KR101899650B1 - 작물 생육 촉진 또는 항진균 활성을 가지는 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 및 이의 이용 - Google Patents

작물 생육 촉진 또는 항진균 활성을 가지는 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 생장 촉진, 인산 가용화 및 항진균 활성을 가지는 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 (수탁번호 KCTC 13064BP), 이를 이용한 미생물 제제에 관한 것이다. 본 발명의 상기 신규 균주는 식물 생장 촉진, 인산 가용화 및 항진균 활성을 가지는 것을 실험적으로 확인하였는 바, 친환경 농법에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

작물 생육 촉진 또는 항진균 활성을 가지는 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 및 이의 이용 {Novle Lactobacillus plantarum KNU-03 strain having activities plant growth promotion and antifungal, and uses thereof}
본 발명은 식물 생장 촉진 활성 또는 항진균 활성을 가지는 신규한 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 (수탁번호 KCTC 13064BP), 이의 배양물, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 또는 항진균용 미생물 제제 조성물에 관한 것이다.
식물의 병징은 식물 병원체인 세균, 진균 및 바이러스에 의해 일어난다. 특히 진균의 경우 그 종류가 매우 다양하고 진균이 자랄 때 균사를 생성하여 식물체 내로 침투하고 포자를 형성하기 때문에 작물 병 방제가 어렵다. 또한 진균의 균사와 포자는 강우 및 바람과 같은 환경적인 요인에 의해 토양이나 다른 작물로 전파가 되고 작업자의 옷에 묻어 다른 작물로 전파가 되기도 하므로 병의 확산 속도가 빠르다. 이러한 이유로 진균에 의한 식물 병 발생은 작물 재배에 많은 어려움을 주고 있다.
실제로 고추 역병을 유발하는 Phytophthora capsici , 마늘 부패병을 유발하는 Fusarium oxysporum, 딸기의 잿빛곰팡이병을 유발하는 Botrytis cinerea 와 같은 식물 병원성 진균의 확산에 의한 피해 사례가 매년 속출하며 이에 의한 작물 농가의 경제적 손실이 매우 큰 실정이다. 이러한 식물 병원성 진균의 확산을 막고 예방하기 위하여 작물을 재배하면서 살균제 (fungicide)를 다량 살포하는 것으로 알려져 있다.
화학 농약은 종류에 따라 잔류성의 차이가 있으며 화학 농약의 분해 산물이 환경 및 인체에 미치는 영향에 대한 연구가 미비한 상황이다. 또한 진균에 의한 식물 병징의 방제를 위해 살균제의 사용이 증가함에 따라 살균제에 대한 내성을 가지는 식물 병원성 진균이 발생할 수 있으며 많은 양의 살균제 사용은 토양 및 수질 환경 오염을 유발 시킬 수 있다.
근래에 들어 천연물을 이용한 친환경 농법이 많이 연구되고 사회적으로도 화학농약에 대한 불감증이 증가하고 있으므로 천연물 및 미생물을 이용한 식물 병 방제 및 작물 생육 촉진에 대한 연구가 많이 이뤄지고 있다(한국 공개특허 제2011-0135478호 참조). 추가적으로 이러한 연구에 사용되는 미생물은 환경 및 인체에 무해한 미생물을 많이 이용하며 현재 농촌진흥청에서는 화학 농약 및 비료로 대체 가능한 농업용 유용 미생물의 목록을 고시하고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 친환경 식물 생장 촉진용 또는 항진균용 미생물 제제를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 신규한 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주에 식물 생장 촉진 활성 또는 항진균 활성이 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 식물 생장 촉진 또는 항진균 활성을 가지는 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 (수탁번호 KCTC 13064BP) 및 이를 이용한 미생물 제제를 제공하는 데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 생장 촉진 또는 항진균 활성을 가지는 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 (수탁번호 KCTC 13064BP)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 균주는 서열번호 2 내지 서열번호 5의 식물 생장 촉진능을 가지는 생물 생장 호르몬 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 균주는 서열번호 6 내지 서열번호 8의 인산 가용화능을 가지는 인산 가용화 효소 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 (수탁번호 KCTC 13064BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물 생장 촉진용 또는 항진균용 미생물 제제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는, 식물 생장 촉진용 또는 항진균용 미생물 비료를 제공한다.
