KR20190061210A - 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제 - Google Patents

질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제 Download PDF

Info

Publication number
KR20190061210A
KR20190061210A KR1020170159334A KR20170159334A KR20190061210A KR 20190061210 A KR20190061210 A KR 20190061210A KR 1020170159334 A KR1020170159334 A KR 1020170159334A KR 20170159334 A KR20170159334 A KR 20170159334A KR 20190061210 A KR20190061210 A KR 20190061210A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
nitrogen
bacillus siamensis
ability
reducing
Prior art date
Application number
KR1020170159334A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102051873B1 (ko
Inventor
신재호
박영준
정연균
조영재
박창언
최승대
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020170159334A priority Critical patent/KR102051873B1/ko
Publication of KR20190061210A publication Critical patent/KR20190061210A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102051873B1 publication Critical patent/KR102051873B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C12R1/07—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 질소 저감 활성을 가지는 바실러스 시아멘시스 (Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제에 관한 것으로, 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주는 아질산 산화능, 탈질화능, 및 질소 저감능을 가져, 질소 처리를 위한 수처리 공정에서 친환경 질소 저감 미생물 제제로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제 {Bacillus siamensis 1HC-NA strain having nitrogen removal activation, and microbial agent comprising the same for removing nitrogen}
본 발명은 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주(KCTC 13372BP), 이의 배양물, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 질소 저감용 미생물 제제에 관한 것이다.
수질의 오염은 자연적인 원인과 인위적인 원인이 있는 것으로 알려져 있고 특히 질소에 의한 수질 오염은 인위적인 원인이라 할 수 있다. 대부분의 질소는 생활 폐수, 농업 폐수 및 축산 폐수에서 유래 한다.
수중에서 질소(nitrogen)는 단백질, 아미노산, 요소(urea)와 같은 유기질소(organic nitrogen), 암모니아성 질소(ammonia nitrogen, NH4 ＋-N), 아질산성 질소(nitrite nitrogen, NO2 －-N) 및 질산성 질소(nitrate nitrogen, NO3 －-N)의 상태로 존재하며, 수중의 유기질소는 미생물의 작용에 의하여 암모니아성 질소로 분해되고 다시 아질산성 질소를 거쳐 질산성 질소로 산화하는데, 수중에 살고 있는 조류는 암모니아성 질소, 아질산성 질소와 질산성 질소 등 무기질소를 영양염류로 이용하여 증식하게 된다. 따라서, 수질 내 질소 함량이 높은 경우 하천에 유입되었을 때 조류의 증식으로 인해 부영양화 및 악취와 같은 환경 오염의 원인이 되고 폐수 내 총 질소 함량이 60 mg/L가 넘을 경우 질소 폐수로 간주하고 있다. 현재 폐수 처리 공정에서는 산화법과 같은 화학적 처리를 통하여 폐수 내 질소 함량을 저감 하는 것으로 알려져 있다. 산화법으로 처리를 할 경우 산 처리에 의해 pH가 감소하는 것은 물론, 사용되는 시약 역시 하천으로 흘러 들어가게 되는 문제가 발생하게 된다.
이에, 최근 수질 처리 공정 중 혐기조 내 혐기성 미생물을 활용하는 것과 같이 수질 내 질소 함량을 생물학적으로 저감하려는 시도가 곳곳에서 이뤄지고 있는 것으로 조사 된다(오염 해수 내 고효율의 질소 및 인 제거를 위한 친환경 미생물 슬러지 및 이를 이용한 오염 해수 처리 방법, 한국등록특허 제 1733130호).
생물학적 질소 저감은 질산화 미생물 및 탈질 미생물들이 암모니아성 질소(NH4 ＋-N)를 질산성 질소(NO3 －-N)로(질산화), 질산성 질소(NO3 －-N)를 질소 가스(N₂)로(탈질화) 전환시켜 단계적으로 질소를 제거하는 방법이다.
미생물 제제는 살아있는 미생물을 직접적으로 이용하는 것으로서, 소비되는 순간까지 그 생명력이 유지되어 살아있는 기능이 발휘되어야 한다. 미생물 제제는 현재 탈취제, 공기 정화제, 제초제, 토양병해방제, 토양개량제, 생육촉진제, 수질정화제 등 매우 다양한 분야에 사용되고 있다. 환경 개선 제제로 사용하기 위해 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 광합성 세균 등의 다양한 균주들이 개발중이며, 최근에는 균고정화 기술이 발달되면서 미생물 제제를 담체에 고정화시켜 판매하기도 한다.
현재 국내에서도 미생물 제제의 개발 기술이 많이 향상되고 있으나, 선진 외국에 비하면 아직까지도 개발 수준이 상당히 미미한 실정이며, 국내에서 소비되는 미생물 제제는 주로 외국에서 수입하여 사용하는 경향이 높다.
한편, Bacillus 속 미생물은 호기성, 또는 통성혐기성의 그람양성 간균으로, 일반적으로 안전하다고 알려져 있는 균주(generally recognized as safe, GRAS)이며 탈질, 철환원, 망간산화 등 다양한 활성을 가지고 있고, 다양한 자연환경에 광범위하게 서식하는 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 질소 저감 활성을 가지는 바실러스(Bacillus) 속 시아멘시스 종 미생물을 분리하고, 상기 분리된 미생물에 아질산 산화능, 탈질화능, 및 질소 저감능이 있음을 확인함으로써, 상기 미생물이 폐수 처리 공정 내 생물학적 질소 처리에 친환경 질소 저감용 미생물 제제로 사용될 수 있도록 하였다.
