KR101759826B1 - 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 메가터리움 knu-01 균주 및 이의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주를 제공한다. 본 발명에 따른 식물 생장 촉진용 미생물 제제로 활용 가능한 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주는 식물 생장 촉진 및 인산, 우레아 가용화, 질소 고정 능 등을 가지고 있으므로, 친환경 농법에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 메가터리움 KNU-01 균주 및 이의 이용 {Bacillus megaterium KNU-01 strain having plant growth promoting effect, and uses thereof}
본 발명은 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 메가터리움 KNU-01 균주, 이의 배양물, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 식물생장 촉진용 미생물 제제 조성물에 관한 것이다.
최근 유기질, 화학비료의 과다사용에 의해 토양의 오염, 연작장해, 토양양분의 불균형, 병해충 발생 등의 많은 문제가 발생되어, 생산물의 품질저하, 농가의 소득 저하 등의 부작용이 나타나고 있다. 중요한 식물 영양분인 질소(N)는 이러한 화학 비료의 사용에 의해 공급되어 왔으나, 더 높은 수확량을 유지하기 위한 화학 비료의 과잉 이용은 낮은 투입으로 높은 생산성을 요하는 지속 가능한 농업의 원리에 반하는 문제점이 있고, 또한 환경적인 문제를 초래하고 있다.
이와 같은 문제를 해소하기 위하여 화학비료를 대체할 수 있는 수단으로, 농업환경 및 생태계 부담을 최소화하면서 안전한 먹거리를 해결하는 생물학적 방법이 활발히 연구되고 있으며, 그 대체방안으로 작물생육을 촉진할 수 있는 미생물 비료에 대한 관심과 그 필요성이 한층 더 고조되고 있다.
이러한 미생물 비료는 염류 집적 등 토양오염의 환경 문제를 일으키지 않는다는 장점이 있으며, 생태계 안전성 유지에 탁월하며 작물생산성을 지속적으로 향상시키는 이점이 있고, 친환경의 지속가능한 농업에 대한 관심이 증가함에 따라, 농업 유용 미생물에 대한 연구가 꾸준히 이루어지고 있다.
현재 상용화되어 있는 농업 유용 미생물은 식물 병원성 미생물에 대한 길항효과, 토양 내 무기 영양분의 가용화, 다양한 식물 생장 촉진 등의 효과를 가지고 있는 미생물 제제가 있으며 현재 사용 가능한 화학 농약 및 비료의 숫자도 줄어들고 있는 실정이므로 이를 대체할 수 있는 미생물 제제 또한 필요한 실정이다. 이와 관련하여 국내 공개특허 제2015-0105546호에서는 식물생장을 촉진하는 엔테로박터 루드위지아이 SJR3 균주를 제시한 바 있다.
본 발명자들은 화학비료를 대체할 수 있는 친환경 식물 생장 촉진용 미생물 제제를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 바실러스 메가터리움 KNU-01 균주에 식물 생장 촉진 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 식물의 생장 촉진 효과를 가지는 바실러스 메가터리움(Bacillus megaterium) KNU-01 균주(KCTC 12973BP) 및 이를 이용한 미생물 제제를 제공하는 데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 생장 촉진 효과를 가지는 바실러스 메가터리움(Bacillus megaterium) KNU-01 균주(수탁번호 KCTC 12973BP)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 2 내지 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물 생장 호르몬 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 6의 인산 가용화 효소 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 7 내지 13으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 우레아 가용화 효소 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 14 내지 17로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질소 고정 효소 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 메가터리움(Bacillus megaterium) KNU-01 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물 생장 촉진용 미생물 제제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는, 식물 생장 촉진용 미생물 비료를 제공한다.
아울러 본 발명은 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물 생장 촉진 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주는 식물 생장 촉진 능을 가져, 친환경 농법 미생물 제제로서 사용이 가능하며, 식물생장 촉진, 인산 가용화, 우레아 가용화 관련 유전자 서열을 밝혀 이를 이용하여 다양한 조건에서 효과적으로 사용 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 오옥신 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주가 생성하는 인산 가용화 효소 (phosphatase) 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주가 생성하는 우레아 가용화 효소 (urease) 활성을 나타낸 도이다.
도 4은 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주가 생성하는 질소 고정 능력 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주가 가지는 종자 발아 촉진 능력을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 바실러스 메가터리움(Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 형태적 특성은 그람염색법을 이용하여 나타내었고 상기 균주의 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 16S rRNA를 암호화하고 있는 유전자(rDNA)의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 16S rRNA를 암호화하고 있는 유전자(rDNA)의 염기서열(bp)을 공지 균주와 비교하여 계통발생학적 모식도로 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주 식물 생장 촉진 능과 관련된 식물 호르몬 역할을 나타내는 Tryptophan synthase alpha chain (EC 4.2.1.20; 서열번호 2), Anthranilate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.18; 서열번호 3), Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20; 서열번호 4), Phosphoribosylanthranilate isomerase (EC 5.3.1.24; 서열번호 5) 의 유전자 염기 서열이다.
도 10은 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주가 생성하는 인산 가용화 효소를 나타내는 Alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1; 서열번호 6) 의 유전자 염기 서열이다.
도 11은 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주가 생성하는 우레아 가용화 효소를 나타내는 Urease alpha subunit (EC 3.5.1.5; 서열번호 7), Urease beta subunit (EC 3.5.1.5; 서열번호 8), Urease gamma subunit (EC 3.5.1.5; 서열번호 9), Urease accessory protein UreD(서열번호 10), Urease accessory protein UreFD(서열번호 11), Urease accessory protein UreGD(서열번호 12), 및 Urease accessory protein UreED(서열번호 13) 의 유전자 염기 서열이다.
