的趋势，而赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮均是在24 h以内就能几乎全部削减掉。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

  序列表

<110>  国家粮食局科学研究院

<120>  一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

<130> 

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1458

<212>  DNA

<213>  解淀粉芽孢杆菌(Bacillus  amyloliquefaciens)

<400>  1

ttctctggcg acgtgctaca catgcagtcg agcgagacga tgatcgcggt agacttgctc       60

cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat     120

aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa      180

aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt      240

aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga    300

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga    360

aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg      420

ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag     480

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggga    540

attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct      600

caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc    660

cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc    720

tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg    780

gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg      840

cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga    900

attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa    960

ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca     1020

gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc     1080

gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact     1140

gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct    1200

gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca   1260

atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga       1320

atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac      1380

cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttaggagc   1440

cagccgccga aggtggat                                                 1458

 

Claims (6)

1.一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus  amyloliquefaciens）ASAG1，其保藏编号为 CGMCC No.3056。

2.一种菌剂，它的活性成分为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus  amyloliquefaciens）ASAG1，其保藏编号为 CGMCC No.3056。

3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌ASAG1或权利要求2所述菌剂在抑制储粮有害真菌中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述储粮有害真菌为黑曲霉菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌、炭黑曲霉菌、疣孢青霉菌、赭曲霉菌、黄绿青霉菌、三线镰刀菌、半裸镰刀菌、尖孢镰刀菌、灰绿曲霉菌或赤曲霉菌。

5.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌ASAG1或权利要求2所述菌剂在削减储粮真菌毒素中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述储粮真菌毒素为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素或玉米赤霉烯酮。

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