CN101690545A - 一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法，其根据各个菌种的作用原理和特点，采取了科学组合，并且添加了酶制剂和酸化剂，使产品中的微生物能够在发酵饲料及动物体内快速生长占据优势，减少了其杂菌的生长机会。其成分包括：枯草芽孢杆菌，植物乳杆菌，产朊假丝酵母，嗜酸乳杆菌，蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶、柠檬酸，本产品各个菌种均采取液态深层发酵培养，保证了产品的无污染性。液态菌剂保证产品菌落数超过1亿，无其他杂菌污染；固态菌剂保证产品菌落数超过10亿，杂菌数占有效菌数比例不超过万分之一。本发明中含有芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌，既可适用于制作青黄贮饲料、发酵饲料、饲料浸泡等工艺，又可直接添加于饲料中饲喂，可提高反刍动物、家禽类、猪、水产类及特种动物的生长性能。

Description

一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法

技术领域

本发明涉及一种菌和酶的复合微生物制剂。

技术背景

抗生素作为畜禽的饲用添加剂，由于在畜禽产品中的残留和抗药性等问题，许多国家已严格限制甚至禁止使用。为了寻求替代物，世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)以及美、日等国极为重视抗生素替代物的研制。我国也非常重视这方面的研究，制订了“饲料添加剂品种选用目录”等规范文件。目前，美、日、欧洲、中南美洲、东南亚等地均在使用饲用活菌剂，并证实对畜禽及其产品无害、无残留、无污染、无耐药性，具有替代抗生素的发展前景。我国对此报道也很多，其主要作用原理和效果主要有以下几个方面：

(一)补充动物肠道正常菌群。动物微生态制剂中的有益菌是畜禽肠道内的“原藉菌”，是肠道内正常的生理性细菌，这些“原藉菌”均为专性厌氧或兼性厌氧菌。畜禽服用动物微生态制剂后，肠道内的正常菌群便得到补充，“原藉菌”在数量上便占绝对优势，通过生存竞争排斥，生长代谢造成厌氧环境，就大大抑制了那些需氧性致病菌的生长繁殖，其发酵结果是产生大量乳酸、乙酸，降低肠道内pH值，使致病菌难以生存，从而有效防止菌群失调症的发生。

(二)提高机体免疫力。动物微生态制剂中的有益菌均是良好的免疫激活剂，它们刺激肠道黏膜固有层中淋巴细胞的转化，使之产生体液免疫和细胞免疫，增强机体免疫力，及时杀灭侵人体内的致病菌，消除体内“病变”细胞，从而防止疾病发生和恶化。

(三)协助机体清除毒素及代谢产物。动物微生态制剂中的有益菌在肠道内生长能形成致密性膜菌群，形成生物屏障阻止毒素和废物的吸收。如双歧杆菌能分泌过氧化氢等物质直接降解细菌毒素及代谢产物，它与乳酸杆菌在肠道内繁殖可产生大量乳酸和乙酸刺激胃肠蠕动，也有利于毒素和废物的排泄，从而减轻肝脏负担，防止肝脏疾病的发生和发展。

(四)补充机体营养成分。动物微生态制剂中的有益菌在肠道内代谢所产生的多种酶制剂、氨基酸、维生素以及其他一些代谢产物，可加快分解营养物质或直接作为营养物质被畜禽机体吸收利用，促进畜禽的生长发育和增重。

此项技术存在的不足：

1、农业部在2003年至2008年多次颁布了“饲料添加剂品种目录”及其补充修订版，其中对饲料用微生物的菌种做出了明确的规定，防止病原菌或潜在致病菌对饲料及畜禽构成威胁。但是国内大多没有按照此项要求规定的菌种范围选用菌种，因此存在着潜在的致病危险。

2、大多数微生态制剂中菌种选用没有遵循互补原则，在上述的微生态制剂几大功能中，并非是单个菌株或一个同类的菌群即可起到效果，应需要几种不同类微生物菌的协同作用才能起到上述效果。

3、国内大多微生态制剂生产采用固体发酵等粗放工艺，生产的产品往往目的菌群和污染的杂菌共同存在，严重的影响了产品的使用效果。

发明内容

本发明目的在于提供一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法，该微生态制剂添加在饲料中，可减少杂菌的生长，保证产品无污染，使产品中的微生物能够在发酵饲料及动物体内快速生长。

