CN117143764A - 一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在真菌毒素降解中的应用 - Google Patents

一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在真菌毒素降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在真菌毒素降解中的应用，该益生解淀粉芽孢杆菌菌株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZG08，保藏编号为CGMCCNO：26868，保藏日期：2023年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明从传统泡菜中分离出一株具有高效降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的益生解淀粉芽孢杆菌ZG08，脱毒后的玉米粉中黄曲霉毒素B1含量低于国家限量标准，达到安全的食用级别，而且该菌株具有良好的模拟胃肠液耐受性和高温耐受性，对多种抗生素高度敏感，同时显示出对玉米赤霉烯酮的降解能力。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在真菌毒素降解中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在真菌毒素降解中的应用。
背景技术
真菌毒素是由产毒真菌在一定的环境条件下产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于饲料、谷物、果蔬、中药材及其制品中，具有致畸、致癌、致突变、抑制免疫等毒性作用，对人体与动物的健康造成严重威胁。目前，已发现400多种真菌毒素，其中，主要受关注的是黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)，玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)和呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)。由于真菌的繁殖速度快，孢子的数量大，散布远，玉米等粮食作物在种植、收获、贮藏和运输加工过程中极易受到产毒真菌及其真菌毒素的污染。食用或者接触这些被真菌毒素污染的食品或饲料可对人和动物造成急性或慢性的毒性作用。在已发现的18种黄曲霉毒素中，以黄曲霉毒素B1的致畸性、致突变性和致癌性最强。黄曲霉毒素B1已被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)列为I类致癌物质，是对人体健康危害最为突出的一类真菌毒素。此外，玉米赤霉烯酮作为一种类雌激素样非甾体毒素，具有内分泌毒性、神经毒性和遗传毒性，可对人体生殖系统、中枢神经系统等多个系统器官功能造成损伤。
在田间种植环节不能有效抑制这类产毒真菌的生长，来预防真菌毒素污染不完全可行的。目前，消除真菌毒素的有效方法，尤其是黄曲霉毒素，主要包括物理法，化学法和生物法。物理法包括高温、吸附、辐照、溶剂萃取等。化学法包括碱水解、氧化、氨化等。然而，这些方法由于功效低、成本高、营养物质损失、环境污染和化学试剂残留等缺点，限制了它们的广泛使用。近几年，生物法因其具有温和的反应条件、成本效益和环境友好的优势而颇受关注。据报道，恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、短黄杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等一些细菌，已被探索用于黄曲霉毒素B1的降解。现有技术中已报道的生物脱毒法，主要包括吸附法和酶解法。研究表明，芽孢杆菌不仅可以降解黄曲霉毒素B1，还能够抑制黄曲霉的生长。一些芽孢杆菌已被美国食品药品监督管理局(Food andDrug Administration，FDA)认为是安全无毒的，如解淀粉芽孢杆菌。解淀粉芽孢杆菌能分泌多种消化酶，抑制病原菌定植等多种作用，还可以被用作益生菌添加到动物饲料中来提高生产性能。然而，目前能够应用于抑制黄曲霉生长、降解黄曲霉毒素B1且具有益生潜力的菌株资源仍很少。
