CN108085261A - 一株酿酒酵母及其培养物和在饲料中的应用 - Google Patents

一株酿酒酵母及其培养物和在饲料中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5‑1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60243。本发明还公开了利用酿酒酵母5‑1制备的发酵液、培养物及培养物稀释液。本发明的酿酒酵母5‑1代谢产物对于病原细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌)具有极强的抑制作用，作为饲料添加剂添加到饲料中饲喂动物可有效地降低动物发病率，提高动物的生长性能，显著地改善动物肠道的微生物菌群，对养殖业的发展具有十分重要的意义。

Description

一株酿酒酵母及其培养物和在饲料中的应用
技术领域
本发明涉及饲料技术领域，尤其涉及一株酿酒酵母及其培养物在饲料中的应用。
背景技术
随着畜牧业规模化、专业化程度的不断提高，在促进了畜牧业的快速发展的同时，畜禽疫病也越来越复杂，给养殖业造成很大损失。目前，在饲料中添加抗生素等药物是目前防治疾病的常用手段。但这不仅容易造成动物胃肠道正常菌群失调，使动物对药物产生耐药性，而且药物的残留也给动物和人类的健康带来严重的危害。其中，酵母培养物作为饲料添加剂，因具有无毒副作用、无残留污染、不产生耐药性且可部分替代抗生素等优点而引起人们广泛关注。它通过活酵母细胞或其他活性因子改善动物胃肠道微生态环境，促进微生物蛋白质合成，从而提高肠道内营养物质的消化与吸收。酵母培养物还可在肠道中竞争性抑制病原微生物生长，改善肠壁结构与形态，抑制霉菌毒素的危害。因此，酵母培养物在畜禽饲养与饲料工业上的应用具有重要意义。
但是，目前常用的酵母培养物的固体发酵方法存在以下问题：酵母菌种活力低，酵母菌数量不达标，而且酵母不能充分利用固体发酵原料，导致发酵效果低，经济成本也较高，造成在动物饲喂当中效果并不显著。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明公开了一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60243。
本发明还公开了一种酿酒酵母发酵液，由上述的酿酒酵母5-1发酵得到。
本发明还公开了上述酿酒酵母发酵液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取酿酒酵母5-1，在酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基上用平板划线法划线，28-30℃培养24-48h，得到该菌株的单克隆；
(2)挑取单克隆接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，24-30℃培养 12-24h得到种子液；
(3)将种子液接种于酿酒酵母液体发酵培养基中，按体积算，接种量为 0.5-5％，28-30℃培养15-36h。
其中，所述酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基包括如下的配比组分：酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；
其中，所述酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基包括如下的配比组分：酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；
其中，所述液体发酵培养基包括如下的配比组分：玉米浆干粉5～100g/L，柠檬酸铵10～100g/L，七水硫酸锌0.1～1g/L，无水硫酸镁0.5～5g/L，氯化钙 0.1～5g/L，磷酸二氢钾0.1～5g/L，葡萄糖20～50g/L；进一步地，所述液体发酵培养基包括如下配比的组分：玉米浆干粉5～10g/L，柠檬酸铵15～20g/L，七水硫酸锌0.1～0.5g/L，无水硫酸镁0.5～2.5g/L，氯化钙0.1～2.5g/L，磷酸二氢钾0.1～2.5g/L，葡萄糖20～25g/L。
本发明还公开了一种酿酒酵母培养物，将上述酿酒酵母5-1液体发酵后得到酿酒酵母发酵液，再将酿酒酵母发酵液接种到固体发酵底料中固体发酵，最后烘干粉碎得到。
所述酿酒酵母培养物的制备方法为：将酿酒酵母发酵液按每克干物质含酵母菌10-20亿个的接种量接种到固体发酵底料，于30-40℃的条件下密闭发酵24-72小时，再将发酵产物于50-60℃通过管束干燥机和活态烘干塔两级低温干燥即可得到酿酒酵母培养物。所述固体发酵底料的配方为：以重量计，取玉米粉50-70％，麸皮5-15％，玉米蛋白粉5-20％，豆粕5-15％，酒糟15-35％，测出其中的含水量，计算出干物质的重量，将葡萄糖按照干物质重量的5-15％加入其中，最后加水调整含水量至40-60％。
本发明还公开了一种酿酒酵母培养物稀释液，含有上述酿酒酵母培养物。