本发明的技术方案是：

一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法，成分包括：枯草芽孢杆菌(CICC10088)，植物乳杆菌(CICC6026)，产朊假丝酵母(CICC1801)，嗜酸乳杆菌(CICC6005)，蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶、柠檬酸；

A、液体菌剂与酶复合微生态制剂，把枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌∶产朊假丝酵母的发酵液∶液体复合酶制剂∶柠檬酸按照1∶2∶2∶1∶3∶1的重量比混合制成；

B、固态菌剂与酶复合微生态制剂，先把各菌剂的液态发酵剂加入10％的稻糠，过滤后烘干，控制烘干温度30-50℃，水分要求在4-8％，混合加入各种固体酶制剂、柠檬酸和稻糠制成，重量比为粉状枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌∶产朊假丝酵母∶固体复合酶制剂∶柠檬酸0.5∶2∶2∶2∶2∶1.5。

所述复合酶的制备：

A、液体复合酶制剂：蛋白酶4000u/ml、淀粉酶1000u/ml、纤维素酶5000u/ml、木聚糖酶10000u/ml、甘露聚糖酶1000u/ml、半乳糖苷酶1000u/ml、果胶酶1000u/ml，剩余为水；

液体复合酶的制备，通过液态发酵生产液体各单酶种，把各单酶种根据酶活需求按比例混合制，各种酶的比例添加量由各酶种的单酶酶活决定；

B、固体复合酶制剂：蛋白酶4000u/ml、淀粉酶1000u/ml、纤维素酶5000u/ml、木聚糖酶10000u/ml、甘露聚糖酶1000u/ml、半乳糖苷酶1000u/ml、果胶酶1000u/ml，剩余为稻糠填充料；

固体复合酶的制备，通过液态发酵生产固体各单酶种，把各单酶种根据酶活需求按比例混合制，各种酶的比例添加量由各酶种的单酶酶活决定。

所述枯草芽孢杆菌培养：

(1)枯草芽孢杆菌分离培养：

营养琼脂培养基：蛋白胨0.5％、牛肉膏3％、氯化钠0.5％、琼脂粉1.5％、pH值7.0-7.2、37℃培养24-48h；

(2)斜面培养：

培养基：牛肉膏1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、pH值7.0、37℃培养24-48h；

(3)种子培养：

培养基：葡萄糖5％、牛肉膏1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、pH值7.0；500ml三角瓶装入100ml液体种子培养基，121℃灭菌30min，接入以上培养好的菌种一接种环，温度37℃，在转速为210r/min摇床上震荡培养16h；

(4)发酵培养：

培养基：高温豆饼粉2.2％、玉米浆0.15％、玉米淀粉0.85％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、pH值7.5(消前)；温度37℃，通风量为1∶0.8条件下培养36-48h，菌落数超过10亿。

所述乳酸菌培养：

(1)乳酸菌分离培养：

MRS培养基制备：葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·H₂O 0.25g，吐温80为1mL，蒸馏水1L，琼脂20g。用醋酸调节pH到6.8，121℃高压灭菌20min，37℃培养24-48h；

(2)斜面培养：

MRS培养基制备：葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·H₂O 0.25g，吐温80为1mL，蒸馏水1L，琼脂20g。用醋酸调节pH到6.8，121℃高压灭菌20min，37℃培养24-48h；

(3)种子培养：

培养基：脱脂乳粉调整固形物含量11％左右，加蔗糖6％，玉米浆10％，37℃培养24-48h；

(4)发酵培养：

培养基：脱脂乳粉调整固形物含量11％左右，加蔗糖6％左右，玉米浆10％，磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、植物乳杆菌pH值6.5(消前)，嗜酸乳杆菌pH值5.8(两个菌种其他部分培养工艺相同)，温度37℃，厌氧培养36-48h，菌落数超过10亿。