如现有技术公开了一株能够降解花生粕中黄曲霉毒素B1的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，所述的解淀粉芽孢杆菌具有抑制黄曲霉生长和降解黄曲霉毒素B1的双功能特性。在花生粕样品中，该菌株对低浓度的黄曲霉毒素B1(12.32μg/kg)有88.24％的脱毒率，而对较高浓度的黄曲霉毒素B1(145.17μg/kg)仍有81.39％的脱毒率，但是脱毒后的花生粕中仍有27.01μg/kg的黄曲霉毒素B1，仅达到了安全的饲用级别，限制了其在防控粮食和食品中黄曲霉B1污染的应用。
另有一发明技术也公开了一株用于防控黄曲霉毒素B1污染的解淀粉芽孢杆菌，所述的解淀粉芽孢杆菌能大幅度抑制黄曲霉的生长，使其干重减少52.59％，同时，完全抑制黄曲霉毒素B1的合成基因，能够将黄曲霉毒素B1降解成无毒的物质，降解率高达95.47％，并且该菌株的发酵液或胞内物也能降解黄曲霉毒素B1，发酵液还具有高温耐受性。然而，未对这株解淀粉芽孢杆菌的益生性和应用进一步评估。
通常，玉米小麦等粮食作物中至少会受到一种以上的真菌毒素污染。为了扩充降解黄曲霉毒素B1的益生菌种质资源库，有必要筛选出更多、更高效，作用更加广泛的微生物菌株，为防控黄曲霉毒素B1和其他真菌毒素的污染提供新的高效菌株和方法。
发明内容
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在真菌毒素降解中的应用，该解淀粉芽孢杆菌菌株不仅高效降解玉米粉中的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮，而且具有良好的模拟胃肠液耐受性和高温耐受性，对多种抗生素高度敏感的特点。
具体技术方案如下：
本发明提供了解淀粉芽孢杆菌菌株，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZG08，保藏编号为CGMCC NO：26868，保藏日期：2023年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌菌株呈短杆状，为革兰氏阳性菌，16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1：
GGGCGAGTGCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTCACAGAG。
进一步地，本发明还提供了一种生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分包括解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZG08。
进一步地，所述生防菌剂的活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZG08经液体发酵后获得的上清液、菌体悬浮液或胞内提取物。
进一步地，所述生防菌剂具有良好的胃肠液耐受性，在pH值2～4的模拟胃液中具有良好的存活能力，培养3h后存活率为84.49～96.50％；在质量浓度为0.1～0.5％的模拟胆盐中具有良好的存活能力，处理4h后存活率为85.71～90.01％。
进一步地，所述生防菌剂具有良好的高温耐受性，在70～90℃的高温条件下，经90℃处理15min后存活率仍有74.70％。
进一步地，所述生防菌剂具有良好的药物敏感性，对青霉素完全耐药，对氨苄西林中度敏感，而对头孢噻肟、阿米卡星、庆大霉素和四环素等8种抗生素高度敏感。
进一步地，所述生防菌剂具有良好的拮抗真菌特性，对增殖镰刀菌、禾谷镰刀菌、黄曲霉、可可毛色二孢菌、寄生曲霉和葡萄座腔菌共6种病原真菌有明显的拮抗效果，表现广谱的抗真菌性。
本发明还提供了所述的解淀粉芽孢杆菌菌株在降解玉米粉中的黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮中的应用。
本发明还提供了所述的生防菌剂在降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮中的应用。
进一步地，所述的解淀粉芽孢杆菌菌株或所述的生防菌剂在拮抗以下任意一种或多种真菌中的应用；
A.增殖镰刀菌；B.禾谷镰刀菌；C.黄曲霉；D.可可毛色二孢菌；E.寄生曲霉；F.葡萄座腔菌。
本文中AFB1代表黄曲霉毒素B1，ZEN代表玉米赤霉烯酮。
本发明还提供了一种降解玉米粉中真菌毒素的方法，包括以下步骤：
(1)取如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，接种于液体培养基中，进行发酵培养；
