KR101348435B1 - 항진균 활성을 가진 락토바실러스 플란타룸 ｙｍｌ００７ 및 이의 용도 - Google Patents

항진균 활성을 가진 락토바실러스 플란타룸 ｙｍｌ００７ 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 YML007 (수탁번호: KCTC 12032BP) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 락토바실러스 플란타룸 YML007는 김치로부터 분리한 것으로 생체 내 안정성이 높고, 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 생성물은 병원성 진균류에 저항성을 나타내어 방제효과가 우수할 뿐 아니라 마이코톡신 생산을 억제할 수 있어, 환경친화적 미생물제제, 병원성 진균류 방제제 또는 식품 보존제 등 다양한 분야에 활용가능하다.

Description

항진균 활성을 가진 락토바실러스 플란타룸 ＹＭＬ００７ 및 이의 용도 {Lactobacillus plantarum YML007 having anti-fungal activitiy and its use}
본 발명에서는 진균류에 대한 방제활성을 가지는 신규한 미생물 및 이의 용도에 관한 것이다.
농작물의 경작시 또는 운반이나 저장 중에 발생되는 식물성 병원균에 의한 경제적 손실은 약 5 내지 50%에 달하고 있으며, 이러한 손실 중 5 내지 10% 가량이 곰팡이에 의해 이루어지고 있으며, 개발도상국에서는 그 손실이 더욱 심각하다.
또한 곰팡이에 의한 피해는 단순 수확물의 감소뿐만 아니라 병원균이 생산하는 2차 대사산물이 사람과 동물에게 강한 독소로 작용하며 (Ames, B. N. Sci ., 204, 587-593, 1979. ; Vesconder, R. F. and Golinski,P. In Fusarium-mycotoxins, taxonomy and pathogenicity, ed. by J. Chelkowski, Amsterdam, Elsevier. pp. 1-39, 1989), 인간과 가축에서 곰팡이 독소 중독증의 발생시킨다는 다수의 연구가 보고되어 있다.
고온다습한 우리나라의 여름철에는 사료중 곰팡이의 증식에 적합한 환경이 조성된다. 특히 여름 장마철에는 사료내 수분 함량이 16% 이상, 상대습도는 80 내지 85%까지 올라가므로 급격한 곰팡이의 번식이 있게 된다. 사료중에 곰팡이가 다량 증식할 경우 대사 산물로 여러 가지 마이코톡신이 생성되며, 이들의 종류 및 분비량은 곰팡이의 종류, 온도, 습도 및 사료의 수분 함량 등 여러 가지 요인들에 의해 변이를 갖게 된다. 그러나, 마이코톡신이 사료 중에 미량으로 존재하더라도 가축에게 주는 피해는 매우 크며 가축을 통해 인체로의 전이되는 등 많은 문제점을 내포하고 있다.
현재 400 이상의 마이코톡신 (mycotoxins)이 동정되었는데, 중요 마이코톡신 그룹은 인간 및 동물의 건강에 있어 주요 관심사가 되고 있으며, 음식 및 사료에서 빈번하게 발견되는 것으로는 아플라톡신 (aflatoxins), 오크라톡신 A (ochratoxin A), 트리코텐션즈 (trichothecenes: deoxynivalenol, nivalenol), 제랄레논 (zearalenone) 및 푸모니신 (fumonisins) 등이 있다.
아플라톡신은 곰팡이인 아스퍼질러스 플라부스 (Aspergillus flavis), 아스퍼질러스 파라시티커스 (A. parasiticus) 및 페니실리움 푸베루룸 (Penicillium puberulum)에서 생성되는 2차 대사산물로 매우 강한 독성을 갖고 있는 발암물질이다 (Diner, U. L., Cole, R. J., Sanders, T. H., Payak, G. A., Lee, L. S., and Klich, M. A. Ann. Rev. phytopathol. , 25, 249-270, 1987). 아플라톡신은 화학적으로 2개의 디하이드로퓨란이 결합된 화합물이며 B 1 , B 2 , G 1 , G 2 로 분류된다. 그 중 아플라톡신 B 1 은 가장 치명적인 것으로 알려져 있으며, 가축에 있어서 사망 또는 출산율의 감소와 연관되어 있고, 아플라톡신 B 1계 디푸라노큐마린 (difuranocoumarin) 화합물들은 사람과 동물에 돌연변이, 발암 및 기형을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Fugimoto, Y., Hampton, L. L., Writh, P. J., Wang, N. J., Xie, J. P., and Thorgenirsson, S. S. Cancer Res ., 54, 281-285, 1994 ; Hosono, S., Chou, M. J., Lee, C. S., and Shin, C. Oncogene , 8, 491-496, 1993).
아플라톡신은 전 세계적으로 곡류, 땅콩, 옥수수 등에서 주로 발견되고 있는데 인간은 오염된 농산물을 통한 직접 섭취뿐 아니라, 우유 중의 아플라톡신 M과 같이 오염된 사료를 급여한 가축의 2차 생산물을 통해서 간접 섭취에까지 노출되어있는 실정이다.