아울러 본 발명은 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물 생장 촉진 또는 항진균 방법을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주는 식물 생장 촉진 또는 항진균 활성을 가지는 것을 실험적으로 확인하였는바, 친환경 농법 미생물 제제로써 유용하게 사용될 수 있으며, 식물 생장 촉진, 인산 가용화, 항진균 관련 유전자 서열을 밝혀 이를 이용하여 다양한 조건에서 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 오옥신 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주가 생성하는 인산 가용화 효소 (phosphatase) 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주가 나타내는 항진균 활성을 나타낸 도이다.
도 4은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 형태적 특성은 그람염색법을 이용하여 나타내었고 상기 균주의 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 5은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자(rDNA)의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 6는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자(rDNA)의 염기서열을 공지 균주와 비교하여 계통분류학적 모식도로 나타낸 도이다.
도 7는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 식물 생장 촉진 능과 관련된 식물 호르몬 역할을 나타내는 Tryptophan synthase alpha chain (EC 4.2.1.20; 서열번호 2), Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20; 서열번호 3), Anthranilate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.18; 서열번호 4), Phosphoribosylanthranilate isomerase (EC 5.3.1.24; 서열번호 5)의 유전자 염기 서열이다.
도 8은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주가 생성하는 인산 가용화 효소를 나타내는 Manganese-dependent inorganic pyrophosphatase (EC 3.6.1.1; 서열번호 6), Exopolyphosphatase (EC 3.6.1.11; 서열번호 7), Alkaline phosphatase synthesis transcriptional regulatory protein PhoP(서열번호 8)의 유전자 염기 서열이다.
본 발명은 식물 생장 촉진 또는 항진균 활성을 가지는 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 (수탁번호 KCTC 13064BP)를 제공한다.
상기 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 서열은 서열번호 1로 표시되는 것이다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 공시 균주인 Lactobacillus plantarum subsp . arentoratensis DK022T 와 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
이에 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주로 명명하고, 2016년 08월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13064BP를 부여 받았다.
본 발명의 상기 균주는 토양시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 질산을 환원시키고, 혐기 조건하에서 포도당을 에너지원으로 사용하며, D-갈락토오스, D-만노오스, D-프룩토오스, D-만니톨, D-글루코오스, L-아라비노오스 등의 탄소원을 에너지원으로 사용함을 확인하였다.
상기 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주는 식물의 생장호르몬을 생산하는 능력, 인산을 가용화하는 능력 및 항진균 능력을 가진다.
본 발명에서 생장 촉진의 대상이 되는 식물로는 밀, 보리 벼와 같은 벼과 작물에 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
식물은 생장과 발달을 조절하여 여러 환경 변화에 대처 및 적응하는 시스템을 가지고 있다. 특히 식물의 발달 조절은 주로 외부 환경과 식물의 내재적 발달 프로그램과의 상호 작용을 통해 일어나는 것으로, 주로 식물 호르몬들이 그러한 상호작용에 필수적인 기능을 수행하는 것으로 알려져 있으며, 특히 오옥신 (Auxin, IAA)은 식물이 씨에서 발아하여 생장하거나, 줄기의 신장에 관여하는 것으로 알려져 있다.
이에 대하여, 상기 식물 생장 촉진 능을 확인하기 위해서, 균주가 생성하는 식물 생장 촉진 호르몬 오옥신 (Auxin, IAA) 생성량 측정 시험을 통해서 확인하였다(도 1).
또한 식물 생장에 필요한 영양원 중의 하나로서 인 (P) 성분이 있는데, 토양 중에 존재하는 인산은 산성토양에서는 철 및 알루미늄 이온과, 알칼리성 토양에서는 칼슘이온과 쉽게 결합하여 불용화되어 있어 토양 중에서 식물이 이용할 수 없는 불용성 인산의 양만 증가되어 있다. 실제로 인산은 토양 중 약 0.05 %(w/w)를 차지하고 있으나, 식물 또는 미생물이 이용할 수 있는 인산양은 그 중에서도 0.01 %에 불과하다. 또한, 난용성 인산염을 식물이나 미생물이 이용하기 쉬운 H2PO4-나 HPO4 2 -의 이온형태로 전환시켜주는 과정을 ‘가용화'라고 한다.
