CN105794963A - 一株降解玉米赤霉烯酮毒素酵母菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株降解玉米赤霉烯酮毒素酵母菌及应用，属于生物技术领域，该酿酒酵母对ZEA降解效果最佳的条件为：酵母初始浓度为10⁸CFU/mL，pH为6，摇床培养温度为28˚C，转速为180rpm。可高效降解ZEA毒素，降解率可达100%，并可明显抑制ZEA毒素产生菌禾谷镰刀菌的生长；且当ZEA初始浓度为5μg/mL时，24h内酵母对其降解速率最大，48h即可将ZEA毒素彻底降解为无毒产物。本发明使用的酿酒酵母，可替代化学杀菌剂应用于水果采后病害防治，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

一株降解玉米赤霉烯酮毒素酵母菌及应用

技术领域

本发明属于生物降解毒素的方法，尤其涉及酿酒酵母在饲料和食品安全等领域的应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)又名F-2毒素，最初是由Stob等于1962年从发霉的玉米中分离纯化得到，主要是由禾谷镰刀菌(F.graminearum)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、粉红镰刀菌(Fusariumroseum)、木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)和三线镰刀菌(Fusariumtricinctum)等多种镰刀菌属真菌产生。ZEA是一种非类固醇类、具有雌激素作用的真菌毒素，其作用强度约为雌激素的1/10，但作用时间要比雌激素长的多。ZEA具有多种毒性，包括生殖毒性、细胞毒性、遗传毒性、免疫毒性以及致癌毒性等。

全世界范围内ZEA污染情况相当普遍，广泛存在于谷物、动物饲料及农副产品中，特别是在玉米以及以玉米为原料加工的食品或副产品中ZEA污染情况最为严重。Elisabeth等在2004-2011年对世界范围内17316个饲料及饲料原料样品的ZEA含量进行了测定，结果表明，样品中ZEA检出率为36％，平均含量为101μg/kg，最高含量高达26728μg/kg。国内谷物及副产品中玉米赤霉烯酮的污染状况也相当严重。王金勇等对2012年从全国各地采集的841份饲料原料和饲料样品进行检测，检测结果表明，我国的饲料原料和饲料均受到不同程度的ZEA污染，其中猪料及禽料样品中，ZEN的阳性检出率分别为65％和74％，最高污染水平分别为2.63mg/kg和2.968mg/kg，禽料污染的平均水平高达0.977mg/kg；此外，玉米、玉米干酒糟(DDGS)及玉米其它副产品中ZEA的检出率分别为48％、75％和88％，平均污染水平分别为0.658mg/kg、0.659mg/kg和1.003mg/kg。

大量研究表明，玉米赤霉烯酮具有极强的毒性，给人类和动物健康造成了极大的危害。玉米赤霉烯酮及其代谢产物能够引起很多种类似雌性动物的雌激素过多症和生殖障碍。饲料中含1～5mg/kg的ZEA会使猪产生临床症状，1mg/kg的污染水平即可使小猪产生高雌激素症。仔猪或母猪接触ZEA的阶段、持续时间和剂量不同，会导致仔猪或母猪出现不同程度的雌激素中毒症，轻微中毒时会出现乳头红肿、子宫和阴道肿大，严重中毒时会出现阴道或直肠脱垂，连续动情导致的假孕、不育、卵巢畸形和流产等一系列的生殖障碍。另外，在一定程度下，ZEA会影响动物卵母细胞的成熟速率，甚至引发细胞核发生畸变。

控制ZEA的方法主要包括物理方法、化学方法及生物方法。常用的控制ZEA的物理方法有剔除、水洗、脱壳、碾磨、热处理、压煮、辐照和吸附剂吸附等。对于轻微污染ZEA的谷物可以采取剔除、水洗、脱壳和碾磨等手段清除部分毒素，一般适用于少量谷物中ZEA的清除。采用热处理和压煮方法对产生ZEA的真菌起到杀菌作用，但是由于ZEA的性质很稳定，所以这两种方法对ZEA的作用并不大，且高温处理会破坏食品或饲料的营养价值。辐照技术处理真菌毒素不但能有效清除毒素，还能同时杀死镰刀菌，但辐照降解后产物的组成、性质以及毒理等尚缺乏研究。吸附剂吸附也是一种能有效清除ZEA污染的方法，但吸附方法在吸附毒素的同时也会吸附食物中的营养物质，并且由于毒素并未得到降解，会为环境带来污染。常用的清除ZEA的化学方法包括臭氧处理、双氧水处理及碳酸钠浸泡等，但是化学试剂的添加会引入许多不确定因素，生成新产物的潜在毒性也需进一步研究。