우리 나라에서도 70년대 후반 가축사료용으로 수입한 땅콩박에서 200 내지 300 ppb의 아플라톡신이 검출된 사례가 있었으며, 특히 전통 장류 등 곰팡이를 사용한 발효식품을 상식하는 우리 식생활에 있어서 오염된 식품에 노출되어 있을 가능성도 매우 높다. 실제로 부산에서 채취된 일부 된장 시료에서 84 ppb의 아플라톡신이 검출되었는데 이 수치는 당시 WHO 기준치의 2.8배에 이르는 양이었다. 따라서 식품에서 아플라톡신의 오염을 억제하거나 이미 생성된 아플라톡신을 불활성화시키는 것은 매우 중요한 일이다.
현재, 곰팡이 성장 및 이의 마이코톡신 생성을 억제하기 위하여 식품이나 사료를 가열, 암모니아처리, 스크리닝 또는 방사선 처리하는 방법이 있으나, 이를 상업적으로 응용하기에는 너무 비싸거나 비실용적이고, 이에 의해 식품이나 사료의 영양소의 파괴를 야기할 수 있으며, 살균제와 같은 화학적 방제가 이루어지는 경우 이에 의한 부작용이 나타날 수 있다.
다른 방안으로 라이틱 펩티드, 세균 엔도-키틴네이즈, 담배 오스모틴 등의 항곰팡이성 유전자를 곡물에 형질전환시키는 방법이 있으나, 유전자변형식물에 대한 논란을 벗어나기 어렵다. 또 농작물에 적용하는 방안으로는 독성 있는 세균과 경쟁하는 비독성 세균을 사용하는 것이 있으나, 토양에서 경쟁하는 미생물을 성장시키는 방법이 용이하지 않은 실정이다 (미국특허 제 5,942,661호).
본 발명에서는 신규한 미생물인 락토바실러스 플란타룸 YML007 (Lactobacillus plantarum YML007, 수탁번호: KCTC 12032BP)을 제공하고자 하고, 이를 포함하는 미생물제제, 병원성 진균류 방제제 및 식품 보존제를 제공하고자 한다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YML007 (수탁번호: KCTC 12032BP), 이의 배양물 또는 이의 생산물을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YML007, 이의 배양물, 또는 이의 생산물을 포함하는 미생물제제를 제공한다.
상기 미생물제제는 병원성 진균류를 방제할 수 있다.
상기 진균류는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 푸사리엄 (Fusarium), 페니실리엄 (Penicillium), 칸디다 (Candida) 및 사카로미세스 (Saccharomyces)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 미생물제제는 마이코톡신 (mycotoxin) 생산을 저해할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YML007, 이의 배양물, 또는 이의 생산물을 포함하는 병원성 진균류 방제제를 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YML007, 이의 배양물, 또는 이의 생산물을 포함하는 식품 보존제를 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YML007은 동물성 및 식물성 병원성 진균류에 대하여 광범위한 항진균 활성을 나타내며, 마이코톡신 생산을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 오랜 기간 안정성이 입증된 김치로부터 분리된 균주로 인체에 무해하고 환경친화적이기에, 이를 이용하여 항진균류와 관련된 미생물제제, 병원성 진균류 방제제, 사료를 포함한 식품 보존제 및 진균류와 관련된 향후 의약품 개발 등 다양한 분야에 활용가능할 것이다.
도 1은 락토바실러스 플란타룸 YML007 (Lb . plantarum YML 007)에 의한 아스퍼질러스 나이거 KCTC16683 (Aspergillus niger KCTC16683)의 성장저해 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 무처리된 대조군 옥수수, 유기산 처리된 옥수수, 락토바실러스 플란타룸 YML007 처리된 옥수수에서 시간 경과에 따른 조지방 및 수분 함량을 측정한 것이다.
도 3은 무처리된 대조군 옥수수, 유기산 처리된 옥수수, 락토바실러스 플란타룸 YML007 처리된 옥수수에서 시간 경과에 따른 아플라톡신 및 곰팡이 갯수를 측정한 것이다.
도 4는 무처리된 대조군 옥수수, 유기산 처리된 옥수수, 락토바실러스 플란타룸 YML007 처리된 옥수수를 먹인 각각의 쥐에서의 사료소비량, 몸무게 증가량 및, 평균 사료소비률 (FCR)을 나타낸 것이다.
도 5는 무처리된 대조군 옥수수, 유기산 처리된 옥수수, 락토바실러스 플란타룸 YML007 처리된 옥수수에서의 저장 후 60일 경과시의 상태를 나타낸 것이다.
본 발명은 신규한 미생물인 락토바실러스 플란타룸 YML007 (Lactobacillus plantarum YML007, 수탁번호: KCTC 12032BP), 이의 배양물 또는 이의 생산물을 제공하고, 상기 미생물, 이의 배양물 또는 이의 생산물을 포함하는 미생물제제, 병원성 진균류 방제제 및 식품 보존제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
종래의 병원성 진균류 방제를 위해서는 화학적 합성농약이 주로 사용되었으나, 이의 방제방법 및 약제는 독성이 매우 강하고 잔류성도 높기 때문에 자연 생태계의 파괴를 초래하고, 잔류 독성으로 인한 인체의 약제중독, 발암, 기형 및 각종 질환을 유발할 가능성이 매우 높아서 그 사용이 제한되고 있으며, 이를 극복하기 위해 항진균성 항생물질의 개발을 위한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고, 항진균 효과가 우수하며, 무독성, 잔류성이 낮은 약제가 아직 개발되지 못한 상태이다. 이에 본 발명에서는 병원성 진균류의 성장만을 강력하게 억제할 수 있고, 천연에서 분리되어 인체에 대한 독성이나 부작용이 없는 환경친화적 물질을 발굴하고자 노력하던 중 본 발명의 미생물에 의해 상기 문제점이 해결될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YML007 (수탁번호: KCTC 12032BP), 이의 배양물 또는 이의 생산물을 제공한다.