이에 본 발명자들은 상기 균주의 인산 가용화능을 확인하기 위해서 균주가 생성하는 인산 가용화 효소 (phosphatase)의 활성 측정 시험을 수행하여, 상기 균주에 인산 가용화 능이 있다는 것을 확인하였다(도 2).
또한 본 발명자들은 상기 균주의 항진균 활성을 균주와 식물 병원성 진균의 대치배양을 통해 확인하였으며, 상기 균주에서 다양한 작물에 모잘록병과 뿌리썩음병을 유발하는 식물 병원성 진균인 Phythium ultimum에 대한 항진균 활성을 확인하였다(도 3).
또한, 상기 균주의 형태학적 특성은 그람 염색법을 통해 그람 양성균인 것으로 확인되었고(도 4), 생화학적 특성은 Api kit 20 측정 시험에서 확인되었다(표 1).
따라서 본 발명의 균주에는 식물 생장을 촉진할 수 있는 효과 및 항진균 효과가 있다는 것을 확인하였고, 이에 따라, 상기 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자 (rDNA)를 확인하였다. 상기 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자 (rDNA)는 16S rRNA gene sequencing에서 확인되었다(서열번호 1, 도 5).
상기 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자 (rDNA)를 이용한 계통분류학적 모식도를 확인하여 도 6에 나타내었다. 상기 균주의 계통분류학적 모식도는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0 version에서 확인된 것이다.
또한 본 발명에서 상기 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 whole genome을 이용한 식물 생장 촉진 관련 유전자를 확인한 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 균주가 가지는 유전자들은 Ion torrent PGM genome sequencing에서 확인되었다.
상기 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 whole genome을 이용한 인산 가용화 관련 유전자를 확인한 결과를 도 8에 나타내었다. 상기 균주가 가지는 유전자들은 Ion torrent PGM genome sequencing에서 확인되었다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 식물 생장 촉진 호르몬인 오옥신의 생성량을 측정하였고 인산 가용화 능, 항진균 능을 확인하였으며, 식물 생장 호르몬 역할을 나타내는 Tryptophan synthase alpha chain (EC 4.2.1.20; 서열번호 2), Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20; 서열번호 3), Anthranilate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.18; 서열번호 4), Phosphoribosylanthranilate isomerase (EC 5.3.1.24; 서열번호 5)의 유전자 염기 서열, 인산 가용화 효소 역할을 하는 Manganese-dependent inorganic pyrophosphatase (EC 3.6.1.1; 서열번호 6), Exopolyphosphatase (EC 3.6.1.11; 서열번호 7), Alkaline phosphatase synthesis transcriptional regulatory protein PhoP(서열번호 8)의 유전자 염기 서열이 밝혀졌다.
따라서 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물 생장 촉진용 또는 항진균용 미생물 제제/비료를 제공할 수 있는 것이고, 상기 미생물 제제/비료를 처리함으로서, 식물 생장을 촉진 또는 항진균 방법을 제공할 수 있는 것이다.
본 발명에서 상기 배양물은 균주를 배양한 보통 한천배지 (또는 영양 한천배지; Nutrient agar)배지, 또는 TSA (tryptic soy agar) 배지로부터 분리하여 얻은 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물 제제 조성물은 통상적인 방법으로 식물 생장 촉진용 또는 항진균용으로 제형화할 수 있으며 건조분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제 조성물은 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 바람직하게는 화학비료를 대체하기 위한 식물 생장 촉진 생물비료로 제형화 할 수 있고, 즉 화학 비료 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물비료로 제형화가 가능하다.