随着生物脱毒技术的发展，采用酵母菌控制谷物及其副产品中ZEA的污染展现出良好的应用前景，但相关研究在国际范围内目前尚处于起步阶段，影响了生物防治技术在ZEA控制方面的应用。本发明的目的是提供一株分离自生态果园的的桑葚中，能够高效降解ZEA的酵母菌株，因其具有的高安全性，并对ZEA毒素主要产生菌禾谷镰刀球菌的生长具有较强的抑制作用，利用该菌株可实现对饲料及其原料、谷物及其制品中的ZEA的控制，对葡萄和草莓采后病害具有显著防治作用，同时在保障人类食品安全和环境保护方面也有较高的应用价值。该菌对ZEA毒素具有显著降解作用，对葡萄采后病害具有显著防治作用，菌经鉴定为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，命名为酿酒酵母912。研究证明，该菌在合成培养基、麦芽汁培养基、生理盐水中都能够显著地降解ZEA为无毒产物，且降解能力的遗传稳定性很好。

发明内容

本发明所提供的菌株系从镇江市世业洲农业生态果园的桑葚中筛选分离到一株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)912，对ZEA毒素具有显著降解作用，并对ZEA毒素主要产生菌禾谷镰刀球菌的生长具有较强的抑制作用。

本发明使用的酿酒酵母912，经ICR小鼠急性毒性试验，确定其具有高度安全性，对人体无害。

本发明采用的技术方案

本发明所提供的降解ZEA的酿酒酵母912系从镇江市世业洲农业生态果园的桑葚中筛选分离到的，在YEPD固体培养基和麦芽汁液体培养基中28℃培养，进行形态学观察；对该菌株的5.8SrDNA-ITS区序列分析，进行分子生物学鉴定，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明所提供的酿酒酵母912的培养方法，其特征是固体培养基采用NYDA，pH7.0-9.0，培养温度26℃-28℃，时间36h，所述的培养基组成为牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，pH7.0-9.0，蒸馏水1000ml；液体发酵培养，采用发酵培养基NYDB或麦芽汁培养基中，所述NYDB液体培养基组成除不含琼脂外，其他成分同NYDA培养基；所述麦芽汁培养基制备方法为将大麦芽粉碎称重，加入4倍重量的水，于65℃水浴锅中保温糖化3-4h，糖化时每隔5min用玻璃棒搅拌一次，直至糖化完全。糖化液用4-6层纱布过滤，滤液中加入1％重量的鸡蛋清，将滤液置于高压灭菌锅里，升温至115℃并保持5min，使糖化液中的蛋白质沉淀下来，再用4-6层纱布过滤，除去沉淀，用手持糖度计检测糖化液残糖浓度，加水稀释将糖化液浓度调整至12⁰Brix，自然pH。

利用酿酒酵母912对玉米赤霉烯酮进行降解的方法，安照下述步骤进行：酵母初始浓度为10⁸CFU/mL，pH为6，摇床培养温度为28℃，转速为180rpm。当玉米赤霉烯酮初始浓度为3μg/mL时，36h后酵母对其降解率为100％；当玉米赤霉烯酮初始浓度为5μg/mL时，在24h内，酵母对其降解速率最大，48h后酵母对其降解率为100％；当玉米赤霉烯酮初始浓度为8μg/mL和10μg/mL时，72h后酵母对其降解率分别为95％和84％。

利用酿酒酵母912对玉米赤霉烯酮毒素主要产生菌禾谷镰刀球菌进行控制：酿酒酵母初始浓度为10⁹CFU/mL，培养温度为28℃，相对湿度为95％，采用PDA培养基进行恒温恒湿培养，可显著抑菌孢子浓度为10⁵spores/mL的禾谷镰刀菌生长。