상기 미생물은 김치로부터 분리된 균주로, 30℃에서 24시간 동안 MRS 고체배지 또는 MRS 액체배지 (Difco laboratories, Detroit, MI, USA)에서 배양한 후 분리하고, 이를 16S rRNA 염기서열분석 (16S rRNA sequencing)을 사용하여 계통학적 분석 및 균주 동정을 수행하였다.
상기 균주는 2011년 10월 20일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생명자원센터에 기탁번호 KCTC 12032BP로 기탁되었다.
상기 락토바실러스 플란타룸 YML007의 배양물은 락토바실러스 플란타룸 YML007를 배양시킨 모든 종류의 고체배양물 또는 액체 배양물을 포함할 수 있으며, 상기 배양물이 배지의 종류나 배양방법에 의해 한정되는 것이 아니며, 락토바실러스 플란타룸 YML007의 생산물은 상기 미생물의 대사에 의해 생성되는 모든 산물을 의미할 수 있다.
본 발명의 일례로, 고체 배양의 경우, 표준 한천 배지, 포테이토 덱스트로스 한천 배지 등을 사용하여 20 내지 35℃에서 정치배양을 하는 방법을 사용할 수 있으며, 액체 배양의 경우, 상기 한천 배지로부터 한천을 제거한 각종 액체 배지 등을 사용하여 20 내지 35℃에서 진탕교반 배양하는 방법을 사용하여 이의 배양물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일례로, 락토바실러스 플란타룸 YML007을 30℃에서 24시간 동안 MRS 액체배지 (MRS broth)에서 배양하고 이를 원심분리하여 무세포 상등액(cell-free supernatant)을 사용할 수 있다.
상기 락토바실러스 플란타룸 YML007 (수탁번호: KCTC 12032BP), 이의 배양물 또는 이의 생산물은 병원성 진균류에 대해 저해활성을 지닐 수 있다.
상기 진균류는 특별히 한정된 것은 아니며, 효모, 사상균, 곰팡이, 녹병균, 및 버섯으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 효모 및 곰팡이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 푸사리엄 (Fusarium), 페니실리엄 (Penicillium), 칸디다 (Candida) 및 사카로미세스 (Saccharomyces)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물일 수 있다.
상기 락토바실러스 플란타룸 YML007, 이의 배양물 또는 이의 생산물은 마이코톡신 (mycotoxin) 생산에 저해활성을 지닐 수 있다.
상기 마이코톡신의 종류는 특별히 한정된 것은 아니며, 아플라톡신 (aflatoxins), 오크라톡신 (ochratoxin), 트리코텐션즈 (trichothecenes: deoxynivalenol, nivalenol), 제랄레논 (zearalenone), 푸모니신 (fumonisins), 보미톡신 (Vomitoxin), 맥각 (Ergot), 후모니신 (Fumonisin), 및 T-2 톡신 (T-2 toxin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 아플라톡신 (aflatoxins)일 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YML007, 이의 배양물, 또는 이의 생산물을 포함하는 미생물제제를 제공한다.
락토바실러스 플란타룸 YML007, 이의 배양물, 또는 이의 생산물은 락토바실러스 플란타룸 YML007으로부터 얻어질 수 있는 모든 형태의 것을 의미할 수 있으며, 균체 자체뿐만 아니라, 그 현탁액 내지 배양액 또는 이들의 농축물, 페이스트상물, 건조물, 희석물 또는 상기 미생물의 대사를 통해 만들어지는 모든 생성물을 의미할 수 있다.
상기 미생물제제는 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 생성물이 포함된 모든 제제를 의미할 수 있으며, 그 활용범위에 있어서 특별히 한정된 것은 아니다.
본 발명의 일례로, 본 발명의 미생물제제는 미생물농약, 종자코팅제, 곰팡이병 방제제, 무살균배지 제조를 위한 첨가제, 바이오상토, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제, 관주살포제, 의약품제제, 비료첨가제, 식품 첨가제, 식품 보존제 또는 사료보존제 등 다양한 분야에서 활용될 수 있다.
상기 미생물제제는 그 용도에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 병원성 진균류를 저해하기 위해 사용될 수 있다.
상기 진균류는 클로로필이 없는 광범위한 진핵포자-형성 생물체를 의미할 수 있다.
상기 진균류는 특별히 한정된 것은 아니며, 효모, 사상균, 곰팡이, 녹병균, 및 버섯으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 효모 및 곰팡이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 푸사리엄 (Fusarium), 페니실리엄 (Penicillium), 칸디다 (Candida) 및 사카로미세스 (Saccharomyces)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물일 수 있다.
본 발명의 일례로, 표 2에서 나타난 바와 같이 본 발명의 미생물제제 적용가능한 진균류로는 아스퍼질러스 나이거 KCTC16683 (Aspergillus niger KCTC16683), 아스퍼질러스 플라버스 KCTC16682 (Aspergillus flavus KCTC16682), 푸사리엄 옥시스포럼 KCTC6434 (Fusarium oxysproum KCTC6434), 푸사리엄 옥시스포럼 KCTC16909 (Fusarium oxysproum KCTC16909), 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus oryzea ), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans ), 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)를 포함할 수 있다.