所述酿酒酵母培养物稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取10-100g酵母培养物于150-500mL无菌锥形瓶中，加入20-200 mL无菌生理盐水，150-200rpm振荡混匀20-40min，1500-3000r/min离心 10-30min，得到上清液，即为酵母培养物原液；
(2)将酵母培养物原液梯度稀释1-10倍，即为酵母培养物稀释液。
本发明还公开了所述酿酒酵母5-1、酿酒酵母培养物、酿酒酵母培养物稀释液在制备饲料添加剂中的应用。
本发明的有益效果
(1)本发明公开的酿酒酵母5-1，菌体生长快、酶系丰富，其发酵代谢产物中富含小肽、氨基酸、维生素、有机酸和酵母细胞壁多糖，其含量远远高于已报道的同种菌株，能够有效地提高动物的生长性能，显著地改善动物肠道的微生物菌群，在饲料添加剂领域具有较好的应用前景。
(2)本发明公开的酿酒酵母5-1，其代谢产物对于病原细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌)具有极强的抑制作用，因其特殊的抑菌作用，作为饲料添加剂添加到饲料中饲喂动物可有效地降低动物发病率，对养殖业的发展具有十分重要的意义。
(3)本发明通过两级低温干燥，有效地保存酵母活菌数量和产品中富含的生物活性物质，同时有效地避免了饲料原料中营养成分的流失。
(4)本发明有效利用酿酒的副产物酒糟，成本低廉，同时减少了环境污染。
(5)本发明利用酿酒酵母充分发酵底料，不易被动物利用的营养成分被酿酒酵母充分吸收转化，转化为酵母菌细胞成分，增加了饲料营养价值。
保藏信息
本发明的酿酒酵母5-1，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 5-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:60243，保藏日期为2017年9月13日。
说明书附图
图1为酿酒酵母5-1的18S rDNA系统发育进化树；
图2为酿酒酵母5-1培养物稀释液对大肠杆菌的抑菌作用；
图3为酿酒酵母5-1培养物稀释液对金黄色葡萄菌的抑菌作用；
图4为酿酒酵母5-1培养物稀释液对肠炎沙门氏菌的抑菌作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，下述实施例中的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂市场购买得到。
实施例1：酿酒酵母5-1的分离、筛选、鉴定及保存
1、目标菌株的获得
采集山东烟台市某苹果园地表土壤样品，称取10g样品，收集于150mL 灭过菌三角瓶内，加入90mL无菌生理盐水，加入无菌玻璃珠30个，振荡培养 3～5h后取1mL土壤悬浮液加至富集培养基(富集培养基：葡萄糖50g/L， (NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2.5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，酵母膏0.5g/L，上述材料灭菌后加亚硫酸钠至30mg/L。)中，28℃恒温培养2d ～3d，得到增殖培养液，将增殖培养液梯度稀释后吸取0.1mL加入到酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，28℃恒温培养2d～3d，待长出菌落后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落划线分离2～3次。经镜检为纯种，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基培养后4℃保存，待用。
2、菌株形态学特征鉴定
取纯化菌株(命名为5-1)的单菌落，转接到酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板上，于28℃恒温培养箱中培养3d。菌落特征表现为中间凸起，表面光滑，不透明；细胞一端略小，近卵圆形或柠檬形，两端或多端出芽生殖。
3、该株菌生理生化特征：
对酵母菌进行生理生化试验。结果显示，美蓝染色为阳性；硝酸盐还原阴性；耐有机酸；产类淀粉阴性；产酯阳性；产蛋白酶阳性；产凝乳酶阴性；缺维生素培养阴性；不能在5％NaCl中生长；能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉，且葡萄糖的利用率最高。不能利用半乳糖、乳糖、柠檬糖、木糖、山梨糖；能以蛋白胨、硝酸铵和硫酸铵为唯一N源；
4、菌株的分子生物学鉴定