도 12는 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주 질소 고정 능과 관련된 효소의 유전자 서열을 나타내는 Nitrate/nitrite sensor protein (EC 2.7.3.-; 서열번호 14), Assimilatory nitrate reductase large subunit (EC1.7.99.4; 서열번호 15) Nitrite reductase large subunit (EC 1.7.1.4; 서열번호 16), Nitrite reductase small subunit (EC 1.7.1.4; 서열번호 17) 의 유전자 염기 서열이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 식물 생장 촉진 효과를 가지는 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주를 제공한다.
상기 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 서열은 서열번호 1로 표시되는 것이다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 공시 균주인 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) NBRC 15308T 와 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
이에 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주로 명명하고, 2016년 02월 03일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12973BP를 부여 받았다.
본 발명의 상기 균주는 토양시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 질산을 환원시키고, 혐기 조건하에서 포도당을 에너지원으로 사용하며, D-만노오스, D-포도당, 글리세롤, D-만니톨, N-아세틸-글루코사민, D-말토오스, D-리보오스 등의 탄소원을 에너지원으로 사용함을 확인하였다.
상기 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주는 식물의 생장호르몬을 생산하는 능력, 인산을 가용화하는 능력, 우레아를 가용화하는 능력 및 질소를 고정하는 능력을 가진다.
상기 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주는 벼 종자 중 하나인 waito-C 종자의 발아를 촉진하는 능력을 가진다.
본 발명에서 생장 촉진의 대상이 되는 식물로는 밀, 보리 벼와 같은 벼과 작물에 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
식물은 생장과 발달을 조절하여 여러 환경 변화에 대처 및 적응하는 시스템을 가지고 있다. 특히 식물의 발달 조절은 주로 외부 환경과 식물의 내재적 발달 프로그램과의 상호 작용을 통해 일어나는 것으로 , 주로 식물 호르몬들이 그러한 상호작용에 필수적인 기능을 수행하는 것으로 알려져 있으며, 특히 오옥신(Auxin, IAA)은 식물이 씨에서 발아하여 생장하거나, 줄기의 신장에 관여하는 것으로 알려져 있다.
이에 대하여, 상기 식물 생장 촉진 능을 확인하기 위해서, 균주가 생성하는 식물 생장 촉진 호르몬 오옥신(Auxin, IAA) 생성량 측정 시험을 통해서 확인하였다(도 1).
또한 식물 생장에 필요한 영양원 중의 하나로서 인(P) 성분이 있는데, 토양 중에 존재하는 인산은 산성토양에서는 철 및 알루미늄 이온과, 알칼리성 토양에서는 칼슘이온과 쉽게 결합하여 불용화되어 있어 토양 중에서 식물이 이용할 수 없는 불용성 인산의 양만 증가되어 있다. 실제로 인산은 토양 중 약 0.05%(w/w)를 차지하고 있으나, 식물 또는 미생물이 이용할 수 있는 인산양은 그 중에서도 0.01%에 불과하다. 또한, 난용성 인산염을 식물이나 미생물이 이용하기 쉬운 H2PO4-나 HPO4 2 -의 이온형태로 전환시켜주는 과정을 ‘가용화'라고 한다.
이에 본 발명자들은 상기 균주의 인산 가용화능을 확인하기 위해서 균주가 생성하는 인산 가용화 효소 (phosphatase)의 활성 측정 시험을 수행하여, 상기 균주에 인산 가용화 능이 있다는 것을 확인하였다(도 2).
또한 상기 우레아 가용화 능은 균주가 생성하는 우레아 가용화 효소 (urease)의 활성 측정 시험에서 확인되었고(도 3), 상기 질소 고정 능은 균주가 생성하는 질소 고정 능력 측정 시험에서 확인되었으며(도 4), 상기 균주의 형태학적 특성은 그람 염색법을 통해 확인되었고 (도 6), 생화학적 특성은 Api kit 20 측정 시험에서 확인되었다(표 1). 특히 식물 생장 촉진제로써의 가능성을 확인하기 위한 실증실험의 일환으로 벼 종자의 일종인 waito-C 종자를 이용한 발아 촉진 실험 (seed germination test)를 실시하였고 종자 발아 촉진 능력이 있는 것으로 확인되었다(도 5).
따라서 본 발명의 균주에는 식물 생장을 촉진할 수 있는 효과가 있다는 것을 확인하였고, 이에 따라, 상기 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자 (rDNA)를 확인하였다. 상기 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자 (rDNA)는 16S rRNA gene sequencing에서 확인되었다(서열번호 1, 도 7).
상기 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자 (rDNA)를 이용한 계통분류학적 모식도를 확인하여 도 8에 나타내었다. 상기 균주의 계통분류학적 모식도는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0 version에서 확인된 것이다.
또한 본 발명에서 상기 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 whole genome을 이용한 식물 생장 촉진 관련 유전자를 확인한 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 균주가 가지는 유전자들은 Ion torrent PGM genome sequencing에서 확인되었다.
상기 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 whole genome을 이용한 인산 가용화 관련 유전자를 확인한 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 균주가 가지는 유전자들은 Ion torrent PGM genome sequencing에서 확인되었다.
상기 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 whole genome을 이용한 우레아 가용화 관련 유전자를 확인한 결과를 도 11에 나타내었다. 상기 균주가 가지는 유전자 들은 Ion torrent PGM genome sequencing에서 확인되었다.