본 발명의 진균류 저해활성은 표 1 및 표 2를 통해 확인할 수 있는데, 본 발명의 균주, 배양물을 사용할 경우 종래 상업적으로 활용되고 있는 소르빈산칼륨이나 벤존산나트륨에 비해 압도적으로 효과가 우수할 뿐 아니라, 그 적용 가능한 진균류 스펙트럼도 소르빈산칼륨이나 벤존산나트륨에 비해 훨씬 넓어 상업적 활용가능성이 큼을 확인할 수 있다.
또한, 간접적으로 음성대조군인 무처리 옥수수, 양성대조군인 유기산 처리된 옥수수 및 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YML007 처리된 옥수수를 섭취한 쥐의 몸무게를 비교해 보았을 때, 락토바실러스 플란타룸 YML007 처리된 옥수수를 섭취한 쥐의 몸무게가 대조군 및 유기산을 처리한 군보다 각각 2.95g 및 1.1g이 높아 진균류에 의해 옥수수의 영양분이 훼손되지 않고 우수한 질을 유지할 수 있음을 확인할 수 있다.
상기 미생물제제는 그 용도에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 마이코톡신 (mycotoxin) 생산을 저해할 수 있다.
마이코톡신 (mycotoxin)은 콤팡이 독소로, 곰팡이의 2차 대사산물로서 동물의 생체에 장애를 유발하는 독성물질이다. 이러한 마이코톡신은 인간과 인간 이외의 동물에서 발암물질 (carcinogenic), 돌연변이물질 (mutagenic), 기형발생물질 (teratogenic), 발정호르몬물질 (estrogenic), 출혈성물질 (hemorrhagic), 면역독성물질 (immunotoxic), 신장독성물질 (nephrotoxic), 간독성물질 (hepatotoxic), 피부독성물질 (dermotoxic), 및 신경독성물질 (neurotoxic)로 작용할 수 있다.
상기 마이코톡신의 종류는 특별히 한정된 것은 아니며, 아플라톡신 (aflatoxins), 오크라톡신 (ochratoxin), 트리코텐션즈 (trichothecenes: deoxynivalenol, nivalenol), 제랄레논 (zearalenone), 푸모니신 (fumonisins), 보미톡신(Vomitoxin), 맥각(Ergot), 후모니신 (Fumonisin), 및 T-2 톡신 (T-2 toxin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 아플라톡신 (aflatoxins)일 수 있다.
아플라톡신은 강산 및 강알칼리로는 분해되지만 열에 대하여는 안정하여 270 내지 280℃ 이상으로 가열하지 않으면 분해되지 않기 때문에, 가공식품 특히 땅콩 및 견과류를 원료로 사용한 가공식품에서는 아플라톡신이 종종 검출된다.
상기 미생물제제를 사용하는 일례로, 동물, 가축이 섭취하는 식물에 서식하는 곰팡이의 독소생성을 저해하기 위하여 사용할 수 있으며, 식물의 파종, 재배, 수확, 저장, 가공 및 유통기간 중에 적용하여 곰팡이의 독소생성을 저해시킬 수 있다.
종래에는 미코톡신을 파괴하기 위한 방법으로 열처리, 암모니아처리, 스크리닝 또는 방사선 처리 등이 이용되었지만 이러한 방법은 상업적으로 응용하기에는 너무 비싸거나 비실용적이고, 적용되는 대상이 곡물이나 사료 등 식품일 경우 필수 영양소 등을 파괴하여 식품의 질을 저하시키는 문제점이 있었다.
그러나 본 발명의 미생물제제는 락토바실러스 플란타룸 YML007를 증식시킨 것으로 비용면에서 경제적이고 천연에서 분리하여 무독성으로 부작용이 없으며, 식품의 질을 저하시키지 않고, 그 효과 또한 실시예 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 양성 대조군인 유기산과 동일하게 아플라톡신을 포함한 미코톡신 생산을 저해함을 확인할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YML007, 이의 배양물, 또는 이의 생산물을 포함하는 병원균 진균류 방제제를 제공한다.
상기 병원성 진균류의 종류는 동물 및 식물에 질환이나 손상을 야기시키는 모든 진균류를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 효모 및 곰팡이를 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 푸사리엄 (Fusarium), 페니실리엄 (Penicillium), 칸디다 (Candida) 및 사카로미세스 (Saccharomyces)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물을 포함할 수 있다.
상기 병원성 진균류 방제제가 적용될 수 있는 질환은 특별히 한정된 것은 아니며, 벼도열병 (Pyricularia oryzae), 입고병 (Pythium ultimum), 벼문고병 (Rhizoctonia solani), 사과부패병 (Botryoshaeria dothidea), 깨씨무늬병 (Bipolaris sorokniana), 잿빛곰팡이병 (Botrytis cinerea), 고추탄저병 (Colletotrichum gloeosporioides), 벼도열병 (Pyricularia grisea), 수박덩굴마름병 (Mycosphaerella melonis), 고추역병 (Phytophthora capsici), 토마토겹둥근무늬병 (Alternaria solani), 근부병 (Fusarium oxysporum), 균핵병 (Sclerotinia sclerotiorum), 버섯곰팡이병 (Neurospora sp.) 흰가루병, 역병, 만고병, 겹무늬 썩음병 또는 동물 병원성 진균인 칸디다증 (Candida albicans)이 포함될 수 있다.
