CN103190533B - 一种玉米赤霉烯酮生物降解剂的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玉米赤霉烯酮生物降解剂的制备方法，通过啤酒酵母培养，先在PDA固体培养基培养48h，然后调取单菌落，接入PDB液体培养基中振荡培养3～5天，用酒糟蛋白饲料作载体，加入重量比为1～10%酵母发酵液制成玉米赤霉烯酮生物降解剂粗酶制剂。啤酒酵母发酵产物玉米赤霉烯酮降解酶的提取，用啤酒酵母在37℃培养3～5天，取发酵液，在4℃，8000r／min条件下冷冻离心20min，或采用抽滤的方法，分离上清液与菌体细胞；取分离出的上清液，即得胞外粗提液，用30～90％的硫酸铵沉淀后，在4℃，8000r／min条件下冷冻离心20min，即得精提的玉米赤霉烯酮降解酶；发明的玉米赤霉烯酮降解剂的优势在于酵母菌除可降解毒素外，还能吸附毒素。
Description
技术领域
本发明属于生物脱毒技术领域，涉及一种玉米赤霉烯酮生物降解剂的制备方法及其应用，具体涉及利用能够降解赤霉烯酮的啤酒酵母(aspergillus cerevisiae)及其所产生的降解酶，制备降解赤霉烯酮的生物制剂，用于赤霉烯酮的生物脱毒，主要用于玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物的赤霉烯酮降解。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone)又称F-2毒素，它首先从有赤霉病的玉米中分离得到。玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属(Fusarium)的菌侏，如禾谷镰刀菌(F.graminearum)和三线镰刀菌(F.tricinctum)。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率为45%，最高含毒量可达到2909mg/kg；小麦的检出率为20%，含毒量为0.364～11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110℃下处理1h才被完全破坏。
玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，能造成动物急慢性中毒，引起动物繁殖机能异常甚至死亡，可给畜牧场造成巨大经济损失。传统的去除赤霉烯酮方法主要有吸附、萃取、热处理，但是有费时费力、去毒率不高、易造成营养物质流失的缺点。因此，迫切需要一种高效安全的脱毒方法消除这类毒素对人畜健康的危害。
发明内容:
本发明的目的是提供一种玉米赤霉烯酮生物降解剂的制备方法及其应用，制备能够降解赤霉烯酮的啤酒酵母(aspergillus cerevisiae)及其所产生的降解酶，用该菌株制备降解赤霉烯酮的生物制剂，用于玉米赤霉烯酮的生物脱毒。
本发明的另一目的是提供上述啤酒酵母的培养方法及其所分泌的降解酶的制备方法。
技术方案
一种玉米赤霉烯酮生物降解剂的制备方法，其步骤为：
（1）啤酒酵母培养，使用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其保存编号为CGMCC NO.2.16（中国普通微生物菌种保藏管理中心），先在PDA固体培养基上培养48h，然后调取单个菌落，接入PDB液体培养基中振荡培养。
PDA固体培养基由如下组分组成（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20；
PDB培养基由如下组分组成（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20。
振荡培养条件为:培养温度为20～40℃，培养时间24～120h，pH值5.0～9.0，转速为120～200r/min。
优选地，所述振荡培养条件为：培养温度为37℃，培养时间72h，pH值6.5～7.5，转速为150 r/min。
（2）啤酒酵母培养产物玉米赤霉烯酮降解酶的提取，用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ) 在37℃培养3～5d，取培养液，在4℃，8000 r／min条件下冷冻离心20 min，或采用抽滤的方法，分离上清液与菌体细胞。取分离出的上清液，即得胞外粗提液，用30～90％的硫酸铵沉淀后，在4℃，8000 r／min条件下冷冻离心20 min，取沉淀物，冷冻干燥。即得精提的玉米赤霉烯酮降解酶。
（3）粗制玉米赤霉烯酮降解剂的制备：将将步骤（1）制备酵母菌培养液按1：10（V/W）与DDGS（酒糟蛋白饲料）混合，50～60℃烘干或自然干燥，即得到粗制的玉米赤霉烯酮生物降解制剂。