采用18S rDNA通用引物，NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′；NS2： 5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′。50μL PCR反应体系：10×Taq buffer 5.0 μL、2.5mmol/LdNTP5.0μL、上游引物(10pmol/L)2.0μL、下游引物(10pmol/L) 2.0μL、2U/LTaq酶0.5μL、DNA模板1.0μL、双蒸水34.6μL。循环参数：95℃预变性5min，95℃变性40s，45℃退火40s，72℃延伸40s，体系运行34 个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。产物经纯化后送上海生物工程有限公司测序。
5、系统进化树构建
测序及数据分析将获得的18S rDNA序列在NCBI网站上利用BLAST程序进行核酸序列的比对分析。用MEGA5.1软件构建系统发育树并分析，见图1。
经序列多重比对和系统进化树构建，发现菌株5-1与酿酒酵母菌属(Saccharomyces cerevisiae)菌株高度相关，说明该菌株是酿酒酵母属的成员。在用邻接法构建的系统进化树上，菌株5-1与该属有效发表种酿酒酵母菌的典型菌株(Z75578)以极高的18S rRNA基因序列相似性(99％)聚在1个系统进化分支上(图1,酿酒酵母5-1的18SrDNA系统发育进化树)，将菌株5-1初步鉴定为酿酒酵母菌，命名为酿酒酵母5-1。
实施例2：酿酒酵母5-1液体发酵液的制备方法
酿酒酵母5-1液体发酵液的制备方法如下所述：
(1)将酿酒酵母5-1在酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基上用平板划线法划线，30℃培养48h，得到该菌株的单克隆；
(2)挑取单克隆接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，30℃培养15h，酵母菌数达到2.0×108CFU/mL，得到种子液；
(3)取上述的种子液，接种于酿酒酵母液体发酵培养基中，接种量为2％ (v/v)，30℃，150rpm培养24h，酵母菌数达到3.0×108CFU/mL。
实施例3：酿酒酵母5-1培养物的制备方法
酿酒酵母5-1培养物的制备方法如下所述：
(1)按以下质量百分比称取玉米60％、麸皮5％、玉米蛋白粉5％、豆粕 5％、酒糟25％后粉碎，测出其含水量，计算出干物质的重量，然后混匀，获得基质，将葡萄糖按照干物质重量的5％加入到基质中，加水调整含水量至40％。
(2)将实施例2制备得到的发酵液按每克干物质含酵母菌10亿个接种。
(3)将接好菌种的基质在30～40℃条件下发酵72h，然后将固体发酵物在50℃通过管束干燥机和活态烘干塔两级低温干燥，即得到酵母培养物。
实施例4：酿酒酵母5-1培养物稀释液的制备方法
(1)称取50g实施例3制备的酵母培养物于250mL无菌锥形瓶中，加入 100mL无菌生理盐水，150rpm振荡混匀30min，2500r/min离心10min，保留上清液，为酵母培养物原液；
(2)将酵母培养物原液梯度稀释1～10倍，即为酵母培养物稀释液。
实施例5：酿酒酵母5-1培养物稀释液对细菌的抑制作用
(1)分别挑取致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC6538、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis) ATCC13076并接种于新鲜营养肉汤培养基中，置于37℃恒温箱中培养了18～24 h时制成菌液备用。
(2)用实施例4中的方法制备的酵母培养物原液(记为原液)及2×稀释液、5×稀释液和10×稀释液。
(3)用微量移液器取步骤(1)的菌液30μL置于冷却至50℃的灭过菌的营养琼脂，摇匀后倒入平板内。
(4)待平板凝固后，用5mm打孔器打孔，吸取原液、2×稀释液、5×稀释液、10×稀释液各100μL至孔中，然后将培养皿正面放置37℃恒温培养箱中培养18～24h，测量抑菌圈的直径，结果如表1所示。
表1.酵母培养物稀释液对致病菌的抑菌直径
注：试验设3个重复，取值为平均值。
由表1可知，酿酒酵母5-1培养物原液及稀释液对致病菌具有良好的抑制作用。尤其是对金黄色葡萄球菌，原液的抑菌圈直径为28.62±0.55mm，10×稀释液的抑菌圈直径为15.22±2.1mm，仍具有很好的抑菌效果；另外，酵母培养物稀释液对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌也具有抑菌效果。说明，在日粮中添加酵母培养物可以很好地抑制动物肠道中的致病菌，增加动物免疫，减少动物疾病的发生。
实施例6：酿酒酵母5-1培养物对保育猪生长性能和粪便微生物数量的影响
采用单因素随机区组设计，选择健康、平均体重为(15.70±0.26)kg的“杜×长×大”杂交生长猪225头，随机分配到3个处理组，每组3个重复，每个重复45头。①对照组：饲喂基础日粮；②试验1组：基础日粮按5g/kg标准市售同类产品；③试验2组：基础日粮5g/kg标准添加酵母培养物。整个试验过程(60 d)中，保育栏的温度都控制在2–27℃，自由饮水和采食。所有日粮都根据 NRC的营养需要配制。在试验开始和结束时测定采食量和体重以测定平均日增重、平均日采食量和增重/耗料比。