본 발명의 미생물제제나 방제제는 적용하기 전에 적당한 양의 물 또는 다른 희석제로 희석되어, 직접 적용하기에 적합한 형태 또는 농축액 또는 1차 조성물 형태일 수 있으며, 방제효과를 나타내는 농도는 특정 제제의 성질, 적용 식물 및 동물의 종류, 재배지역의 토양 및 기후 등에 따라 다양할 수 있음은 당업계에 명백할 것이다.
본 발명의 미생물제제나 방제제는 당업계에 공지된 방식의 제제화 방식에 따라, 예컨대 배양된 균체의 배양액, 동결건조 균체와 전분, 조단백질 및 암석분 등을 포함하도록 분말, 펠렛 또는 과립, 마이크로캡슐 등으로 제형화하여 그대로 사용할 수 있다. 상기 미생물제제 또는 방제제는 계면활성제, 분산제, 표면 활성화제, 담체, 보존제, 습윤제, 공급 촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, U.V. 보호제, 완충제 등 목적 병원균 및 작물, 곡류 등 살포 대상에 따라 적용하기 용이한 다른 성분을 부가함으로 수득할 수 있다. 또한, 부가적으로 포함되는 부형제는 상기 미생물제제 또는 방제제의 용도 및 적용방법에 따라 적절한 물질을 사용하는 것이 바람직하며, 식물 또는 동물에 해가 없는 모든 종류의 물질이 바람직할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YML007, 이의 배양물, 또는 이의 생산물을 포함하는 식품 보존제를 제공한다.
본 발명의 식품은 곤충을 포함한 동물이 섭취할 수 있는 모든 것을 의미하며, 상기 식품에는 사료를 포함할 수 있다.
상기 식품 보존제가 적용될 수 있는 구체적인 예로는, 본 발명의 식품 보존제가 적용될 수 있는 식품의 구체적인 예로는 곡류, 곡류가공품, 야채, 과일, 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 야채와 과일의 혼합쥬스, 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효유식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류, 곤충 사료류, 가축 사료류, 애완동물 사료류 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 보존제는 유해 병원성 미생물의 생육억제 및 사멸효과가 있고 식품을 무처리군에 비해 오래 유지하거나 보존하는 활성을 갖게 할 수 있다.
상기 락토바실러스 플란타룸 YML007는 전통적으로 장기간 섭취해온 김치로부터 분리되어 생체내에 무독함이 입증된 균주로, 사료를 포함한 다양한 식품내 첨가하여도 가축이나 인간에게 무해하고 부작용이 없을 뿐 아니라, 유해 병원성 미생물, 바람직하게는 곰팡이나 효모를 포함한 각종 진균류에 의해 식품에 발생하는 피해를 방지할 수 있어, 이를 식품 보존제로 사용함으로 식품의 유통 중 품질을 유지하고 장기간 저장 효율을 높일 수 있다.
상기 진균류에 대한 본 발명의 일례로, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물을 들 수 있으며, 바람직하게는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 푸사리엄 (Fusarium), 페니실리엄 (Penicillium), 칸디다 (Candida) 및 사카로미세스 (Saccharomyces)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물일 수 있다.
곰팡이는 자연 환경 중에 널리 존재하고 온도, 습도 등의 조건만 맞으면 급속히 번식하기 때문에 WHO나 FAO 같은 국제기구에서는 식품의 안전성 문제에 있어서 식품첨가물이나 잔류농약보다 곰팡이독인 마이코톡신의 위험이 더 큰 것으로 논의되고 있다. 또한 일단 생성된 마이코톡신은 일반적인 가공, 조리시의 열처리 정도로는 파괴되지 않기 때문에 마이코톡신에 오염된 농산물이나 이를 사료로 섭취한 가축을 원료로 한 가공식품에도 이전되게 되며, 곰팡이가 눈에 보이지 않아도 마이코톡신에 오염되어 있을 수 있기 때문에, 천연에서 분리되어 부작용이 없이 마이코톡신을 무독화시킬 수 있는 본 발명의 식품 보존제는 식품산업에 활용가치가 클 것이다.
본 발명에 의해 생산이 저해되는 마이코톡신의 종류는 특별히 한정된 것은 아니며, 아플라톡신 (aflatoxins), 오크라톡신 (ochratoxin), 트리코텐션즈 (trichothecenes: deoxynivalenol, nivalenol), 제랄레논 (zearalenone), 푸모니신 (fumonisins), 보미톡신 (Vomitoxin), 맥각 (Ergot), 후모니신 (Fumonisin), 및 T-2 톡신 (T-2 toxin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 아플라톡신 (aflatoxins)일 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YML007, 이의 배양물, 또는 이의 생산물은 임의의 추가적인 첨가제를 사용하지 않고서도 동물, 인간이 섭취하는 다양한 식품에 포함된 진균류 및 마이코톡신을 억제할 수 있으나, 본 발명의 물질 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 구체적으로 이에 제한되는 것은 아니나, 식품 위생목적의 다른 첨가물, 예컨대 미생물생육 억제물질 등이 있다.
본 발명의 식품 보존제는 식품 보존 필요성에 맞게 편리하고 적합한 방법으로 액상, 고상, 파우더 형태 등으로 다양하게 제제화될 수 있다.