(2)将发酵培养后的发酵物制成菌剂，喷洒于受黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮侵扰的玉米粉上；
进一步地，步骤(1)中，所述液体培养基为LB培养基；所述解淀粉芽孢杆菌菌株的接种量为8～12％。
进一步地，步骤(1)中，所述发酵培养的条件为：以LB培养基为培养基质，30℃～45℃下培养36～72h，pH为5～8。
作为优选，步骤(1)中，所述发酵培养的条件为：以LB培养基为培养基质，37℃下培养48h，pH为7，接种量为10％。
进一步地，步骤(2)中，所述菌剂为下列之一：
i上清液；
ii菌体悬浮液；
iii胞内提取物；
iv以上清液、菌体悬浮液和胞内提取物中的一种为有效成分的生防菌液。
作为优选，步骤(2)中，所述菌剂为无细胞上清液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明从传统泡菜中分离出一株具有高效降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢杆菌ZG08，对玉米粉中黄曲霉毒素B1的降解率达到63.86～84.71％，对肉汤中黄曲霉毒素B1的降解率达到63.86～80.93％，脱毒后的玉米粉中黄曲霉毒素B1含量低于国家限量标准，达到安全的食用级别，对玉米粉中玉米赤霉烯酮的降解率达到45.12～79.81％。
(2)解淀粉芽孢杆菌ZG08对高质量浓度的黄曲霉毒素B1仍有较好的降解能力，可有效降解25-1000μg/kg的黄曲霉毒素B1，降解率为54.65～74.81％。
(3)解淀粉芽孢杆菌ZG08具有良好的广谱的抗真菌性与药物敏感性。
(4)解淀粉芽孢杆菌ZG08表现良好的高温耐受性与胃肠液耐受性。
附图说明
图1为实施例1中AFB1降解菌株的复筛结果，其中ZG08为解淀粉芽孢杆菌。
图2为实施例1中a-菌株ZG08的菌落形态及b-显微形态(1000x)。
图3为实施例1中菌株ZG08的16S rDNA鉴定结果，a-PCR扩增结果；b-基于16S rNDA序列的系统发育树。
图4为实施例2中菌株ZG08的高温耐受性。
图5为实施例2中平板对峙试验结果，a-增殖镰刀菌；b-禾谷镰刀菌；c-黄曲霉；d-可可毛色二孢菌；e-寄生曲霉；f-葡萄座腔菌。
图6为实施例3中pH值对菌株ZG08降解AFB1。
图7为实施例3中培养时间对菌株ZG08降解AFB1的影响。
图8为实施例3中培养温度对菌株ZG08降解AFB1的影响。
图9为实施例3中AFB1对菌株ZG08降解AFB1的影响。
图10为实施例4中菌株ZG08降解AFB1的活性成分，其中supernatant为无细胞上清液；cell lysate为菌体悬液；cells为细胞内容物；heat为无细胞上清液经加热处理；proteinase K蛋白酶K；SDS为加1％十二烷基硫酸钠处理。
图11为实施例5中菌株ZG08对玉米中AFB1的降解效果。
图12为实施例6中菌株ZG08对ZEN的降解作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZG08菌株的获取
1.1菌种来源
采集动物肠道、酸奶、豆豉、泡菜等作为待分离样品。
1.2培养基与试剂
香豆素初筛液体培养基(g/L)：KH2PO4 0.25g,MgSO4·7H2O 0.25g,KNO3 0.5g,(NH4)2SO4 0.5g,CaCl2 0.005g,FeCl3·6H2O 0.003g，香豆素1.0g，蒸馏水定容至1L,pH7.0,121℃高压灭菌20min。
香豆素初筛固体培养基:香豆素初筛液体培养基加入1.5％(质量分数)琼脂，121℃高压灭菌20min。
LB固体培养基:胰蛋白胨1.0g，NaCl 1.0g，酵母抽取物0.5g，琼脂1.5g，pH 7.0，蒸馏水定容至100mL，121℃高压灭菌20min。
LB液体培养基：成分除无琼脂外同LB固体培养基。
试剂：AFB1标准品；AFB1和ZEN ELISA检测试剂盒；DNA Marker，通用引物；细菌基因组DNA提取试剂盒；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆盐等。
1.3黄曲霉毒素B1降解菌株的初筛
分别称取5g待分离样品加入到含有100mL无菌生理盐水中，在涡旋振荡器上振荡10min后静置20min，取上层悬浊液1mL加入到含有香豆素的初筛液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养，24h后吸取菌液100μL涂布于香豆素初筛固体培养基上，于37℃培养24h后选取生长良好的单菌株，连续划线3次于香豆素初筛固体培养基上，待长出单菌落后进行纯化并保存菌株。