本发明的优点：

(1)本发明所使用的酿酒酵母912，系从生态果园的桑葚中筛选得到，可高效降解ZEA毒素，降解率可达100％，并可明显抑制ZEA毒素产生菌禾谷镰刀菌的生长；且当ZEA初始浓度为5μg/mL时，24h内酵母对其降解速率最大，48h即可将ZEA毒素彻底降解为无毒产物。

(2)本发明使用的酿酒酵母912，经ICR小鼠急性毒性试验，确定其具有高度安全性，对人体无害，因此可应用于控制饲料及其原料、谷物及其制品等食品中的禾谷镰刀菌生长，并降解其产生的ZEA毒素，保障饲料及其原料、谷物及其制品等食品的食用安全性。

(3)本发明使用的酿酒酵母912，可替代化学杀菌剂应用于水果采后病害防治，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

附图说明

图1为本发明酿酒酵母912ITS区序列进化关系图；

图2酿酒酵母912对ZEA的降解效果；

图3不同浓度的酿酒酵母912对ZEA的降解能力；注：10^9：1×10⁹CFU/mL酿酒酵母菌悬液；10^8：1×10⁸CFU/mL酿酒酵母菌悬液；10^7：1×10⁷CFU/mL酿酒酵母菌悬液；10^6：1×10⁶CFU/mL酿酒酵母菌悬液；

图4不同培养温度下酿酒酵母912对ZEA的降解能力；

图5不同摇床转速下酿酒酵母912对ZEA的降解能力；

图6不同pH下酿酒酵母912对ZEA的降解能力；

图7酿酒酵母912对不同初始浓度的ZEA的降解作用；

图8酿酒酵母912对禾谷镰刀菌生长控制作用,注：1：为对照组，未加酿酒酵母菌悬液；2：所加酿酒酵母浓度为10⁶CFU/mL；3：所加酿酒酵母浓度为10⁷CFU/mL；4：所加酿酒酵母浓度为10⁸CFU/mL；5：所加酿酒酵母浓度为10⁹CFU/mL。

具体实施方式

实施例1：降解ZEA的酵母的筛选，具体实施步骤如下：

1、从环境中分离酵母单菌落

取桑葚，榨汁，取果汁1ml，加入装有10ml无菌水的离心管中，充分震荡混匀，取混匀液，做梯度稀释(10^-4，10^-5，10^-6，10^-7)，涂布在NYDA培养基平板上，28℃培养20～36h。挑取优势酵母单菌落，在NYDA平板上纯化培养。将分离并纯化后的菌株种到NYDA斜面，28℃培养48h，置于4℃冰箱短期保藏备用。

2、ZEA测定方法

采用高效液相-荧光检测器的方法(HPLC-FLD)检测ZEA，条件如下，色谱柱：安捷伦C₁₈柱(5.0μm,150.0mm×4.6mm)；流动相：乙腈:1％乙酸＝60:40流速：1.0mL/min；柱温：30℃进样量：20.0μL；检测波长：激发波长为236.0nm，发射波长为460.0nm。

3、降解ZEA酵母的筛选

(1)酵母菌悬液制备：将从桑葚汁分离出的酵母单菌落于NYDA培养基中培养48h；然后在含有50mLNYDB培养基的250mL的锥形瓶中，分别用无菌接种环接入两环活化好的酵母菌，在180rpm，28℃条件下摇床培养20h；培养完成后在7000×g，4℃条件下，离心10min，并用无菌生理盐水洗涤两次，以去除培养介质；最后用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球计数板将细胞浓度调节至实验所需浓度。

(2)降解ZEA酵母菌株的筛选：分别向装有5mLNYDB液体培养基的试管中加入适量ZEA储备溶液，调节ZEA的初始浓度约为5μg/mL；然后分别加入1mL浓度为1×10⁸CFU/mL的酵母菌悬液，在温度为28℃，摇床转速为180rpm的条件下培养酵母菌；同时，以未加酵母菌悬液仅加入ZEA的NYDB液体培养基作为阴性对照。分别在0h，24h，48h，72h，96h，168h取样，测定ZEA浓度。每个处理重复3次，整个实验重复2次。