본 발명에서 상기 미생물 제제는, 균주 또는 이의 배양물에 첨가제, 증량제, 영양제등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 첨가제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있고, 증량제 및 영양제로는 skim milk (배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트 (bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트 (bentonite), 탈크 (talc), 다이아라이트 (dialite), 카올린 (kaolin) 및 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양 또는 식물에 처리함으로써 식물의 생장을 촉진하고 진균의 생육을 억제하는 방법을 제공한다. 이때, 처리방법에는 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포 (예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용 (예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용 (예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있다. 그 사용량은, 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
본 발명에서, 상기 방법에 따라 처리되는 제제에 함유된 미생물의 유효량은 경작지 면적 (㎡) 당 1 내지 1×10100의 미생물 수로 포함될 수 있다. 또한, 상기 방법 중 살포에 의해 처리되는 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10100의 미생물 농도로 포함될 수 있으며, 침지에 의해 처리되는 조성물에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10100의 미생물 농도로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 락토바실러스 플랜타럼 ( Lactobacillus plantarum ) KNU-03 균주의 분리 및 동정
1-1. 토양으로부터 락토바실러스 플랜타럼 ( Lactobacillus plantarum ) KNU-03 균주의 분리 및 동정
식물 생장 촉진제로써 활용 가능한 미생물을 분리하기 위해 경북 상주시 소재에 품질이 좋다고 알려진 사과 농장의 근권으로부터 토양시료를 수집하였다. 토양으로부터의 미생물 분리는 토양 시료 1 g을 0.85% NaCl solution 9 mL에 넣어 충분히 교반 하고 9 mL의 새 0.85% NaCl solution을 이용하여 단계별 희석을 실시하였다. 희석을 한 각 시료 구간에서 100 μL를 덜어 낸 다음 nutrient agar에 도말 하였다. 단일 콜로니로 자란 미생물들은 콜로니 외형을 이용한 형태학적 분류방법을 이용하여 분리를 하였고 분리한 미생물을 이용하여 식물 생장 촉진제로써의 활성을 평가하여 최종 분리 균주를 선정하였다. 최종 분리된 균주는 16S rRNA gene 영역을 증폭하여 염기서열을 분석하여 동정하였다.
1-2. 식물 생장 촉진 호르몬 생성량 측정
오옥신 생성을 확인하기 위해 분리균주를 3 mg/mL의 L-Tryptophan이 포함된 5 mL의 nutrient broth 배지에 접종한 다음 동일 배양조건에서 16시간 배양하였다. 이 중 1 mL을 회수하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 하고 상등액을 0.20 μm membrane filter로 여과하여 배양 상등액을 준비하였다. 배양 상등액 500 μL를 test tube에 옮기고 1 mL의 salkowski regent와 혼합한 후 30분간 암조건에서 반응시켰다. 반응 후 535 nm에서 흡광도를 측정하였고 오옥신의 정량은 IAA 표준품 (Sigma Aldrich, Germany)을 이용하여 제조한 검량곡선에 대입하여 계산되었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 최종 분리 균주인 KNU-03 균주의 오옥신 생성량이 다른 분리 균주들에 비해 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다.
1-3. 인산 가용화 활성 측정
인산 가용화 효소 활성 확인을 위해 분리균주를 5 mL의 nutrient broth 배지에 접종한 다음 동일 배양조건에서 24시간 배양하였다. 분리균주의 액체 배양액을 이용하여 nutrient agar에 획선 도말을 하고 동일 조건에서 24시간 배양했다. 배양한 분리균주는 phosphatase 활성을 측정할 수 있는 phosphate agar (Glucose 10 g, (NH4)2SO4 0.5 g, Yeast extract 0.5 g, MgSO47H2O 0.1 g, Ca3(PO4)2 5 g, MnSO4 0.0001 g, FeSO4 0.0001 g, Agar15 g)에 toothpick을 이용하여 접종하고 동일 조건에서 24시간 배양하였다.
활성 확인은 배지 조성 내 calcium phosphate가 분해되면 불투명했던 배지가 투명하게 변하게 되는데 균주 주위에 투명 환을 형성하는 미생물을 인산 가용화 효소 활성이 있는 균주로 선정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 최종 분리 균주인 KNU-03 균주가 생장하면서 불용성 인산염인 calcium phosphate를 가용화하여 paper disc 주위에 투명 환을 생성하였는 바, 인산 가용화 효소 활성이 있는 것으로 확인되었다.
1-4. 항진균 활성 측정
항진균 활성 확인은 다양한 작물에 모잘록병과 뿌리썩음병을 유발하는 식물 병원성 진균인 Phythium ultimum 과의 대치배양을 통해 확인하였다.