所述酵母菌培养：

(1)酵母菌离培养：

培养基：将发酵啤酒的原料(未加酒花)，稀释至12柏林，加琼脂1.5％，溶化后分装，115℃灭菌30分钟，28℃培养24-48h；

(2)斜面培养培养：

平板培养基加1.5-2％的琼脂28-30℃培养3-4天；

(3)发酵培养：

培养基：酪蛋白胨15g/L，酵母粉25g/L，葡萄糖30g/L，磷酸二氢钾2.4g/L，磷酸氢二钾16.34g/L，温度30℃，通风量1∶0.8，培养48小时，菌落数超过10亿；

本发明的有益效果在于：

1、本发明选用的菌株均是2008版“饲料添加剂品种目录”中规定的菌种。

2、根据各个菌种的作用原理和特点，采取了科学组合，并且添加了酶制剂和酸化剂，使产品中的微生物能够在发酵饲料及动物体内快速生长占据优势，减少了其杂菌的生长机会

3、本产品各个菌种均采取液态深层发酵培养，保证了产品的无污染性。

4、液态菌剂保证产品菌落数超过1亿，无其他杂菌污染；固态菌剂保证产品菌落数超过10亿，杂菌数占有效菌数比例不超过万分之一。

5、本发明中含有芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌，即可适用于制作青黄贮饲料、发酵饲料、饲料浸泡等工艺，又可直接添加于饲料中饲喂，可提高反刍动物、家禽类、猪、水产类及特种动物的生长性能。

附图说明

图1是添加本产品对断奶仔猪性能的影响的条型对比图。

具体实施方式

取液体原始单酶：蛋白酶100000u/ml，淀粉酶40000u/ml，纤维素酶50000u/ml，木聚糖酶200000u/ml，甘露聚糖酶10000u/ml，半乳糖苷酶10000u/ml，果胶酶，20000u/ml，制备液体复合酶：蛋白酶4000u/ml、淀粉酶1000u/ml、纤维素酶5000u/ml、木聚糖酶10000u/ml、甘露聚糖酶1000u/ml、半乳糖苷酶1000u/ml、果胶酶1000u/ml，则需要蛋白酶4％，淀粉酶2.5％，纤维素酶10％，木聚糖酶5％，甘露聚糖酶10％，半乳糖苷酶10％，果胶酶5％，水53.5％。

取固体原始单酶：蛋白酶100000u/g，淀粉酶40000u/g，纤维素酶50000u/g，木聚糖酶200000u/g，甘露聚糖酶10000u/g，半乳糖苷酶10000u/g，果胶酶，20000u/g，制备液体复合酶：蛋白酶4000u/g、淀粉酶1000u/g、纤维素酶5000u/g、木聚糖酶10000u/g、甘露聚糖酶1000u/g、半乳糖苷酶1000u/g、果胶酶1000u/g，则需要蛋白酶4％，淀粉酶2.5％，纤维素酶10％，木聚糖酶5％，甘露聚糖酶10％，半乳糖苷酶10％，果胶酶5％，稻糠53.5％。

一、芽孢杆菌活菌含量检测

1.培养基

营养琼脂培养基。

2.用具及试剂

超净工作台、灭菌平皿、酒精灯、灭菌试管15x150型及18x180型(放入几粒玻璃珠并加棉塞)、5000/1000/200μL灭菌枪头、无菌水、玻璃涂棒、培养箱。

3.步骤

3.1制备平板

将营养琼脂培养基灭菌后待冷至55～60℃时倒平板，右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻拨出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上待凝，培养基凝固后将平板倒置于37℃培养箱中24h进行无菌检测，无杂菌污染者备用。

3.2有效菌数及杂菌率的测定

以无菌操作将经过充分混匀的试样5g，放入含有495mL无菌水带玻璃珠的灭菌三角瓶内，静置20min后置于旋转式摇床上，以200r/min的转速摇60min，即成1％的稀释液。

用经过灭菌的1mL吸管吸取1％的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL无菌水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，混匀成1∶1000稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1∶1×10³，1∶1×10⁴，1∶1×10⁵，1∶1×10⁶，1∶1×10⁷，1∶1×10⁸等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。

用1mL无菌吸管分别吸取稀释度为1∶1×10⁶，1∶1×10⁷，1∶1×10⁸的稀释液0.1mL，加至平皿内的无菌培养基表面，用无菌玻璃刮铲将菌悬液均匀地涂布于培养基表面。每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照，37℃培养20～40h，每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。