상기 식품 보존제를 식품 제조 공정시 원료와 함께 배합할 수 있으며, 본 발명의 일례로, 상기 식품 보존제에 식품을 담그거나, 담근 후 휘젓거나, 보존제를 뿌리거나, 직접 혼합함으로써 이를 식품에 고르게 적용될 수 있도록 할 수 있다.
하기 도 5은 이를 뒷받침 해 주는 데이터로 옥수수를 곰팡이가 생성가능한 조건에서 60일간 저장하였을 때, 양성 대조군인 유기산으로 처리한 군보다 락토바실러스 플란타룸 YML007의 배양액으로 처리한 군이 품질저하 없이 저장효율이 우수함을 확인할 수 있다.
또한, 락토바실러스 플란타룸 YML007 처리된 옥수수를 섭취한 쥐의 몸무게가 대조군 및 유기산을 처리한 군보다 각각 2.95g 및 1.1g이 높아 진균류에 의해 옥수수의 영양분이 훼손되지 않고 우수한 질을 유지하여, 본 발명의 상기 물질이 식품보존제로서 우수한 효과를 나타냄을 입증하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
실시예 1-1 : 프로바이오틱 균주 및 배지
30에서 24시간 동안 MRS 고체배지 또는 MRS 액체배지 (Difco laboratories, Detroit, MI, USA)를 사용하여 김치로부터 분리하고, 16S rRNA 염기서열분석 (16S rRNA sequencing)을 사용하여 계통학적 분석 및 균주 동정을 수행하였다.
상기 동정된 미생물은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum )임을 확인하고, 이를 락토바실러스 플란타룸 YML007 (Lactobacillus plantarum YML007)으로 명명하였다.
실시예 1-2: 여과 살균된 무세포성 상등액 준비
30℃에서 24시간 동안 MRS 액체배지 (MRS broth)에서 락토바실러스 플란타룸 YML007을 배양하였다. 10분 동안 10000 xg에서 배양액을 원심분리하여 무세포성 상등액을 얻었고 0.45 ㎛ 포어크기 필터 (Sartorius stedim biotech, Germany)를 통해 여과하였다. 1M NaOH로 상등액의 pH를 pH 6으로 조정하여 이를 실험에 사용하였다.
실시예 1-3: 포자용액 준비
곰팡이는 적절한 포자형성이 일어날 때까지 7일 동안 30℃에서 PDA 하드아가 플레이트 (PDA hard agar plates)에서 배양되었다. 0.05% (v/v) Tween 80를 함유한 살균수를 넣고 부드럽게 흔들면서 아가 플레이트로부터 포자를 수거한 다음, -80℃ 글리세롤/증류수 (20:80, v/v) 에 저장하였다. 포자 농도는 ml당 106 으로 조정하였다.
< 실시예 2>
실시예 2-1: 옥수수
락토바실러스 플란타룸 YML007 (Lactobacillus plantarum YML007)의 보존효과 (preservative effect)를 측정하기 위해, 신선한 옥수수를 한국시장으로부터 구입하였다. 옥수수의 수분 함량을 앞으로의 처리에 앞서 16 퍼센트로 조정하였다. 옥수수를 3가지 그룹으로 분류하였는데, 첫 번째 그룹은 특별한 처리없는 것으로 이를 대조군 (T1R1)으로 하였고, 두 번째 그룹은 유기산으로 처리한 것이며 (T2R2), 세 번째 그룹은 여과살균된, 락토바실러스 플란타룸 YML007 (Lactobacillus plantarum YML007)의 무세포상등액으로 처리 (T3R3)한 것이다.
옥수수를 플렌터리 믹서 (planetary mixer)로 혼합한 다음 저장하였다.
실시예 2-2: 정량 ( Dosage )
T2R2 옥수수 샘플에 1톤당 2리터 유기산을 처리하였다. 모든 화학물질은 Sigma Aldrich USA로부터 구입하였다. 두 배 농축된 락토바실러스 플란타룸 YML007 (Lb . plantarum YML007)의 무세포 상등액을 T3R3 옥수수 샘플에 처리하였다. 상기 샘플의 농축은 한일과학산업 (Hanil science industrial co., ltd., Korea)에서 구입한 Modulespin 40 - a vacuum concentrator으로 수행되었다.
< 실시예 3>
실시예 2에 따라 제조된 각 샘플에다 시간경과에 따라 수분 함량, 에테르함량, 아플라톡신 농도 및 곰팡이 개수를 측정하였다.
실시예 3-1: 조지방 및 수분함량의 측정
옥수수의 수분함량은 상온압력하 105℃~ 110℃에서 5시간 동안 일정한 무게까지 오븐 안의 옥수수에 열을 가하고 KETT electronic laboratory (Japan)으로부터 구입한, 적외선 수분 결정 밸런스 (infrared moisture determination balance (FD-610))를 사용하여 옥수수의 수분함량을 측정하였다.
2.5g 옥수수 샘플의 총 지질함량은 속슬레 침출장치와 40℃부터 60℃까지 범위의 석유-에테르-끓임에 의한, 유기 용매 추출 방법에 의해 결정되었다 (Nielsen, 1994). 회분 함량 분석은 2시간 동안 600℃ 머플로 (muffle furnace)에서 탄소가 제거된 물질의 연소 후에 수행되었다.