먼저 식물 병원성 진균 P. ultimum 은 곰팡이 배양 최적배지인 PDA agar에서 5 일간 충분히 배양하고, 최종 분리 균주는 MRS agar에서 배양한 단일 콜로니를 MRS broth media에 접종한 다음 30℃에서 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 최종 분리 균주는 원심분리를 실시하여 균체를 회수하고 0.85% NaCl solution에 재 현탁하여 만든 최종 분리 균주의 균체현탁액을 실험에 사용하였다. 대치배양은 PDA media와 nutrient media의 혼합배지인 PDNA 고체 배지에서 실시하였으며, PDNA 고체 배지의 한 쪽에는 식물 병원성 진균 P. ultimum 을 배양하고 다른 한쪽에는 paper disc를 올린 다음 최종 분리 균주 현탁액을 점적 하여 배양하였다.
항진균 활성의 확인은 최종 분리 균주에 의한 식물 병원성 진균의 생육 저해환 유무를 기준으로 판단하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 최종 분리 균주인 KNU-03 균주가 생장하면서 식물 병원성 진균인 Phythium ultimum의 생육을 억제하였는 바, 항진균 활성이 있는 것으로 확인되었다.
1-5. 분리 균주의 동정
식물 생장 촉진, 인산 가용화, 항진균 활성이 우수한 균주의 동정을 위하여 회수한 균체로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후(Thompson, 1980), 분리한 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의하여 16S rRNA gene을 증폭하였다. 이 때 사용한 다용도 프라이머(universal primer)는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 각각 사용하였다(Lane 1991). 증폭한 PCR 산물은 PCR 정제 시스템(Solgent, Daejeon, Korea)을 이용하여 정제하였다. 정제한 PCR 산물의 전체 염기서열을 분석하기 위한 염기서열분석(sequencing)은 솔젠트(Solgent, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 실시하였다.
분석한 염기서열 결과는 NCBI의 BLASTN을 이용하여 비교하였으며, 염기서열의 상동성 및 계통발생학적 모식도(phylogenetic tree)는 Bioedit와 Mega6 프로그램을 통해 인접결합방법(neighbor-joining methods)을 사용하여 분석하였다. 이의 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
분리한 균주는 기존에 보고된 공시 균주인 Lactobacillus plantarum subsp . argentoratensis DKO22T와 99%의 상동성을 가지는 것으로 확인하였다. 상기 균주는 기존의 Lactobacillus plantarum subsp . argentoratensis DKO22T와 1% 상이하기 때문에, 플랜타럼 종에 속하는 신규한 균주로 인정받아, 이를 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 으로 명명하고, 상기 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다 (수탁번호 KCTC 13064BP). 또한 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 염기서열을 확인하였다.
실시예 2. 락토바실러스 플랜타럼 ( Lactobacillus plantarum ) KNU -03 균주의 형태적 및 생화학적 특성
2-1. 형태적 특성
락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 형태적 특성을 확인하기 위하여 그람 염색법을 실시하였다. Lactobacillus 최적 배지인 MRS agar에서 획선 도말법을 이용하여 KNU-03 균주를 배양한 다음 단일 콜로니를 회수하였다. 회수한 단일 콜로니는 0.85% NaCl solution에 현탁한 다음 슬라이드글라스에 올리고 알코올램프를 이용하여 열 고정을 실시하였으며, crystal violet 염색, iodine 염색, ethanol 탈색, safranin 염색 순으로 염색을 실시하고, 마지막으로 증류수로 염색약을 씻어낸 다음 광학현미경으로 KNU-03 균주의 형태적 외형을 확인하였다. 그 결과, 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주는 그람 양성균인 것으로 확인 되었고, 이를 도 4에 나타내었다.
2-2. 당 대사 특성 확인
락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 당 대사 능은 API 20 NE 키트(Bio Merioux사)를 이용하여 공급회사의 실험방법에 따라 실험하였으며, 30℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후 비교하였다. API 20 NE 키트의 색깔 변화 및 균주 생육에 따른 혼탁도를 이용하여 결과를 작성하였고 이의 결과를 표 1에 나타내었다.
유효성분 결과 유효성분 결과
D-칼락토오스 + D-만니톨 +
D-라피노오스 - D-글루코오스 +
D-아라비노오스 - D-멜리비오스 -
D-만노오스 + 글리세롤 -
D-자일로오스 - L-람노서스 -
D-프룩토오스 + L-아라비노오스 +
상기 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주는 D-갈락토오스, D-만노오스, D-프룩토오스, D-만니톨, D-글루코오스, L-아라비노오스를 에너지원으로 사용함을 확인하였다.