本研究利用香豆素初筛培养基从动物肠道、泡菜、豆豉及酸豆角等30份样品中初步分离出到113株对AFB1可能具有降解能力的菌株。
1.4黄曲霉毒素B1降解菌株的复筛
取上述纯化的菌株分别接种于LB液体培养基中，37℃、180r/min培养24h后，取200μL发酵液接种于含0.5μg/mL AFB1的LB液体培养基中，以未接菌的含0.5μg/mL AFB1的LB液体培养基为对照组，每组处理3个平行，于37℃、180r/min摇床培养24h。根据AFB1 ELISA试剂盒对培养液中的AFB1含量进行检测，按照下列公式计算AFB1的降解率，筛选出降解率最高的菌株进行鉴定和生物学特性研究；
AFB1降解率(％)＝(处理组的AFB1残留量-对照组的AFB1残留量)/对照组的AFB1残留量
初步分离的113株菌株对AFB1的降解能力各不相同。其中，有AFB1降解率>50％的菌株有8株，从传统泡菜中分离纯化得到的菌株ZG08对AFB1的降解率最高，可达到68.67％。因此，选择菌株ZG08做进一步的研究，具体见附图1。
1.5菌株ZG08的鉴定结果
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，对BR-1菌株进行形态特征和生理生化鉴定。同时提取菌株基因组总DNA，用16S rDNA通用引物扩增，测序。
形态学鉴定结果显示，菌株ZG08在LB培养基上的菌落为白色，不透明，边缘不整齐，表面粗糙，中心有微微隆起。革兰氏染色呈紫色，菌体呈短杆状(附图2)。
生理生化鉴定结果，菌落需氧，硝酸盐还原试验、明胶液化、淀粉水解、V-P试验结果均为阳性，能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、柠檬酸盐和D-甘露醇，不能利用丙酸盐，能在7％氯化钠和pH5.7环境下生长。
经16S rDNA基因PCR扩增测序和BLAST对比鉴定(附图3)为芽孢杆菌属(Bacilluscereus)。测序结果与NCBI中的GenBank数据库进行BLAST，分析序列同源性。ZG08菌株16SrDNA基因序列(如SEQ ID NO.1所示)与解淀粉芽孢杆菌16S rDNA序列同源性高达99.83％％。同源性比对数据证明菌株ZG08为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)
上述结果表明，该菌为解淀粉芽孢杆菌。该菌株已于2023年3月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏号为CGMCC No.17612。
培养特征为：最适生长温度37℃，pH为7。生长于LB培养基中，培养基成分：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10g/L。
SEQ ID NO.1：
GGGCGAGTGCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTCACAGAG
实施例2解淀粉芽孢杆菌ZG08的益生特性
1.模拟胃肠液耐受性
取0.5mL待测菌液加入4.5mL的模拟胃肠液中，在pH 2.0，3.0，4.0的模拟胃液中37℃处理3h，以及在胆盐浓度为0.1％，0.3％，0.5％的模拟肠液中37℃处理4h，分别以0h作为对照组，取出培养液并立即进行稀释涂布计算活菌数。存活率计算如下：
表1菌株ZG08的模拟胃肠液耐受性
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
菌株ZG08分别在pH值为2.0、3.0和4.0的模拟胃液中培养3h后，存活率仍能保持在80％以上。菌株ZG08的存活率随着pH值的升高而升高，经pH＝4.0的模拟胃液处理后，存活率可达96.50％。此外，在模拟肠液中发现，菌株ZG08的存活率随着胆盐浓度的升高而有所下降，经0.5％胆盐处理4h后存活率仍有85.71％。这些结果均说明菌株ZG08具有良好的模拟胃肠液耐受性。
2.高温耐受性
待测菌液在70℃，80℃和90℃水浴处理5min和15min，取加热后的菌液进行稀释涂布计算活菌数，以初始待测菌液作为对照组，存活率计算按上述公式。
将菌株ZG08的发酵液经70℃，80℃和90℃水浴处理5min和15min后，计算其存活率，结果见图4。随着温度和处理时间的升高，菌株ZG08的存活率都有所下降，但都能耐受高温环境，经90℃处理15min后存活率仍有74.70％，具体见附图4。