(3)ZEA降解率的计算

ZEA降解率(％)＝(初始ZEA浓度–取样时样品中ZEA浓度)/初始ZEA浓度×100％

(4)降解ZEA酵母菌株的筛选结果

图2所示，在28℃摇床条件下培养一周后，所有未添加酵母菌株的NYDB培养基中，ZEA的浓度基本无变化，降解率几乎均为零，这说明在自然条件下ZEA的稳定性很强，很难被降解。本发明筛选的酵母912降解效果最好，培养1d后ZEA的降解率为48％，2d后在实验室条件下就已经检测不到ZEA的存在。

实施例2：酿酒酵母912的微生物学特性

上述菌株912，经过形态学培养、生理生化特征试验和小亚基5.8SrDNA和内转录间隔区ITS1和ITS2区碱基序列分析，鉴定为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

本发明的菌株酿酒酵母912菌株(已申请中国发明专利，申请号201310648466.8，发明名称：酿酒酵母、在水果采后病害防治的应用及使用方法，申请日：2013年12月04日)具有以下微生物学特性：

1、形态学特征

(1)在YEPD固体培养基平板(酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH6.0，115℃湿热灭菌20min)上28℃培养48h，菌落呈卵圆形、边缘整齐、乳白色、表面光滑、质地均匀、易挑起。

(2)在麦芽汁液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈椭圆形，细胞大小(3.5-5.3)×(2.7-4.5)μm，芽殖，单边出芽。

2、生理生化特性

本发明菌株碳源能够同化葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖纤维、木糖，不能同化淀粉。氮源能够同化硝酸盐，37℃可以生长。其生理特性结果见下表1。

表1酿酒酵母912的生理生化特征

3、分子遗传学鉴定

对筛选菌株酿酒酵母912小亚基5.8SrDNA-ITS区序列分析，在GenBank上检索，确定912为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序，构建生物进化关系树如图1。

实施例3：酿酒酵母912对ZEA降解条件的优化

通过研究菌液浓度、培养温度、摇床转速、培养基pH和不同ZEA初始浓度等条件下，酿酒酵母912对ZEA降解效果，确定了其对ZEA降解的最佳条件为酵母初始浓度为10⁸CFU/mL，pH为6，摇床培养温度为28℃，转速为180rpm，且随着ZEA初始浓度的增加，完全降解所需时间延长。当ZEA初始浓度为3μg/mL时，36h后酵母对其降解率为100％；当ZEA初始浓度为5μg/mL时，在24h内，酵母对其降解速率最大，48h后酵母对其降解率为100％；当ZEA初始浓度为8μg/mL和10μg/mL时，72h后酵母对其降解率分别为95％和84％。

该结果显示本发明酿酒酵母912可对ZEA标准品进行持续降解，ZEA标准品降解率可达100％，降解效果明显好于先前相关授权专利，如中国发明授权专利《玉米赤霉烯酮的微生物降解方法》(申请号201110459937.1)公开了一种用蜡样芽孢杆菌和或植物乳杆菌菌粉来降解ZEA的技术，文中介绍了蜡样芽孢杆菌和或植物乳杆菌菌粉对ZEA有显著降解效果，当蜡样芽孢杆菌、植物乳杆菌菌粉按1:1配比时降解效果最佳，其对ZEA标准品的总降解率为81.2％，且随着降解时间延长，ZEN的降解率趋于稳定，尚未进一步降解。中国发明授权专利《对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株及其应用》(申请号201010266489.9)公开了一株对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株及其在饲料、谷物中应用，其对谷物中ZEA降解率也只能达到70％～80％，且无法达到100％降解ZEA。

1、菌液浓度对降解ZEA能力的影响

附图3所示，酿酒酵母912初始浓度不同，对ZEA的降解速率也不同。当初始浓度为10⁶CFU/mL时，ZEA从0h开始被降解，在培养72h后，在实验条件下无法检测到ZEA的存在。当初始浓度为10⁷CFU/mL和10⁸CFU/mL时，在培养48h后，即无法检测到ZEA，且在前24h内酵母浓度为10⁸CFU/mL的降解速率明显比10⁷CFU/mL大。当初始浓度为10⁹CFU/mL时，前12h内降解速率最大，但之后降解速率明显减小，在培养72h后，ZEA并未被降解完，降解率为90％，这可能是由于酵母菌繁殖速度快，营养与空间的竞争影响了酵母菌的生长及代谢，使得ZEA的降解速率受到影响。