실시예 3. 락토바실러스 플랜타럼 ( Lactobacillus plantarum ) KNU-03 균주의 식물 생장 촉진, 인산 가용화 능력 관련 유전자 서열 정보
본 발명자들은 상기 실시 예 1에서 식물 생장 촉진 또는 항진균제로써 활용 가능한 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주가 가지는 식물 생장 촉진, 인산 가용화 능력과 관련된 유전자 서열을 밝히기 위하여 균체로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후 Ion torrent PGM sequencing 장비를 이용하여 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주의 전체 유전자 서열을 밝혔다.
식물 생장 촉진, 인산가용화 능력 관련 유전자 서열 정보는 KNU-03 균주의 전체 유전자 서열 정보를 RAST server에 업로드 하여 유전자 서열 분석을 실시하였고 해당 능력에 관련된 유전자 서열을 확인하였다.
식물 생장 촉진 능과 관련된 효소의 유전자 서열을 나타내는 Tryptophan synthase alpha chain (EC 4.2.1.20), Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20), Anthranilate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.18), Phosphoribosylanthranilate isomerase (EC 5.3.1.24) 의 유전자 염기 서열을 도 6에 나타내었다.
또한 인산 가용화 효소를 나타내는 Manganese-dependent inorganic pyrophosphatase (EC 3.6.1.1), Exopolyphosphatase (EC 3.6.1.11), Alkaline phosphatase synthesis transcriptional regulatory protein PhoP 의 유전자 염기 서열을 도 7에 나타내었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
한국생명공학연구원 KCTC13064BP 20160819
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novle Lactobacillus plantarum KNU-03 strain having activities plant growth promotion and antifungal, and uses thereof <130> MP16-291 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1373 <212> RNA <213> Lactobacillus plantarum KNU-03 16S rRNA <400> 1 cttgcatcat gatttacatt tgagtgagtg gcgaactggt gagtaacacg tgggaaacct 60 gcccagaagc gggggataac acctggaaac agatgctaat accgcataac aacttggacc 120 gcatggtccg agcttgaaag atggcttcgg ctatcacttt tggatggtcc cgcggcgtat 180 tagctagatg gtggggtaac ggctcaccat ggcaatgata cgtagccgac ctgagagggt 240 aatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa 300 tcttccacaa tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg 360 ctcgtaaaac tctgttgtta aagaagaaca tatctgagag taactgttca ggtattgacg 420 gtatttaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 480 caagcgttgt ccgggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 540 gtgaaagcct ttcggctcaa ccgaagaagt gcatcggaaa 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chain (EC 4.2.1.20) <400> 2 atgactgatt taacaacaat ttttaaaaat cataaggcgt ttattgcttt tgtagtggcc 60 ggtgatccta attttgaagc gacagttgac caagttgttg cgttagcaga agcgggttgt 120 gatctcgttg agattggcat tccgttctca gaccctgtgg ctgatggtcc cgaaattcag 180 gccgctgatc tccgtgcgtt tgaccaacac atcacacccc aacgcgtttt tgaattggtg 240 gtggcaattc gagagaagac aactattcca ctcgtgtttt taacctatgc gaacattgtt 300 tatcagtttg gttatgctgc ctttgcccag cagtgtcaaa gtttgaatgt cgcaggcttg 360 attattcccg acatgccact agaagcctct ggtgaacttc gaccaacctt agaccactat 420 ggtattgctt tgattccatt gattgcgcca acgagtgatg atgcacgcat cgcagcgatt 480 gcccagcagg cgcggggctt catttatgtc gtatcatcac taggtgtcac ggggacccgg 540 cgacacatca cgactgattt agcaacactg gtggcgaaga ttcgccatgc gactacgtta 600 cctgtcgcaa ttggttttgg tatccatgag ccagctcagg cccaggccat ggcacaaatt 660 gcggacgggg tcatcgttgg tagtgcagtc gtgcatttga ttgcgacgca ccaaccagcg 720 acagcagtct taagggacta tacgcgacgg atgcggcgcg cattggatgg tcgcacggct 780 gatacagttg