상기 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 whole genome을 이용한 질소 고정 관련 유전자를 확인한 결과를 도 12에 나타내었다. 상기 균주가 가지는 유전자 들은 Ion torrent PGM genome sequencing에서 확인되었다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 식물 생장 촉진 호르몬인 오옥신의 생성량을 측정하였고 인산 가용화 능, 우레아 가용화 능, 질소 고정 능의 활성을 확인하였으며 식물 생장 호르몬 역할을 나타내는 Tryptophan synthase alpha chain (EC 4.2.1.20, 서열번호 2), Anthranilate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.18, 서열번호 3), Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20, 서열번호 4), Phosphoribosylanthranilate isomerase (EC 5.3.1.24, 서열번호 5)의 유전자 염기 서열, 인산 가용화 효소 역할을 하는 Alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1, 서열번호 6)의 유전자 염기 서열, 우레아 가용화 효소 역할을 하는 Urease alpha subunit (EC 3.5.1.5, 서열번호 7), Urease beta subunit (EC 3.5.1.5, 서열번호 8), Urease gamma subunit (EC 3.5.1.5, 서열번호 9), Urease accessory protein UreD(서열번호 10), Urease accessory protein UreFD(서열번호 11), Urease accessory protein UreGD(서열번호 12), 및 Urease accessory protein UreED(서열번호 13)의 유전자 염기 서열, 질소 고정 역할을 하는 Nitrate/nitrite sensor protein (EC 2.7.3.-, 서열번호 14), Assimilatory nitrate reductase large subunit (EC:1.7.99.4, 서열번호 15) Nitrite reductase large subunit (EC 1.7.1.4, 서열번호 16), Nitrite reductase small subunit (EC 1.7.1.4, 서열번호 17)의 유전자 염기 서열이 밝혀졌다.
따라서 본 발명은 바실러스 메가터리움(Bacillus megaterium) KNU-01 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물 생장 촉진용 미생물 제제/비료를 제공할 수 있는 것이고, 상기 미생물 제제/비료를 처리함으로서, 식물 생장을 촉진하는 방법을 제공할 수 있는 것이다.
본 발명에서 상기 배양물은 균주를 배양한 보통 한천배지(또는 영양 한천배지; Nutrient agar)배지, 또는 TSA(tryptic soy agar) 배지로부터 분리하여 얻은 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물 제제 조성물은 통상적인 방법으로 식물 생장 촉진용으로 제형화할 수 있으며 건조분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제 조성물은 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 바람직하게는 화학비료를 대체하기 위한 식물 생장 촉진 생물비료로 제형화 할 수 있고, 즉 화학 비료 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물비료로 제형화가 가능하다.
본 발명에서 상기 미생물 제제는, 균주 또는 이의 배양물에 첨가제, 증량제, 영양제등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 첨가제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있고, 증량제 및 영양제로는 skim milk(배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트(bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양, 식물 또는 식물 종자에 처리함으로써 식물 종자의 발아를 촉진하는 방법을 제공한다. 이때, 처리방법에는 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있다. 그 사용량은, 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
본 발명에서, 상기 방법에 따라 처리되는 제제에 함유된 미생물의 유효량은 경작지 면적(㎡) 당 1 내지 1×10100의 미생물 수로 포함될 수 있다. 또한, 상기 방법 중 살포에 의해 처리되는 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10100의 미생물 농도로 포함될 수 있으며, 침지에 의해 처리되는 조성물에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10100의 미생물 농도로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1. 바실러스 메가터리움 ( Bacillus megaterium ) KNU-01 균주의 분리 및 동정]
토양으로부터 바실러스 메가터리움 ( Bacillus megaterium ) KNU-01 균주의 분리
식물 생장 촉진제로써 활용 가능한 미생물을 분리하기 위해 경상북도 경주시 인왕동 유채꽃밭에서 토양시료를 수집하였다. 토양으로부터의 미생물 분리는 토양 시료 1 g을 0.85% NaCl solution 9 mL에 넣어 충분히 교반 하고 9 mL의새 0.85% NaCl solution을 이용하여 단계별 희석을 실시하였다. 희석을 한 각 시료 구간에서 100 μL를 덜어 낸 다음 nutrient agar에 도말 하였다. 단일 콜로니로 자란 미생물들은 콜로니 외형을 이용한 형태학적 분류방법을 이용하여 분리를 하였고 분리한 미생물을 이용하여 식물 생장 촉진제로써의 활성을 평가하여 최종 분리 균주를 선정하였다. 최종 분리된 균주는 16S rRNA gene 영역을 증폭하여 염기서열을 분석하여 동정하였다.
식물 생장 촉진호르몬 생성량 측정
오옥신 생성을 확인하기 위해 분리균주를 3 mg/mL의 L-Tryptophan이 포함된 5 mL의 nutrient broth 배지에 접종한 다음 동일 배양조건에서 16시간 배양하였다. 이 중 1 mL을 회수하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 하고 상등액을 0.20 μm membrane filter로 여과하여 배양 상등액을 준비하였다. 배양 상등액 500 μL를 test tube에 옮기고 1 mL의 salkowski regent와 혼합한 후 30분간 암조건에서 반응시켰다. 반응 후 535 nm에서 흡광도를 측정하였고 오옥신의 정량은 IAA 표준품 (Sigma Aldrich, Germany)을 이용하여 제조한 검량곡선에 대입하여 계산되었다. 최종 분리 균주인 KNU-01 균주는 식물 생장 촉진 호르몬인 오옥신을 생성하는 것으로 확인되었고 이의 결과는 도 1에 나타내었다.
인산 가용화, 우레아 가용화, 질소 고정 활성 측정
인산 가용화 효소 활성 확인을 위해 분리균주를 5 mL의 nutrient broth 배지에 접종한 다음 동일 배양조건에서 24시간 배양하였다. 분리균주의 액체 배양액을 이용하여 nutrient agar에 획선 도말을 하고 동일 조건에서 24시간 배양했다. 배양한 분리균주는 phosphatase 활성을 측정할 수 있는 phosphate agar (Glucose 10 g, (NH4)2SO4 0.5 g, Yeast extract 0.5 g, MgSO47H2O 0.1 g, Ca3(PO4)2 5 g, MnSO4 0.0001 g, FeSO4 0.0001 g, Agar15 g)에 toothpick을 이용하여 접종하고 동일 조건에서 24시간 배양해주었다.