상기 실시예 2에 의해 제조된 T1R1, T2R2, 및 T3R3의 세 그룹의 옥수수를 이용하여 옥수수 저장 후 1일째, 15일째 그리고 30일마다 조지방 및 수분함량을 분석하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 옥수수 저장 후 30일째, 음성대조군인 옥수수 (T1R1)는 기간이 경과에 따라 수분함량의 감소가 크지 않고 전체 지방함량 감소폭이 상대적으로 큰데 반하여, 락토바실러스 플란타룸 YML007은 수분함량을 상대적으로 가장 크게 감소시켜서 곰팡이의 증식과 아플라톡신의 생산을 저해하고 지방함량을 처음과 동일하게 높게 유지시킴으로, 옥수수 질을 동일하게 유지시켰다.
실시예 3-2: 아플라톡신 농도, 에테르 함량 및 곰팡이 갯수의 측정
아플라톡신의 분석을 위해, 아플라톡신을 아세톤으로 추출하였고, 아플라톡신 이외의 다른 현광물질을 제거하기 위해 cupric carbonate 및 ferric gel로 처리하였다. 이후, 이를 산과 알칼리로 세척하고 클로로포름으로 추출한 후, 건조하고 다시 클로로포름 재희석한 후 기준치 (standards)와 함께 활성화된 TLC 플레이트상에 넣었다 (spotted). 아플라톡신의 농도를 UV 뷰잉 캐비넷 (UV viewing cabinet)에서 가시적 대조법을 사용하여 확인하였다. 곰팡이 개수 측정은 분쇄한 옥수수 1g을 멸균 증류수에 넣어 107 까지 희석하여 평판도말방법으로 측정하였다. 에테르 함량 측정은 분쇄한 옥수수 2.5g에 petroleum ether(Sigma, USA)를 첨가한 후 Soxhlet extractor에서 4시간 동안 추출하였다. 추출물을 건조하여 무게의 변화를 확인하여 에테르 함량 변화를 측정하였다.
실시예 2에 따라 제조된 T1R1, T2R2, 및 T3R3의 세 그룹 옥수수에서 옥수수 저장 후 1일째, 15일째 및 30일째마다 에테르 함량, 아플라톡신 농도 및 곰팡이 갯수를 측정하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 옥수수 저장 후 30일째, T2R2 및 T3R3에서는 곰팡이 생성이 제로에 가까웠고 아플라톡신 생성이 거의 나타나지 않은데 반하여, 대조군 옥수수인 T1R1에서는 아플라톡신 생산이 높았고, 곰팡이 수가 압도적으로 많았으며, 더 적은 에테르 추출물이 관찰되었다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YML007가 처리된 옥수수에서 평균적인 아플라톡신 생산은 5 ppb를 초과하지 않았는데, 이는 식품 및 사료를 위해 사용되는 옥수수 곡물에서의 아플라톡신 내성이 20 ppb/kg인 것을 고려할 때 우수함을 확인할 수 있다.
< 실시예 4>
실시예 4-1: 항곰팡이 활성분석
항곰팡이 활성의 예비분석을 위해, 페이퍼 디스크 분석 (paper disk assay (Yang and Chang, 2010)) 및 아가웰 분포분석 (agar well diffusion assay)이 사용되었다. 페이퍼 디스크 분석을 위해, 8mm 페이퍼 디스크가 사용되었고 Advantec Roshi Kaisha (Ltd, Tokyo, Japan)로부터 구입되었다.
아가웰 분포분석 (agar well diffusion assay)을 위해, 5mm에서 22.5mm의 다양한 직경을 지닌 콜크보러 (cork borers)를 Korea Ace로부터 구입하여 사용하였다. 각각의 페이퍼 디스크에 60 ㎕ 샘플을 넣었고, 아가웰 분포분석을 위해 각 웰에 100 ㎕ 샘플을 넣었다.
15℃에서 2시간 동안 상기 플레이트들을 예비배양한 후, 각 인티케이터 균주 (indicator strains)를 위한 최적 성장온도에서 배양하고 24시간 및 48시간 후에 저해존 (inhibition zones)을 조사하였고, 종래에 사용되는 곰팡이 저해제인 소르빈산칼륨 (Potassium sorbate) 및 벤존산나트륨 (Sodium benzoate)과 락토바실러스 플란타룸 YML007의 저해존을 조사하였다.
소르빈산칼륨 (Potassium sorbate)를 20 mM 아세트산나트륨 (sodium acetate, pH 4.0)에 용해시키고 0.1% (w/v) (Davidson, 2001 and Yang and Chang, 2010)로 조정하고, 벤존산나트륨 (Sodium benzoate)를 20 mM 아세트산 나트륨 (sodium acetate, pH 4.0)에서 0.1% (w/v)로 조정하였다.
저해존 (inhibition zones)의 직경을 측정한 다음, 8mm 페이퍼 디스크 및 7mm 웰 각각의 직경을 총 저해존 (inhibition zones)의 직경에서 뺐다.