actga 795 <210> 3 <211> 1200 <212> DNA <213> Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20) <400> 3 atgattaaaa atcaatcaca ggcggggcgt tacggcgact ttggtggtca gtacgttcca 60 gaaacattaa tgaccgagct acagcggttg gatcgcgcct ttcaacatta ccgacaggac 120 gcgcagtttc aagaagagtt gactgacttg ttgaataact atgcgaaccg gccatcgttg 180 ttgtaccatg cacaacgatt atcagatcaa ttaggtggtg ctcagattta ttttaaacgt 240 gaggacttga accatacggg tgcgcacaag attaacaatg tcttggggca ggcactgttg 300 gcaaagaaga tgggcaaaaa gcgattgatt gctgaaactg gggctggaca gcacggggtc 360 gcaactgcaa ctattgctgc tttgttcggg atggaatgcg acgtctttat gggtaagaaa 420 gacacggatc gtcaagcatt gaatgtttac cggatgcaac tattaggggc caaggtccac 480 ccggtcacga ctggttcaat ggtgctaaag gatgcgatca atgcggcctt acaagagtgg 540 acgcggcgct gtgatgatac agcttatatc atgggctctg caacgggacc acacccattt 600 ccaatgatgg tacatgaatt tcaaagtgtc atcagtgtag aagcccgaca gcagatcctg 660 gaccaaacag gtcatttgcc ggatgccgtc gtggcttgtg ttgggggcgg cagtaacgcc 720 attggaagtt ttgcggcttt tcttgatgat acgtcagttg agctgattgg ctgtgaggca 780 gcgggtaagg gtgttcaaac gccgttgacg 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DNA <213> Alkaline phosphatase synthesis transcriptional regulatory protein PhoP <400> 8 atggataaga ttttagtggt agacgacgaa ccagctatcg tcacgttatt atcatataac 60 ttgaagcagg cggggtacga agttgtgacg gcgacggatg gtgcggacgc gttgtcatta 120 ggcctggccc aatcatttac atgtattttg ttagatttga tgttgccgaa actcgatgga 180 atggaagtaa caaaaaagtt acgacaagaa aaggttcaga cgcctattat tattgtgacg 240 gctaaaaatg atgagtttga taaagtgttc ggcttggaat taggtgcgga cgattatata 300 accaagccgt tttcaccccg cgaagtgctc gctcggatca aagcagttat tcggcggaca 360 acgccggacg agcccgtgac accaccggca cccatgccgc ctgctaatcg tgcggtaatg 420 cttgttggtg atttacagat tgatcaaaac aaataccgag tcgcgcgcaa cgggaaaaat 480 atcagcttga caccaaagga atttgaatta cttgtgtatt ttgttgaacg agaaggtcgg 540 gttctcagtc gtgatgcgat tttaaatcac gtctggggct acgactatgc tagtgagacg 600 cggatcgttg atattcacat ctcacattta cgtgaaaaga ttgaagcaga tcccaagcag 660 ccacggttga tcaggacggt ccggggtttt ggctacgaat ttgtgggtga cggccatgca 720 ta 722

Claims (8)

  1. Phythium ultimum 진균에 대한 항진균 효과 및 식물 생장 촉진 효과를 가지고, 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 포함하는, 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 (수탁번호 KCTC 13064BP).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 2 내지 5의 식물 생장 촉진능을 가지는 식물 생장 호르몬 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 (수탁번호 KCTC 13064BP).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 6 내지 8의 인산 가용화능을 가지는 인산 가용화 효소 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 (수탁번호 KCTC 13064BP).
  5. 삭제
  6. 제1항의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물 생장 촉진용 및 Phythium ultimum 진균에 대한 항진균용 미생물 제제.
  7. 제6항의 미생물 제제를 포함하는, 식물 생장 촉진용 및 Phythium ultimum 진균에 대한 항진균용 미생물 비료.
  8. 제6항의 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, Phythium ultimum 진균에 대한 항진균 효과 및 식물 생장을 촉진하는 방법.
KR1020160121598A 2016-09-22 2016-09-22 작물 생육 촉진 또는 항진균 활성을 가지는 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 및 이의 이용 KR101899650B1 (ko)

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