활성 확인은 배지 조성 내 calcium phosphate가 분해되면 불투명했던 배지가 투명하게 변하게 되는데 균주 주위에 투명 환을 형성하는 미생물을 인산 가용화 효소 활성이 있는 균주로 선정하였다. 최종 분리 균주인 KNU-01 균주는 인산 가용화 효소 활성이 있는 것으로 확인되었고 이에 대한 결과는 도 2에 나타내었다.
우레아 가용화 효소 활성 확인을 위해 분리균주를 5 mL의 nutrient broth 배지에 접종한 다음 동일 배양조건에서 24시간 배양했다. 분리균주의 액체 배양액을 이용하여 nutrient agar에 획선 도말을 하고 동일 조건에서 24시간 배양하였다. 배양한 분리균주는 urease 활성을 측정할 수 있는 urea agar (Peptone 1 g, Dextrose 1 g, NaCl 5 g, KH2PO4 2 g, Urea 20 g, Phenol-red 0.012 g, Agar 15 g)에 toothpick을 이용하여 접종하고 동일 조건에서 24시간 배양했다. 활성 확인은 배지 조성 내 urea가 분해되어 나오는 암모니아에 의해 pH 변화가 일어나게 되면 노란색이었던 phenol red의 색깔이 분홍색으로 변하게 되는데 균주 주위에 분홍색 환을 형성하는 미생물을 우레아 가용화 효소 활성이 있는 균주로 선정하였다. 최종 분리 균주인 KNU-01 균주는 우레아 가용화 효소 활성이 있는 것으로 확인되었고 이에 대한 결과는 도 3에 나타내었다.
질소 고정 능 확인을 위해 분리균주를 nutrient agar 배지에 획선도말하고 동일한 배양조건에서 배양하여 단일 콜로니를 획득했다. 분리한 단일 콜로니를 nitrogen fixation agar (Sucrose 6 g, MgSO47H2O 0.2 g, Na2HPO4 13.9 g, KH2PO4 1.7 g, NaCl 2 g, FeCl36H2O 8 mg, Na2MoO42H2O 3 mg, Thiamin 1 mg, Agar 15 g)에 멸균된 이쑤시개를 이용하거나 획선도말을 실시하고 생육 여부를 기준으로 하여 질소 고정 능을 확인하였다. 최종 분리 균주인 KNU-01 균주는 질소 고정 능력이 있는 것으로 확인되었고 이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다.
KNU -01의 종자 발아율 확인
식물 생장 촉진제로의 가능성을 확인하기 위해 waito-C 벼 종자를 이용한 종자 발아 실험 (seed germination test)를 실시하였다. 종자 발아 실험을 위해 1 반복 당 11개의 waito-C 종자를 사용하였다. 종자의 표면 소독은 70% 에탄올에서 5분간 shacking한 다음 종자소독액(4% 유한클로락스 : 멸균수 : 0.05% Triton X-100 = 3 : 2 : 2 : ) 1분간 shacking하고 멸균수로 4번 세척을 실시하였다. 표면 소독이 완료된 종자는 4℃에서 2일간 보관함으로써 춘화처리를 실시하였다. 종자 발아 효과를 확인하기 위한 KNU-01 균주 배양에는 최적 배지인 LB 배지와 식물 생장 촉진 호르몬인 오옥신의 전구체 물질인 tryptophan을 첨가한 LB 배지를 사용하였고 최적 조건에서 배양하였다. 다음으로 춘화 처리가 끝난 waito-C 종자에 30분간 shacking 해 줌으로써 waito-C 종자에 균주 코팅을 실시해 주었다. 대조군으로는 균주 대신 멸균수를 코팅에 사용하였다. 발아 실험을 위해 watman paper를 petri dish크기대로 자른 다음 petri dish에 넣고 2 mL의 멸균수를 paper disc에 뿌려주었다. 종자 발아는 멸균수를 뿌린 paper disc에서 진행되었으며 코팅 처리 된 종자를 올린 다음 은박지로 밀봉하여 빛을 차단시켰고 30℃에서 2일간 배양하면서 매일 종자 발아를 관찰하였다. 실험은 3반복으로 진행되었으며 그 결과 총 33개의 종자 중 증류수를 코팅 처리한 대조군은 23개의 종자가, LB배지에서 배양된 KNU-01을 코팅 처리한 군에서는 27개의 종자가, tryptophan이 첨가된 LB배지에서 배양된 KNU-01을 코팅 처리한 군에서는 30개의 종자가 발아된 것을 확인하여 KNU-01은 종자 발아 촉진 능력이 있는 것으로 확인 되었고 이 결과를 토대로 나타낸 발아율은 도 5에 나타내었다.
분리 균주의 동정
식물 생장 촉진, 인산 가용화, 우레아 가용화, 질소 고정 활성이 우수한 균주의 동정을 위하여 회수한 균체로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후(Thompson, 1980), 분리한 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의하여 16S rRNA gene을 증폭하였다. 이 때 사용한 다용도 프라이머(universal primer)는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 각각 사용하였다(Lane 1991). 증폭한 PCR 산물은 PCR 정제 시스템(Solgent, Daejeon, Korea)을 이용하여 정제하였다. 정제한 PCR 산물의 전체 염기서열을 분석하기 위한 염기서열분석(sequencing)은 솔젠트(Solgent, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 실시하였다.