于试验第60天，每个重复随机选取5头猪采集新鲜粪样，-20℃保存，用于测定大肠杆菌和乳酸菌数量。大肠杆菌采用麦康凯培养基，37℃培养24h。乳酸菌采用乳酸菌培养基(MRS)，37℃培养36h。微生物数量以每克粪便中所含菌群总数的对数[lg(CFU/g)]表示，结果如表2、表3所示。
表2酿酒酵母5-1培养物对保育猪生长性能的影响
表3酿酒酵母5-1培养物对保育猪粪便微生物数量的影响
上述表2、表3中，同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。试验数据用Excel进行初步整理，并采用SPSS 18.0统计软件进行独立样本T-test分析，以P<0.05表示差异显著，P <0.10为差异趋势性判断标准；结果采用平均值±标准误表示。
由表2可知，饲喂60天后，试验2组的保育猪平均末体重、平均日增重、平均日采食量均显著高于对照组和试验1组；试验2组的料重比和腹泻率均显著低于对照组和试验1组。说明饲料中添加酵母培养物可以显著改善保育猪的生长性能。
表3表明，试验2组乳酸菌数显著高于对照组和试验1组；试验2组大肠杆菌数显著低于对照组和试验1组；试验2组乳酸菌/大肠杆菌数显著低于对照组和试验1组。说明饲料中添加酵母培养物可以显著增加保育猪肠道中乳酸菌数量和减少大肠杆菌数量，有效地改善其肠道微生物菌群。
由上可见，本产品酵母培养物具有较强的抑菌作用，能够很好地预防畜禽疾病的发生，同时在动物饲喂当中该酵母培养物显著提高采食量、增重率等生理指标，极大地满足了养殖业的需求。
综上所述，但本发明并不局限于上述实施方式，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> OrganizationName : 深圳市善成生物技术有限公司
<120> 一株酿酒酵母及其培养物和在饲料中的应用
<130> AppFileReference :
<140> CurrentAppNumber :
<141> 2017-12-29
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1705
<212> RNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
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Claims (10)

1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60243。
2.一种酿酒酵母发酵液，其特征在于：由权利要求1所述的酿酒酵母5-1液体发酵得到。
3.如权利要求2所述的酿酒酵母发酵液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取酿酒酵母5-1，在酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基上用平板划线法划线，28-30℃培养24-48h，得到该菌株的单克隆；
(2)挑取单克隆接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，24-30℃培养12-24h得到种子液；
(3)将种子液接种于酿酒酵母液体发酵培养基中，按体积算，接种量为0.5-5％，28-30℃培养15-36h。
4.一种酿酒酵母培养物，其特征在于：将权利要求1所述的酿酒酵母5-1液体发酵后得到酿酒酵母发酵液，再将酿酒酵母发酵液接种到固体发酵底料中固体发酵，最后烘干粉碎得到。
5.如权利要求4所述的酿酒酵母培养物的制备方法，其特征在于：所述固体发酵方法为：将酿酒酵母发酵液按每克干物质含酵母菌10-20亿个的接种量接种到固体发酵底料，于30-40℃的条件下密闭发酵24-72小时，再将发酵产物于50-60℃通过管束干燥机和活态烘干塔两级低温干燥即可得到酿酒酵母培养物，所述固体发酵底料的配方为：以重量计，取玉米粉50-70％，麸皮5-15％，玉米蛋白粉5-20％，豆粕5-15％，酒糟15-35％，测出其中的含水量，计算出干物质的重量，将葡萄糖按照干物质重量的5-15％加入其中，最后加水调整含水量至40-60％。
6.一种酿酒酵母培养物稀释液，其特征在于：含有权利要求4所述的酿酒酵母培养物。
7.如权利要求6所述酿酒酵母培养物稀释液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)称取10-100g酿酒酵母培养物于150-500mL无菌锥形瓶中，加入20-200mL无菌生理盐水，150-200rpm振荡混匀20-40min，1500-3000r/min离心10-30min，得到上清液，即为酵母培养物原液；
(2)将酵母培养物原液梯度稀释1-10倍，即为酵母培养物稀释液。
8.如权利要求1所述酿酒酵母5-1在制备饲料添加剂中的应用。
9.如权利要求4所述酿酒酵母培养物在制备饲料添加剂中的应用。
10.如权利要求6所述酵母培养物稀释液在制备饲料添加剂中的应用。
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