3.抗生素敏感性检测
根据CLSI(2014)药物敏感性检测标准，采用K-B法进行药物敏感性试验，使用青霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、氟苯尼考、阿米卡星、多西环素、恩诺沙星、卡那霉素、多粘菌素B、克林霉素、环丙沙星、吠喃哩酮、新霉素和头抱氨节药敏片，在37℃倒置孵化12h后，测量抑菌圈大小。
本试验参照CLSI(2014)药物敏感性检测标准进行药敏试验。试验结果显示，菌株ZG08对青霉素完全耐药，对氨苄西林中度敏感，而对头孢噻肟、阿米卡星、庆大霉素和四环素等8种抗生素高度敏感。
表2药敏试验结果
注：S表示敏感；I表示中介；R表示耐药。
4.拮抗真菌特性
采用平板对峙法观察待测菌的发酵液对黄曲霉、寄生曲霉、禾谷镰刀菌、增殖镰刀菌、可可毛色二孢菌和葡萄座腔菌共6种病原菌菌丝生长的抑制作用。
平板对峙试验结果如附图5所示，菌株ZG08对增殖镰刀菌、禾谷镰刀菌、黄曲霉、可可毛色二孢菌、寄生曲霉和葡萄座腔菌共6种病原真菌具有明显的拮抗效果，进一步说明该菌株具有广谱的抗真菌性。
实施例3菌株ZG08降解AFB1条件优化
筛选到的菌株活化后挑取一环于LB液体培养基中，在37℃、200r/min培养24h，得到种子液，将种子液按1％接种量接种至AFB1浓度为50μg/L的发酵培养基中于37℃摇床培养24h，初始pH为7。在此基础上固定摇床转速为200r/min，分别考察pH值(4、5、6、7、8、9)、培养温度(20℃、25℃、30℃、37℃、45℃、55℃)、培养时间(6h、12h、24h、36h、48h、72h)、AFB1浓度(25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L)对筛选到的菌株降解AFB1的影响。
由附图6可知，不同pH值对菌株ZG08降解AFB1的影响差异显著(P<0.05)。随着pH的升高，AFB1降解率呈现先升高后下降的趋势，在pH为7时AFB1降解率最高，为69.86％。因此，最适pH值为7。
由附图7可知，随着培养时间的增加，AFB1降解率随之升高，培养时间为48h时，AFB1降解率为79.75％。培养72h的AFB1降解率为80.79％，与培养48h的AFB1降解率差异不显著(P>0.05)。因此，最适培养时间为48h。
由附图8可知，培养温度显著影响菌株ZG08降解AFB1的能力(P<0.05)。AFB1降解率随着培养温度的升高而先增加后下降。在37℃下AFB1的降解率最高，为63.83％。因此，最适培养温度为37℃。
为了探究菌株ZG08对高浓度AFB1的降解能力，在25μg/kg基础上提高培养基中AFB1的质量浓度后进行培养，结果见附图9。在AFB1浓度为50μg/kg时，AFB1降解率最高，达到74.81％，在浓度为100μg/kg时，AFB1的降解率为74.49％，与前者相比，差异不显著(P>0.05)。而且在AFB1浓度为1000μg/kg，AFB1降解率仍有54.65％，说明菌株ZG08对于高浓度的AFB1也具有良好的降解能力。
实施例4菌株ZG08不同组分降解AFB1效果
取10mL筛选得到的菌株发酵液于4℃，10000r/min条件下离心10min，收集上清液过0.22μm滤膜，4℃保存备用。菌体沉淀用无菌PBS缓冲液清洗2次，再用无菌PBS重悬沉淀，制备菌体悬液备用。另取一部分菌体悬液，利用手持超声破碎仪破碎菌体，4℃10000r/min条件下离心15min，收集上清液，获得细胞内容物。经上述处理后，向无细胞上清液和菌体悬液以及细胞内容物分别加入终浓度为50μg/L的AFB1标准品，以LB液体培养基加AFB1标准品溶液作为空白对照，于37℃，200r/min恒温摇床中振荡培养24h，用ELISA检测试剂盒检测各组中AFB1的残留量，降解率按公式(1)计算。
在上述试验基础上，将发挥主要降解作用的部分做如下处理：
1：加2mg/mL蛋白酶K处理2h；
2：加1％十二烷基硫酸钠(SDS)处理2h；
3：加热处理(沸水煮15min)。
将上述各组分别加入终浓度为50μg/L的AFB1标准品溶液，以LB培养基加AFB1标准品溶液作为空白对照，每个样品做3个重复，于37℃，200r/min恒温摇床中振荡培养24h，用ELISA检测试剂盒检测各组中AFB1的残留量，降解率按上述公式计算。
对菌株ZG08的不同组分进行AFB1降解活性的测定。结果如附图10所示，发酵液的不同组分均具有一定的AFB1降解活性。其中，无细胞上清液的AFB1降解率高达68.67％，显著高于菌体悬液和细胞内容物(P<0.05)。此外，无细胞上清液经加热、SDS和蛋白酶K处理后的AFB1降解率显著下降(P<0.05)，说明菌株ZG08降解AFB1的活性物质可能是一种蛋白且不耐热。