분석한 염기서열 결과는 NCBI의 BLASTN을 이용하여 비교하였으며, 염기서열의 상동성 및 계통발생학적 모식도(phylogenetic tree)는 Bioedit와 Mega6 프로그램을 통해 인접결합방법(neighbor-joining methods)을 사용하여 분석하였다. 이의 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.
분리한 균주는 기존에 보고된 공시 균주인 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) NBRC 15308T와 99%의 상동성을 가지는 것으로 확인하였다. 상기 균주는 기존의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) NBRC 15308T와 1% 상이하기 때문에, 메가터리움 종에 속하는 신규한 균주로 인정받아, 이를 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01으로 명명하고, 상기 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12973BP). 또한 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 염기서열을 확인하였다.
[실시예 2. 바실러스 메가터리움 ( Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 형태적 및 생화학적 특성]
2-1. 형태적 특성
바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 형태적 특성을 확인하기 위하여 그람 염색법을 실시하였다. 영양 배지인 nutrient agar에서 획선 도말법을 이용하여 KNU-01 균주를 배양한 다음 단일 콜로니를 회수한다. 회수한 단일 콜로니는 0.85% NaCl solution에 현탁한 다음 slide glass에 올리고 알코올램프를 이용하여 열 고정을 실시하고 crystal violet 염색, iodine 염색, ethanol 탈색, safranin 염색 순으로 염색을 실시하고 마지막으로 증류수로 염색약을 씻어낸 다음 광학현미경으로 KNU-01 균주의 형태적 외형을 확인한다. 결과 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주는 그람 양성균 인 것으로 확인 되었고 이의 결과를 도 6에 나타내었다.
2-2. 당 대사 특성 확인
바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 당 대사 능은 API 20 NE 키트(Bio Merioux사)를 이용하여 공급회사의 실험방법에 따라 실험하였으며, 30℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후 비교하였다. API 20 NE 키트의 색깔 변화 및 균주 생육에 따른 혼탁도를 이용하여 결과를 작성하였고 이의 결과를 표 1에 나타내었다.
유효성분 결과 유효성분 결과
D-만노오스 + D-만니톨 +
D-아라비노스 - N-아세틸-글루코사민 +
D-포도당(발효) + D-셀로비오스 -
D-자일로스 - D-말토오스 +
메틸-aD-글루코피라노사이드 - 메틸-aD-만노피라노사이드 -
글리세롤 + D- +
상기 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주는 D-만노오스, D-포도당, 글리세롤, D-만니톨, N-아세틸-글루코사민, D-말토오스, D-리보오스를 에너지원으로 사용함을 확인하였다.
[ 실시예 3. 바실러스 메가터리움 ( Bacillus megaterium ) KNU -01 균주의 식물 생장 촉진 관련 유전자 서열 정보]
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 식물 생장 촉진제로써 활용 가능한 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주가 가지는 식물 생장 촉진, 인산 가용화, 우레아 가용화, 질소 고정과 관련된 유전자 서열을 밝히기 위하여 균체로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후 Iontorrent PGM sequencing 장비를 이용하여 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주의 전체 유전자 서열을 밝혔다.
식물 생장 촉진 능과 관련된 효소의 유전자 서열을 나타내는 Tryptophan synthase alpha chain (EC 4.2.1.20), Anthranilate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.18), Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20), Phosphoribosylanthranilate isomerase (EC 5.3.1.24) 의 유전자 염기 서열을 도 9에 나타내었다.
또한 인산 가용화 효소를 나타내는 Alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1) 의 유전자 염기 서열을 도 10에 나타내었다.
또한 우레아 가용화 효소를 나타내는 Urease alpha subunit (EC 3.5.1.5), Urease beta subunit (EC 3.5.1.5), Urease gamma subunit (EC 3.5.1.5), Urease accessory protein UreD, Urease accessory protein UreF, Urease accessory protein UreG, 및 Urease accessory protein UreE 의 유전자 염기 서열은 도 11에 나타내었다.
질소 고정 능과 관련된 효소의 유전자 서열을 나타내는 Nitrate/nitrite sensor protein (EC 2.7.3.-), Assimilatory nitrate reductase large subunit (EC 1.7.99.4) Nitrite reductase large subunit (EC 1.7.1.4), Nitrite reductase small subunit (EC 1.7.1.4) 의 유전자 염기 서열은 도 12에 나타내었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
한국생명공학연구원 KCTC12973BP 20160203
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Bacillus megaterium KNU-01 strain having plant growth promoting effect, and uses thereof <130> MP15-205 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1355 <212> DNA <213> Bacillus megaterium KNU-01 16S rRNA <400> 1 aagcttgctt ctatgacgtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggca acctgcctgt 60 aagactggga taacttcggg aaaccgaagc taataccgga taggatcttc tccttcatgg 120 gagatgattg aaagatggtt tcggctatca cttacagatg ggcccgcggt gcattagcta 180 gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg 240 ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 300 gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta 360 aaactctgtt gttagggaag aacaagtacg agagtaactg ctcgtacctt gacggtacct 420 aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 480 ttatccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag 540 cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagagaaaa 600 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aaggcggctt tgtcgaagat 780 acgattgcag cgattggcga tcgagtcatt catacctatc atactgaagg agctggaggc 840 ggacatgcac ctgatattat ggaaatggca agctttccaa acgtgcttcc atcatcaact 900 aatccaacaa gaccctatac tgtcaacacg cttgaagaac atttagatat gctcatggta 960 tgtcaccatc ttgatccctc tgtaccagaa gacatcgctt ttgctgattc tcgcattcgc 1020 aaagaaacga ttgcagctga agatatttta cacgatttag gtgtattcag tatgatttct 1080 tcagattccc aagcaatggg acgtgtagga gaagtgatta caagaacgtg gcaaacagct 1140 gacaaaatga aaaagcagcg agggaaactt gatggtgaca gcgaagctgg cgataacgca 1200 cgtgtcaaac gctatgtagc taaatatacg attaatccag ctattgctca tggaatttcc 1260 gaatacgtag gatcagtaga aacagggaaa atggctgact tagtcctatg ggagccagcg 1320 ttttttggaa taaagcctga cttgattgta aaaggcggtt tgattgcaca cagcttaatg 1380 ggagatccta acgcttcaat cccaactcca cagccggttt tataccgtcc gatgtttgct 1440 tcttatggaa aagcaagagc taaaacgtct tttacgtttg tgtcaagagc agcgtacgag 1500 aacaaagtgg gcgagaaact ggggttgcaa aagctgctta aaccggtcaa aaatattcgt 1560 caattaaaaa aaaacagata tgaagttaaa cggggaaatg cctaa 1605 <210> 8 <211> 195 <212> DNA <213> Urease beta subunit <400> 8 gtgaatgctg cgctcgaatt cccccgcgaa gcttcgcttg gctatcattt aaatattccg 60 gccggtacag ccgttcgttt tgaaccaggt gatgcaaaag aagtcgatct cgttgctttc 120 tccggaacaa gagaaatcta cggtcttaac aataaaacaa acggatcgct ttctgataga 180 aaggaagatg tataa 195 <210> 9 <211> 303 <212> DNA <213> Urease gamma subunit <400> 9 ttgaaactta cgtcgagaga acaagaaaaa ttaatgattg tcgtagctgc agacttagca 60 agacgccgtc aaacaagagg attaaaactt aattatcccg aagcagtagc tattattaca 120 tatgaaatta tggaaggagc tcgtgatggc aagacggtag cacagctaat gcgagaaggg 180 accaagattt taaaacgaga agatgtaatg gaaggtattc cggaaatgat tcatgatatt 240 caagtggaag ctacctttcc agatggaacc aagctcgtca ctgtgcacga tccaattcgt 300 taa 303 <210> 10 <211> 810 <212> DNA <213> Urease accessory protein UreD <400> 10 atgagctaca cgggttattt agagcttcga gcagaaagaa acagtgagcg aaccgttatt 60 aaagatacgt accattacgg ggctttcaaa gttgccagac ctatttacat gactcctgaa 120 tccccttttg tctatatgct tcacgtaggc ggaggatacg taagcggaga caagtataaa 180 acgatgataa cggtagagaa aaatgcccag ctgacggcta ctactcaatc tgcgacaaag 240 gtgtacaaaa caccgaacga agctgtttta caagaaacgt gtataactct tgaagaacaa 300 gccatcatgg aatatatacc agacccgctt attttgtatg aaaatgctgc atttgttcaa 360 gaaataacgg tttatatggc acaaaacgct gctttgttta tgtgtgacag cataactccg 420 gggtggtcgc cggatgggca gctgtttcaa tatacctcta tgcgttccaa gcttaaactg 480 tatgtaaacg agcagctgaa ggtatacgat cacttatact tgaagccaga aagccatttg 540 cgcggcatga tgaaaatgga agggtatact cattttggat cgattatcat tgttcatcca 600 aacgccgacg atgcatttat agcgaaagta catcagctgt gcgaagaggc aggctgtaaa 660 gtaggagctt ccgcacttcc gatccccgga tgtgctattc gaatattagc tgctagtaca 720 caagaagttg aagacataat cgctaaagta tacggattct tccgacagca tttactaaaa 780 gctgaagtat cacttttgcg taagtattaa 810 <210> 11 <211> 687 <212> DNA <213> Urease accessory protein UreF <400> 11 atgactaatt cattgctttc gctgattcaa ctatgtgatt caaattttcc atccggtgca 60 ttttcacatt cgtttggctt tgaaacgtat attcagcgaa accaaattta caacacagaa 120 acctttcaag aagcgcttcg tacatacctt gatgttcagc tgacgtatac ggacggctta 180 gcatgcagac tggcttatga gtatgcggct catgaccagt ttaacgaaat tatgagagtg 240 gatcatgaat tatacgctct tgctttgtca aaagaaacaa gagaagggac aagacgcgtg 300 ggccagcgca tgttaaaact ttgcttagag ttatttcaag gctcttattt agaaaagtat 360 atgagtgagg taaaagcaaa gaaggcgtat ggacatcctg ctgttgtatt tgcgttagcc 420 agcctgcagt taaatatcac aaaagaagac gcaattttaa gtcacttgta cgctagcatt 480 tcttcgttaa tccaaaatgc tgttcgcggc ataccgatcg gtcaaacgga tggacaaaaa 540 acgctcgttc tttttcagcc gctgctgcag cacgcacttc agcatatttt acaagcagat 600 caagaggaat ttggtgccgt gacaccaggg ttagaaatcg ctcaaatgca gcatgaacaa 660 ttgcatgtcc gattgttcat gtcataa 687 <210> 12 <211> 615 <212> DNA <213> Urease accessory protein UreG <400> 12 atgaatgcaa ttaaaattgg aattggtgga cctgttggtg cagggaaaac aatgttagta 60 gaacgattaa cgcgtgcatt agaaggacag ctaagcatgg cggtcgttac aaacgatatt 120 tacacaaaag aagacgcgca atttctagta aaaaacagta ttttaccgga aaatcgcatc 180 