Mold
 클리어존 직경(mm)
락토바실러스 플란타룸 YML007 		클리어존 직경(mm)
소르빈산칼륨 0.1% (w/v)		 클리어존 직경(mm)
벤존산나트륨 0.1% (w/v)
아스퍼질러스 니게르 KCTC16683 17.2 6 5.4
아스퍼질러스 플라버스 KCTC16682 15.3 5.3 3.8
푸사리엄 옥시스포럼 KCTC6434 13.4 3.9 4.7
푸사리엄 옥시스포럼 KCTC16909 15.2 4.4 2.5
아스퍼질러스 오리제 15.4 4.6 3.2
칸디다 알비칸스 12.5 0.0 0.0
사카로미세스 세레비시아 11.2 0.0 0.0
The diameters of the zone of inhibition were measured, and diameter of the 8mm paper disk and 7mm of well was subtracted from the total diameter of inhibited zone
표 1은 락토바실러스 플란타룸 YML007은 모든 아스퍼질러스 니게르 KCTC16683 (Aspergillus niger KCTC16683), 아스퍼질러스 플라버스 KCTC16682 (Aspergillus flavus KCTC16682), 푸사리엄 옥시스포럼 KCTC6434 (Fusarium oxysproum KCTC6434), 푸사리엄 옥시스포럼 KCTC16909 (Fusarium oxysproum KCTC16909), 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus oryzea ), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans ), 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)에 저해활성을 나타내었다.
즉, 락토바실러스 플란타룸 YML007은 소르빈산칼륨, 벤존산나트륨에 비해 다양한 곰팡이 및 효모 균종에 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있고, 그 저해 정도 또한 압도적으로 높음을 확인할 수 있다.
실시예 4-2: 항곰팡이 활성분석
종래에 사용되는 곰팡이 저해제인 소르빈산칼륨 (Potassium sorbate) 및 벤존산나트륨 (Sodium benzoate)과 락토바실러스 플란타룸 YML007의 항곰팡이 활성을 비교하였다.
필터 여과된 락토바실러스 플란타룸 YML007는 20 mM 아세트산나트륨 (sodium acetate, pH 4.0)에서 농축되었다 (5배). 아스퍼질러스 니게르 KCTC16683 (Aspergillus niger KCTC16683), 아스퍼질러스 플라버스 KCTC16682 (Aspergillus flavus KCTC16682), 푸사리엄 옥시스포럼 KCTC6434 (Fusarium oxysproum KCTC6434), 푸사리엄 옥시스포럼 KCTC16909 (Fusarium oxysproum KCTC16909), 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus oryzea ), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans ), 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae )를 민감성 균주 (sensitive strains)로 사용하였다.
곰팡이
 락토바실러스 플란타룸 YML007 에 의한 저해 소르빈산칼륨 0.1% (w/v)에 의한 저해 벤존산나트륨 0.1% (w/v)에 의한 저해
아스퍼질러스 니게르 KCTC16683 +++ + +
아스퍼질러스 플라버스 KCTC16682 +++ + -
푸사리엄 옥시스포럼 KCTC6434 +++ - +
푸사리엄 옥시스포럼 KCTC16909 +++ - -
아스퍼질러스 오리제 +++ - -
칸디다 알비칸스 +++ - -
사카로미세스 세레비시아 +++ - -
The following scale was used: (-) No Inhibition, (+) Weak Inhibition, (+++) Strong Inhibition.
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 5배로 농축된 락토바실러스 플란타룸 YML007의 무세포성 상등액의 항곰팡이 활성 정도 및 저해범위가 소르빈산칼륨 및 벤존산나트륨과 같은 종래에 많이 사용되는 식품 보존제 (preservatives)에 비해 압도적으로 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5>
실시예 5-1: 동물 테스트
12마리의 젊고 건강한 쥐를 선택하여 3그룹으로 무작위로 분류한 후, 실시예 2에 따라 제조된 대조군 옥수수와 처리된 옥수수 (T2R2/T3R3)를 30일 동안 섭취시키면서 옥수수 소비량과 체중을 매일 기록하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 30일 후에 체중을 측정시 락토바실러스 플란타룸 YML007으로 처리한 옥수수를 먹인 쥐의 총 평균 몸무게는 대조군 옥수수를 먹인 쥐의 몸무게 및 유기산 처리한 옥수수를 먹인 쥐의 몸무게보다 각각 2.95g 및 1.1g이 더 많았고, 사료요구율 (feed consumption ratio, FCR) 또한, 락토바실러스 플란타룸 YML007으로 처리된 옥수수를 섭취한 쥐가 가장 낮았다.
실시예 5-2: 옥수수 저장성 비교
실시예 2에 따라 제조된 옥수수를 60일간 저장한 후, 옥수수의 상태를 통해 이의 저장성을 비교해 보았다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, T1R1, T2R2, 및 T3R3의 세 그룹의 옥수수 중 락토바실러스 플란타룸 YML007으로 처리된 옥수수가 가장 장기간 저장 효율이 좋음을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12032 20111020

Claims (7)

  1. 락토바실러스 플란타룸 YML007 (수탁번호:KCTC 12032BP) 또는 이의 배양물.
  2. 락토바실러스 플란타룸 YML007 (수탁번호:KCTC 12032BP) 또는 이의 배양물을 포함하는, 아스퍼질러스 니게르 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus oryzea), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 및 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 병원성 진균류 방제용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 조성물은 마이코톡신 (mycotoxin) 생산을 저해하는 것을 특징으로 하는 병원성 진균류 방제용 조성물.
  6. 락토바실러스 플란타룸 YML007 (수탁번호:KCTC 12032BP) 또는 이의 배양물을 포함하는, 아스퍼질러스 니게르 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus oryzea), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 및 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 병원성 진균류 방제용 미생물제제.
  7. 락토바실러스 플란타룸 YML007 (수탁번호:KCTC 12032BP) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품보존제.
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