（4）精制玉米赤霉烯酮降解剂的制备：将将步骤（2）制备精提的玉米赤霉烯酮降解酶按1：100（W/W）与葡萄糖混合均匀，制成精制玉米赤霉烯酮生物降解剂。
玉米赤霉烯酮生物降解剂在降解饲料中的玉米赤霉烯酮的应用：将1～2%粗制玉米赤霉烯酮生物降解剂添加到饲料中，可预防仔猪赤霉烯酮中毒，按照本专利生产的粗制玉米赤霉烯酮降解剂按1%与含有玉米赤霉烯酮的全价饲料混合，作用6小时后，玉米赤霉烯酮的含量减少70%～80%；或将精制玉米赤霉烯酮降解剂按1～2%混入饮水中，可预防仔猪赤霉烯酮中毒。
发明的显著效果
目前，已有利用微生物降解玉米赤霉烯酮的专利，但是多数使用芽孢杆菌，而本专利使用酵母菌。
酵母菌作为玉米赤霉烯酮降解剂的优势在于酵母菌除可降解毒素外，还能吸附毒素。
具体实施方式
实例一
啤酒酵母降解赤霉烯酮的具体操作流程为：
将啤酒酵母（CGMCC NO.2.16）在PDA固体培养基37℃培养48h，调取单菌落，接入100mlPDB液体培养基中，在37℃培养3～5d。将培养液与1kgDDGS混合，50℃烘干，即为粗制玉米赤霉烯酮降解剂，可作为饲料添加剂使用。
取培养液，在4℃，8000r／min条件下冷冻离心20 min，取上清液，用浓度30％的硫酸铵沉淀，8000r／min条件下冷冻离心20 min，取沉淀，冷冻干燥，即得精提的玉米赤霉烯酮降解酶。精提的玉米赤霉烯酮降解酶按1%用葡萄糖混合，制备成精制玉米赤霉烯酮降解剂。
使用效果：
1． 体外实验：将按照本专利生产的粗制玉米赤霉烯酮降解剂按1%与含有玉米赤霉烯酮的全价饲料混合，作用6小时后，玉米赤霉烯酮的含量减少70%～80%（见表1）。
表1 不同作用时间玉米赤霉烯酮降解剂对玉米赤霉烯酮的降解效果
| 作用时间(小时) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 6 |
| 饲料中赤霉烯酮（PPB） | 100 | 40 | 30 | 26 | 25 | 24 |
2． 体内试验：将按照本专利生产的玉米赤霉烯酮降解剂按1%与饮水混合，自由饮用（实验组），自由采食含有玉米赤霉烯酮的全价饲料。饲养仔猪10～20天，实验组仔猪正常发育；未加降解剂的对照组仔猪出现玉米赤霉烯酮中毒症状（见表2）。
表2 饮用玉米赤霉烯酮降解剂对仔猪玉米赤霉烯酮中毒的预防作用
| 实验天数 | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 |
| 实验组发病率（%） | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 对照组发病率（%） | 0 | 0 | 10 | 60 | 100 |
Claims (4)
1.一种玉米赤霉烯酮生物降解剂的制备方法，其步骤为：
（1）啤酒酵母培养，使用啤酒酵母(aspergillus cerevisiae)，其保存编号为CGMCC NO.2.16，先在PDA固体培养基培养48h，然后调取单菌落，接入PDB液体培养基中振荡培养，振荡培养条件为:培养温度为20～40℃，培养时间24～120h，pH值5.0～9.0，转速为120～200r/min；
（2）啤酒酵母培养产物玉米赤霉烯酮降解酶的提取，用啤酒酵母在37℃培养3～5d，取培养液，在4℃，8000 r／min条件下冷冻离心20 min，或采用抽滤的方法，分离上清液与菌体细胞；取分离出的上清液，即得胞外粗提液，用30～90％的硫酸铵沉淀后，在4℃，8000 r／min条件下冷冻离心20 min，取沉淀物，冷冻干燥，即得精提的玉米赤霉烯酮降解酶；
（3）粗制玉米赤霉烯酮降解剂的制备：将步骤（1）制备的酵母菌培养液按1：10（V/W）与酒糟蛋白饲料混合，50～60℃烘干或自然干燥，即得到粗制的玉米赤霉烯酮生物降解制剂；
（4）精制玉米赤霉烯酮降解剂的制备：将步骤（2）制备精提的玉米赤霉烯酮降解酶按1：100（W/W）与葡萄糖混合均匀，制成精制玉米赤霉烯酮生物降解剂。
2.根据权利1所述的玉米赤霉烯酮生物降解剂的制备方法，其特征在于所述的PDA固体培养基由如下组分组成：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L；PDB培养基由如下组分组成：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L。
3.根据权利1所述的玉米赤霉烯酮生物降解剂的制备方法，其特征在于所述的振荡培养条件为：培养温度为37℃，培养时间72h，pH值6.5～7.5，转速为150 r/min。
4.权利1至3任一方法所制备的玉米赤霉烯酮生物降解剂在降解饲料中的玉米赤霉烯酮的应用，将1～2%玉米赤霉烯酮生物降解剂添加到饲料中。
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