实施例5菌株ZG08在玉米粉上的应用
将污染有黄曲霉毒素B1的玉米样品粉碎，烘干，称量100g加入锥形瓶中，高压蒸汽灭菌。将活化好的菌株ZG08发酵液以10％接种量，料水比2:1，接入冷却后的玉米粉中，搅拌均匀，在37℃下发酵24-72h，每隔12h翻拌一次，使其再次混匀。将发酵后的玉米粉样品60℃烘干，粉碎，准确称取5g，测定AFB1含量。
将菌株ZG08应用于受AFB1污染的玉米粉中，由附图11可知，玉米粉本身含有的AFB1含量为114.33μg/kg，经菌株ZG08发酵72h后，AFB1含量仅有17.48μg/kg，明显低于我国食品中规定的黄曲霉毒素B1限量标准。此外，随着发酵时间的增加，AFB1降解率从63.86％上升至84.71％，说明菌株ZG08在玉米粉脱毒上具有良好的应用潜力。
实施例6菌株ZG08对ZEN的降解
将活化过的菌株ZG08接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min摇床培养24h后，取取200μL发酵液接种于含1μg/mL ZEN的LB液体培养基中，以未接菌的含1μg/mL ZEN的LB液体培养基为对照组，每组处理3个平行，于37℃、180r/min摇床培养12h、24h和48h。根据ZENELISA试剂盒对检测培养液中的ZEN含量，按照下列公式计算ZEN的降解率。
式中：P0为对照组ZEN的残留量；P1为处理组ZEN的残留量
由附图12可知，菌株ZG08对ZEN也具有一定的降解能力，随着培养时间的增加，ZEN降解率从45.12％上升至79.81％。

Claims (10)

1.解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZG08，保藏编号为CGMCC NO：26868，保藏日期：2023年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌菌株呈短杆状，为革兰氏阳性菌，16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的活性成分包括如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZG08。
4.如权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZG08经液体发酵后获得的上清液、菌体悬浮液或胞内提取物。
5.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株在降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮中的应用。
6.如权利要求3～4任一项所述的生防菌剂在降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮中的应用。
7.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株或如权利要求3～4任一项所述的生防菌剂在拮抗以下任意一种或多种真菌中的应用；
A.增殖镰刀菌；B.禾谷镰刀菌；C.黄曲霉；D.可可毛色二孢菌；E.寄生曲霉；F.葡萄座腔菌。
8.一种降解玉米粉中真菌毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，接种于液体培养基中，进行发酵培养；
(2)将发酵培养后的发酵物制成菌剂，喷洒于受黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮侵染的玉米粉上。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述液体培养基为LB培养基；所述解淀粉芽孢杆菌菌株的接种量为8～12％；所述发酵培养的条件为：以LB培养基为培养基质，30℃～45℃下培养36～72h，pH为5～8。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述菌剂为下列之一：
i上清液；
ii菌体悬浮液；
iii胞内提取物；
iv以上清液、菌体悬浮液和胞内提取物中的一种为有效成分的生防菌液。
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