gtaggagtag aaacaggagg atgtcctcat acggccattc gagaagatgc atctatgaac 240 tttgctgcga tcgatgagtt agtggaacgt cacccggatg ttgaacttat ttttgtagaa 300 agcggaggag ataatttagc cgcaacgttt agcccagagc tcgttgattt ttcgatttat 360 atcatcgacg tagcacaagg ggaaaaaatc ccgcgtaaag gcggtcaagg aatgattaaa 420 tctgatttat tcattatcaa caaaacagat ttagccccgt atgtaggagc cagtttagaa 480 gtaatggaaa aagatacaat ccaagcgaga gggcacaagc cttttgtttt caccaattta 540 aaagaagata aagggctcga ccaagtgata gaatggatta aaaaagaggc ctttttaatc 600 ggccttgaat catga 615 <210> 13 <211> 447 <212> DNA <213> Urease accessory protein UreE <400> 13 atggtaatcg aaaaaattat cggaaatatg gcaacattag aaaaaagggc tccacatata 60 gaaaaggtat atatcgaaag tgatcactta gtaaaacgag ttcagcgcgt tgtaacagat 120 cacggtaagg aactaggaat tcgtctaaaa gaaaatcgcg agctcactga tggcgacgtg 180 ctgtttatgg atgaaagcaa tatgattgtt gtgcaggtgc tggcagacga tattttgacg 240 attcagccga ttgatattca gcaaatggga gaaattgctc atcagcttgg caaccgccat 300 ttgccggcac agtttgaagg tggagacatg ctcgtacagt acgattattt agtcgaagaa 360 ttgctccggc agcttgatat tccctataag cgcgaaaaaa gaaaagtaaa acaagctttt 420 aagcatatcg gacacagtca tgactaa 447 <210> 14 <211> 1203 <212> DNA <213> Nitrite reductase large subunit <400> 14 atgacaaaac aaaagctggt attaatcgga aatggaatgg caggaatgcg ctgtattgaa 60 gaaattctta ttcattctcc agattgtttt gatattactg tttttggaag tgagcctcac 120 gttaactata atcgaatttt attatcaacc gttttacaag gcagtacaaa gcttgaagat 180 atcaatattc attctttggc atggtataag gaaaataata tcactttatt taaaggagaa 240 agcgttacgc acatagacac caagagaaaa ataataaaaa cagataaaaa cagagggacg 300 aggtacgaca agcttattat tgctactggt tcgagctcgt atatgctccc cgttaaaggg 360 tctgacaaag aaggtgtcct cggttttcgt accatcgaag actgtcagga aatgattgaa 420 atttctaaac agtataaaaa agcagcggtt attggagggg gtctgttagg gctggaagct 480 gctaggggac tattgaattt gggaatggat gttcaagtca ttcatcattc gggtttctta 540 atggagcgac agttagacag agcagcatct gctatgttaa gagaagaatt agaaaagcaa 600 ggcatgagtt ttctattaaa caaacatacg gatgagatta tagggggaaa tcgagcagaa 660 ggcgtccgat ttaacgatag cagcaaaatt gcagctgatt tagttgtaat ggctacagga 720 gtgaggccaa atgttaatct agctaaaaaa agcggaatag aaacaaatag agcaatcatc 780 gtaaacgatt atttagaaac gagcatcccg aatatctatg cagtaggtga atgcgctgaa 840 catcgaggga tgacatacgg ccttgttgct cctctttacg aacaaggaaa agtcttagcg 900 cgacatcttt gccaaataaa aaacgatggt tatcgcgggt ccgttctttc cactcaatta 960 aaaatatcag gaatagacgt ttactcagtc ggagagttca aggaaaatca aggtgcaaaa 1020 gccattacga tttcgaatat gttagatggt atatacaaaa aagtcgtttt tcgcgaaggg 1080 aaaatagtgg gagctgttct ttttggagat accagtgagg ctataaagct atcacaaatg 1140 attaatgaaa aaaaaggatt tgtcgcaagc ggaaaaagta caattatttc cttctcaaca 1200 tga 1203 <210> 15 <211> 327 <212> DNA <213> Nitrite reductase small subunit <400> 15 atggtgaata aaaacattac aaaagtatgc gtagggccga ttcatgattt tccggtaagc 60 ctaggtaaaa cagtgaaagt aaacggaaaa gaaattgcag tgtttaagct atcaagcgga 120 aaaatacggg caattgaaaa tcgctgtccg cataaaggcg gggtgctcag tgaaggaatc 180 gtgagcggcg actcggtgtt ctgtccgatg cacgactgga aaatttgctt gcatgacggc 240 aacgtgcaag agcctgacag cggatgtgta gacacgtacg aagcgtctgt tgaaggagat 300 ttactgtatc ttttaattga agaataa 327 <210> 16 <211> 2151 <212> DNA <213> Assimilatory nitrate reductase large subunit <400> 16 atgactgaga tgctattgaa atattttcgt gagcagcaaa agcaagttga aaccgagcgt 60 atctataata ctcagtgtcc ttactgcagc atgcagtgca aaatgcagtt agttgaacaa 120 acacatgtaa aaaggaaaac gtataaaaca attggaacag ataaccctac ctctcaagga 180 aggttatgta tcaaaggaat gaatgcgcat cagcatcctt tgcataaaga tcggattcaa 240 tatcctttat taaaagtaaa cggagagttt gtaaagattt cttggaaaga agctcttcac 300 tatattaaag aaaacgttac agagattcaa gagaagaatg gagcagatgc gctaggtgtt 360 tatggaagtg cctctattac aaatgaagaa gcttatttat tagggaaatt tgctcgagtt 420 gcgttaaaaa caaagtatat tgattacaat ggacgcttat gtatgtcggc tgctgcttct 480 gctgctagta aaacatttgg catggacaga ggatttacga atagcttgca agagattccg 540 tttactgaat gtattatgtt agctggaaca aatattgcgg aatgtcagcc aacaattatg 600 ccttattttg agaaagcaaa agaaaacgga gcttttatta ttgcaattga tccaagagaa 660 acagctacaa ctaaaatagc tgatttacac ttgaaactta agccggggag cgacgcggca 720 ttagccaatg gaatcttgaa ggttcttatc gaagaaaatt atctagatga