3.3菌落计数

以平板上出现30～300个菌落数的稀释度平板为计数标准。

当只有一个稀释度，其平均菌落数在30～300之间，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数；若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300之间，应按两者菌落总数之比值来确定；若其比值小于等于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释度较小的菌落总数；若三个稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；若三个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数；若三个稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。

3.4计算

X1＝A×B

式中：X1-----每克样品中杂菌数(个/克)

A------最终计数的菌落总数

B------稀释倍数

Y＝X1/X0×100％

式中：Y------产品中的杂菌率(％)

X1-----每克样品中杂菌数(个/克)

X0-----每克样品中的芽孢菌数(个/克)

二、乳酸菌活菌含量测定

1.培养基

MRS培养基：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，K₂HPO₄ 2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，Tween801ml，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄4H₂O 0.25g，琼脂20g，灭菌CaCO₃10g，蒸馏水1000ml。调pH6.2-6.4，116℃灭菌15min。

2.用具及试剂

超净工作台、灭菌平皿、酒精灯、灭菌试管15x150型及18x180型(放入几粒玻璃珠然后加棉塞)、5000/1000μL灭菌枪头、无菌水、培养箱。

3.步骤

3.1制备稀释液

以无菌操作将经过充分混匀的试样5g(液体产品取5mL)，放入含有495mL无菌水带玻璃珠的灭菌三角瓶内，静置20min后置于旋转式摇床上，以200r/min的转速摇60min，即成1％的稀释液。

用经过灭菌的1mL吸管吸取1％的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL无菌水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，混匀成1∶1000稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1∶1×10³，1∶1×10⁴，1∶1×10⁵，1∶1×10⁶，1∶1×10⁷，1∶1×10⁸等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。

3.2加样倒平板

吸取上述适当浓度的稀释液1ml，小心地滴在平皿中央位置，将营养琼脂培养基灭菌后待冷至55～60℃时倒平板，右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻拨出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基与菌液混合均匀。

3.3培养

待培养基凝固后将平板倒置于37℃温室中培养48-72h。

3.4菌量计数

选择菌落在30-300个的平板进行计数，根据稀释倍数计算出菌量。

菌落计数及计算方法同上述芽孢菌计算方法。

三、酵母菌含量检测

1.培养基

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。121℃灭菌15min马铃薯去皮洗净，称取20g，切成小块，放入1000ml水中煮沸20min，四层纱布过滤，得马铃薯汁，补足水分，再加糖溶解。PH自然

2.用具及试剂

超净工作台、灭菌平皿、酒精灯、灭菌试管15x150型及18x180型(放入几粒玻璃珠然后加棉塞)、5000/1000μL灭菌枪头、无菌水、培养箱。

3.步骤

3.1制备稀释液

以无菌操作将经过充分混匀的试样5g(液体产品取5mL)，放入含有495mL无菌水带玻璃珠的灭菌三角瓶内，静置20min后置于旋转式摇床上，以200r/min的转速摇60min，即成1％的稀释液。

用经过灭菌的1mL吸管吸取1％的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL无菌水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，混匀成1∶1000稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1∶1×10³，1∶1×10⁴，1∶1×10⁵，1∶1×10⁶，1∶1×10⁷，1∶1×10⁸等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。

3.2加样倒平板

用1mL无菌吸管分别吸取稀释度为1∶1×10⁶，1∶1×10⁷，1∶1×10⁸的稀释液0.1mL，加至平皿内的无菌培养基表面，用无菌玻璃刮铲将菌悬液均匀地涂布于培养基表面。每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照。

3.3培养

待培养基凝固后将平板倒置28℃培养24-48h。每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。

3.4菌量计数

选择菌落在30-300个的平板进行计数，根据稀释倍数计算出菌量。

菌落计数及计算方法同上述芽孢菌计算方法。

下面是本发明产品用于玉米秸秆青贮的效果：

试验玉米秸秆青贮后的表观变化和原料营养成分分析：添加量为1％(液体产品)

本产品用于仔猪饲喂的效果：

在玉米-豆粕日粮中添加本产品对断奶仔猪性能的影响，添加量为0.5％(固体产品)。

Claims (5)

1.一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法，成分包括：枯草芽孢杆菌，植物乳杆菌，产朊假丝酵母，嗜酸乳杆菌，蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶、柠檬酸，其特征是：