2、培养温度对降解ZEA能力的影响

附图4所示，培养温度不同，酿酒酵母912对ZEA的降解速率即不同。当培养温度为20℃时，在培养72h后，ZEA并未被完全降解完，降解率只有57％。当培养温度为37℃时，培养72h后ZEA的降解率为91％。当培养温度为28℃时，培养48h后在实验室条件下就已经检测不到ZEA的存在，降解效果最好，且在培养的前24h内酿酒酵母对ZEA的降解速率最大。

3、摇床转速对降解ZEA能力的影响

附图5所示，摇床培养时转速不同，酿酒酵母912对ZEA的降解率就不同。当静置培养或转速为90rpm时，培养72h后，ZEA未能被完全降解完，降解率分别为90％和92％,。当转速为120rpm和150rpm时，72h后在实验室条件下就检测不到ZEA的存在。当转速为180rpm时，培养48h后就检测不到ZEA。

4、培养基pH对降解ZEA的影响

附图6所示，当pH为2时，从培养的第36hZEA才开始逐渐被降解，到第72h时降解率为83％。当pH为4或6时，在培养48h后ZEA均被降解至实验室无法检测到的浓度，整体降解速率几乎一样。

5、不同ZEA初始浓度下的降解能力

附图7所示，ZEA初始浓度不同时，酿酒酵母912对其降解率就不同。当ZEA初始浓度为3μg/mL时，在培养36h后就无法检测到ZEA的存在；当ZEA初始浓度为5μg/mL时，培养48h后ZEA几乎被完全降解完；当ZEA浓度为8μg/mL和10μg/mL时，培养72h后ZEA并未被完全降解完，降解率分别为95％和84％。因此，ZEA浓度越低，酿酒酵母对其降解效果越好。

实施例4：酿酒酵母912安全性研究

供试动物为ICR小鼠，由江苏大学实验动物中心提供，清洁级。将小白鼠分成1020，1534，2831和5130mg/kg四个剂量组进行试验，每个剂量组10只小白鼠，雌雄各半。采用灌胃方式，按0.1ml/l0g体重(10000mg/kg剂量组按0.2ml/10g体重给受试物)进行实验。整个实验过程中，观察小白鼠的日常状况是否有中毒或死亡现象，若第4d继续出现死亡现象，需观察14d，必要时可延长到28d。记录死亡数，查表求出LD50，并记录死亡时间和中毒现象等，确定急性毒性的级别。

试验所用每克酵母冻干粉活菌数为10¹⁵cells，最小剂量活菌数为10¹²cells/ml，故远大于实际应用中浓度。表2所示，灌入酿酒酵母912的小白鼠7d内未出现死亡，且整个实验过程中小白鼠未出现中毒现象，根据急性毒性试验国标可以判定，酿酒酵母安全无毒。

该试验结果显示本发明酿酒酵母912安全无毒，对人体无任何伤害，这比先前现有相关专利应用更广，如，中国发明授权专利《一种降解玉米赤霉烯酮的方法》(申请号201110233738.9)提供了一种利用黑曲霉的发酵产物来降解发霉谷物中的玉米赤霉烯酮的技术，文中介绍了黑曲霉的发酵产物对ZEA标准品降解率为60.3％，对发霉玉米中ZEA降解率为58.8％，均无法达到100％的降解率，同时该发明尚不能阐明该黑曲霉发酵产物的安全性。

表2酿酒酵母912对小鼠急性经口毒性试验

实施例5：酿酒酵母912对ZEA主要产生菌禾谷镰刀球菌生长的抑制

用无菌打孔器在PDA培养基中间打孔，孔径为5mm，每孔注入50μL酵母菌悬液(浓度依次为10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁹CFU/mL)以无菌水作对照；静置3h后，每孔等量加入50μL孢子浓度为10⁵spores/mL的禾谷镰刀菌孢子悬液，保鲜膜密封后，置于温度为28℃，相对湿度为95％的恒温恒湿培养箱中培养5天，用游标卡尺量测定禾谷镰刀菌菌落直径，每个处理重复3次，整个实验重复2次。