acgatttcta 780 caagaacgtg tcaatggatt tgaagaagta attcaatatg tggcgtctct ggaatttaat 840 atcattgaag aaataacggg agtgccactt gaagagatgt accaagctgc ccgtatgttt 900 ggccaaagaa aaacgggaat gatttttacc gctagagggg tagagcagca aacagacgga 960 agtgctgcgg tgcaaaattt tttgaatatt ctactttctg ttgggaaaat tggtaaacct 1020 cgctgcggat atggggccat tactggtcaa ggaaatgggc aaggagcccg agagcatggt 1080 caaaaagcgg atcagcttcc aggctaccgt tcaatcgaaa accacgagca ccggatgtat 1140 atagcggatg tgtggaacat agaggagaaa gatcttccta gaaaaggtgt ttctgcatat 1200 gagatgattg aaaaaattca tgatggtgaa attaaagggt tgtttttgat gtgttcaaat 1260 ccagcagttt caaatccaaa cgctaatttt gttaagaagg cttttgaaaa gcttgaattt 1320 ctagtagtag cagatatgtt tgaatcagaa acggcaaaat tagcaaactt gatcttacca 1380 gcatcttcct acttggaaga tgaaggaacc atgacaaata tagaaggaag agttacatta 1440 cgcgaagcta gctttccatg ccatggcgaa atcaaacacg actgggaaat actatgtgaa 1500 attgctaaag ttttaggaaa agaggaacat ttttcatttg catcagctga agaaatattt 1560 aatgaactgc gaatagcaag taaaggaggg atcgccgatt actccggtat tacgtacgaa 1620 cgattacgag aggaaaaagg aattttatgg ccatgcagaa gcttaacaga taaaggaacc 1680 gagcgcctgt ttgagacgcg ttttgctcat agtgatggaa aagcgatgat ggtccctgtc 1740 tcgaatcaag ctattgttcc taaagcaaaa ataaccgaaa aatatcctct ctatttaaca 1800 acggggagag tgatgtcgca ctatttaacg ggtgtacaaa cgcgaaaaag tgcgtcttta 1860 tctgctagaa atttcgaatc ttttatggaa atccaccctt caacagcgaa aaaatatgaa 1920 atttcgaatc aagaattagt acaaattgaa tcttcatatg gaaggattgt ggtaagaagc 1980 aaattttcag agggcattcg gccagatacc gtatttgttc cttttcactg ggcggattct 2040 caaaatgtta ataaccttgt ctctgagaaa ttagatcctg cctgtaagat gccagggttt 2100 aaagtaagtg ctgtgaatat tagcccttct gtaaaaagaa gcagctatta a 2151 <210> 17 <211> 1119 <212> DNA <213> Nitrate/nitrite sensor protein <400> 17 atggaaaaag atcatatttc agagcttaag attttaaaag acattgccga gattttaaat 60 gaaggcacta atttacatac aatgcttcac gatgctcttt taaaactgct gcaaataaca 120 gatttacaaa caggatggat cttttttatt gacgaaaatg gaaaacatga gatgattgcc 180 gctcagcatt tgccgccggc tttattaaat aaaaccgctc agcctatgtg taacggaagc 240 tgctggtgtg ttgatcggta tatggatggc cggcttcaaa aagcgtctaa tattatggag 300 tgcaagagac ttgaagattc cgtcattcat gagtgggggg atacacacga cattacccat 360 cacgcaacgg ttcctttaca agcaggggat gagcgctttg gattattaaa tgtagctgcc 420 cctcataaaa ttcattttga acagcgagag cttgatttat taggatccgt cgctcttcaa 480 attggcacgg ctatcaagcg gattaagctg actcaatctc agcaggaggt aaagcttatt 540 gaagaaagaa acagactggc aaaagatctt cacgattctg ttaatcaact gttattttca 600 attaatgtca cagccaaagc cggaagcagc ttagcgaaag atgtgcagtt aaaagagact 660 ttttccttaa tccaagaaac cgctcagtat gctcaagtgg aaatgaaagc attaatttgg 720 cagcttcgtc ctcaagggtt agaaaacggc atcgtcagtg cgttaaaaag ctatggtcaa 780 atgctaggtc ttaacgtaac agaacaaatt aaaggtgtgt cggttttgcc tgctgtgatt 840 gaagagacac tgtggagagt cggccaagaa gcttttaata attgccgaaa gcatgcgggt 900 acagcagatg tacatttaaa cgtaaatata agcagagaac aagtgattat gaaagtccaa 960 gatagcggca atgggtttat gtatagtgct tcagcagaat tgccgacgct tggattaaaa 1020 accatgcaag agcgaataaa aagattaaat ggaaaactat ctgttacaag cagcatagga 1080 aacggaacgg ttgtggaagt atctattcct ctttcataa 1119

Claims (9)

  1. 벼의 생장 촉진 효과를 가지는 바실러스 메가터리움(Bacillus megaterium) KNU-01 균주(KCTC 12973BP)로, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 2 내지 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물 생장 호르몬 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 6의 인산 가용화 효소 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 균주.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 7 내지 13으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 우레아 가용화 효소 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 균주.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 14 내지 17로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질소 고정 효소 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 균주.
  7. 제1항의 바실러스 메가터리움 (Bacillus megaterium) KNU-01 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 벼의 생장 촉진용 미생물 제제.
  8. 제7항의 미생물 제제를 포함하는, 벼의 생장 촉진용 미생물 비료.
  9. 제7항의 미생물 제제를 토양, 벼, 또는 벼의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 벼의 생장 촉진 방법.
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