A、液体菌剂与酶复合微生态制剂，把枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌∶产朊假丝酵母的发酵液∶液体复合酶制剂∶柠檬酸按照1∶2∶2∶1∶3∶1的重量比混合制成；

B、固态菌剂与酶复合微生态制剂，先把各菌剂的液态发酵剂加入10％的稻糠，过滤后烘干，混合加入各种固体酶制剂、柠檬酸和稻糠制成，重量比为粉状枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌∶产朊假丝酵母∶固体复合酶制剂∶柠檬酸0.5∶2∶2∶2∶2∶1.5。

2.根据权利要求1所述的一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法，其特征是复合酶的制备：

A.液体复合酶制剂，蛋白酶4000u/ml、淀粉酶1000u/ml、纤维素酶5000u/ml、木聚糖酶10000u/ml、甘露聚糖酶1000u/ml、半乳糖苷酶1000u/ml、果胶酶1000u/ml，剩余为水；

液体复合酶的制备，通过液态发酵生产液体各单酶种，把各单酶种根据酶活需求按比例混合制，各种酶的比例添加量由各酶种的单酶酶活决定；

B、固体复合酶制剂：蛋白酶4000u/ml、淀粉酶1000u/ml、纤维素酶5000u/ml、木聚糖酶10000u/ml、甘露聚糖酶1000u/ml、半乳糖苷酶1000u/ml、果胶酶1000u/ml，还含有稻糠填充料；

固体复合酶的制备，通过液态发酵生产固体各单酶种，把各单酶种根据酶活需求按比例混合制，各种酶的比例添加量由各酶种的单酶酶活决定。

3.根据权利要求1所述的一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法，其特征是枯草芽孢杆菌培养：

(1)枯草芽孢杆菌分离培养：

营养琼脂培养基：蛋白胨0.5％、牛肉膏3％、氯化钠0.5％、琼脂粉1.5％、pH值7.0-7.2、37℃培养24-48h；

(2)斜面培养：

培养基：牛肉膏1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、pH值7.0、37℃培养24-48h；

(3)种子培养：

培养基：葡萄糖5％、牛肉膏1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、pH值7.0；500ml三角瓶装入100ml液体种子培养基，121℃灭菌30min，接入以上培养好的菌种一接种环，温度37℃，在转速为210r/min摇床上震荡培养16h；

(4)发酵培养：

培养基：高温豆饼粉2.2％、玉米浆0.15％、玉米淀粉0.85％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、pH值7.5；温度37℃，通风量为1∶0.8条件下培养36-48h，菌落数超过10亿。

4.根据权利要求1所述的一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法，其特征是乳酸菌培养：

(1)乳酸菌分离培养：

MRS培养基制备：葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，吐温80为1mL，蒸馏水1L，琼脂20g。用醋酸调节pH到6.8，121℃高压灭菌20min，37℃培养24-48h；

(2)斜面培养：

MRS培养基制备：葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，吐温80为1mL，蒸馏水1L，琼脂20g。用醋酸调节pH到6.8，121℃高压灭菌20min，37℃培养24-48h；

(3)种子培养：

培养基：脱脂乳粉调整固形物含量11％左右，加蔗糖6％，玉米浆10％，37℃培养24-48h；

(4)发酵培养：

培养基：脱脂乳粉调整固形物含量11％左右，加蔗糖6％左右，玉米浆10％，磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、植物乳杆菌pH值6.5，嗜酸乳杆菌pH值5.8，温度37℃，厌氧培养36-48h，菌落数超过10亿。

5.根据权利要求1所述的一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法，其特征是酵母菌培养：

(1)酵母菌离培养：

培养基：将发酵啤酒的原料，稀释至12柏林，加琼脂1.5％，溶化后分装，115℃灭菌30分钟，28℃培养24-48h；

(2)斜面培养

培养基：平板培养加1.5-2％的琼脂28-30℃培养3-4天；

(3)发酵培养：

培养基：酪蛋白胨15g/L，酵母粉25g/L，葡萄糖30g/L，磷酸二氢钾2.4g/L，磷酸氢二钾16.34g/L，温度30℃，通风量1∶0.8，培养48小时，菌落数超过10亿。

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