实验结果表明，28℃下培养5天后，在不添加酿酒酵母912的对照组中禾谷镰刀菌菌落直平均直径为75.16mm，在酿酒酵母菌912浓度分别为10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁹CFU/mL的实验组中，禾谷镰刀菌菌落直平均直径为依次为66.79mm、63.84mm、56.84mm、42.33mm。附图8所示，未添加酿酒酵母的对照组，菌落直径最大，为禾谷镰刀菌菌落正常生长的状态。而添加不同浓度酿酒酵母菌912的实验组，菌落生长直径随酿酒酵母菌912浓度不断升高，禾谷镰刀菌菌落直径不断缩小，可以看出酿酒酵母可以明显抑制禾谷镰刀菌的生长；且以添加酵母菌浓度为10⁹CFU/mL的试验组，对禾谷镰刀菌的抑制效果最佳，其平均菌落直径由正常生长的75.16mm降低到42.33mm，降低了43.68％，说明本发明酿酒酵母912对ZEA主要产生菌禾谷镰刀菌的生长抑制作用显著。

该结果显示酿酒酵母912能显著抑制ZEA产生菌生长，而酿酒酵母912同时也能高效降解ZEA，这比先前现有相关专利应用更广，如，中国发明授权专利《一株枯草芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用》(申请号201310438739.6)提供了一株枯草芽孢杆菌在防治禾谷镰刀菌方面的应用的技术，文中介绍了该枯草芽孢杆菌对禾谷镰刀菌生长有显著的抑制作用，但未阐明其对ZEA是否具有降解作用。

实施例6：酿酒酵母912的保藏

本发明的酿酒酵母912，采用常规的菌种斜面保藏方法，采用培养基首选为NYDA培养基(牛肉膏0.8％，酵母浸出物0.5％，葡萄糖1％，琼脂2％)，也可以使用马铃薯琼脂培养基。在pH7.0～9.0，26℃～28℃，培养24h。在发酵培养时，可将斜面菌种直接接种至发酵培养基NYDB或者麦芽汁培养基中，pH7.0～9.0，温度26℃～28℃，摇床转速180r/min的培养条件下，培养24～30h。一般在24h左右可以达到最大生物量。

Claims (4)

1.酿酒酵母对玉米赤霉烯酮进行降解的方法，其特征在于按照下述步骤进行：酵母初始浓度为10⁸CFU/mL，pH为6，摇床培养温度为28?C，转速为180rpm。

2.权利要求1所述的酿酒酵母对玉米赤霉烯酮进行降解的方法，其特征在于酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae），保藏编号：CGMCCNo.7129。

3.权利要求1所述的酿酒酵母对玉米赤霉烯酮进行降解的方法，其特征在于酿酒酵母的培养方法按照下述步骤进行：，其特征是固体培养基采用NYDA，pH7.0-9.0，培养温度26℃-28℃，时间36h，所述的培养基组成为牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，pH7.0-9.0，蒸馏水1000ml；液体发酵培养，采用发酵培养基NYDB或麦芽汁培养基中，所述NYDB液体培养基组成除不含琼脂外，其他成分同NYDA培养基；所述麦芽汁培养基制备方法为将大麦芽粉碎称重，加入4倍重量的水，于65℃水浴锅中保温糖化3-4h，糖化时每隔5min用玻璃棒搅拌一次，直至糖化完全；糖化液用4-6层纱布过滤，滤液中加入1%重量的鸡蛋清，将滤液置于高压灭菌锅里，升温至115℃并保持5min，使糖化液中的蛋白质沉淀下来，再用4-6层纱布过滤，除去沉淀，用手持糖度计检测糖化液残糖浓度，加水稀释将糖化液浓度调整至12⁰Brix，自然pH。

4.酿酒酵母对玉米赤霉烯酮毒素主要产生菌禾谷镰刀球菌进行控制的方法，其特征在于按照下述步骤进行：酿酒酵母初始浓度为10⁹CFU/mL，培养温度为28?C，相对湿度为95%，采用PDA培养基进行恒温恒湿培养，可显著抑菌孢子浓度为10⁵spores/mL的禾谷镰刀菌生长。