본 발명자들은 친환경적인 질소 저감용 미생물 제제를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주가 아질산 산화능, 탈질화능, 및 질소 저감능을 가진다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 질소 저감 활성을 가지는 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주(KCTC 13372BP) 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 질소 저감 활성을 가지는 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주(KCTC 13372BP)를 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 일구현예로서, 상기 균주는 아질산 산화능, 탈질화능 또는 질소 저감능을 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 질소 저감용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 건조물은 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 동결건조 분말인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주를 배양하는 단계, (b) 상기 배양된 균주의 균체를 배지에 현탁한 후 동결건조 하여 동결건조 분말을 제조하는 단계, 및 (c) 상기 동결건조 분말을 포함하는 미생물 제제를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 질소 저감용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 (b)단계에서 동결건조는 상기 균체를 0.05 내지 1% w/v 효모 추출물이 포함된 탈지우유(skim milk) 배지에 균체를 현탁한 후 1 내지 10일간 동결건조 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 일구현예로서, 상기 (c)단계에서 미생물 제제는 동결건조 분말 0.1 내지 10중량%, 포도당 90 내지 99.9중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주는 아질산 산화능, 탈질화능, 및 질소 저감능을 갖는 것으로 확인되었는바, 폐수 처리 공정 내 생물학적 질소 처리에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 아질산 산화 활성을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일구현예에 따른 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 탈질화 활성을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일구현예에 따른 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 총 질소 저감 활성을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일구현예에 따른 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 16S rRNA를 암호화하고 있는 유전자(rDNA)의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일구현예에 따른 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 16S rRNA를 암호화하고 있는 유전자(rDNA)의 염기서열(bp)을 공지 균주와 비교하여 계통발생학적 모식도로 나타낸 도면이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 질소 저감 활성을 가지는 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주(KCTC 13372BP)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 서열은 서열번호 1로 표시되는 것이다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 공시 균주인 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) KCTC 13613T와 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
이에 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주로 명명하고, 2017년 10월 20일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13372BP를 부여 받았다.
본 발명의 상기 균주는 토양시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 아질산 산화능, 탈질화능, 질소 저감능을 가진다.
상기 아질산 산화능은 폐수 내의 암모니아성 질소(NH4 ＋-N)가 산화되어 생성되는 아질산성 질소(NO2 －-N)를 질산성 질소(NO3 －-N)로 산화시키는 능력을 말하며, 이 때 상기 아질산 산화능은 아질산 산화 활성 측정 배지(nitrite oxidation agar)에서 균주의 생육 유무를 기준으로 하였고, 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주는 아질산 산화 활성 측정 배지에서 생육하는 것을 확인하였다(도 1 및 실험예 1 참조).
또한, 상기 탈질화능은 질산성 질소(NO3 －-N)를 질소가스(N₂)로 전환하여 제거시키는 능력을 말하며, 이 때 상기 탈질화능은 탈질화 활성 측정 배지(denitrification agar)에서 균주 주위의 색 변화를 기준으로 하였고, 탈질화 활성 측정 배지에서 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 주위에 초록색에서 파란색으로의 색 변화를 확인하였다(도 2 및 실험예 2 참조).
또한, 상기 질소 저감능은 합성 질소 폐수에 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주를 처리한 후 유기성 질소와 무기성 질소의 합인 총 질소 함량 측정을 환경부에서 고시하는 수질오염공정시험방법에 나와있는 총 질소 함량 측정법을 적용하여 실시하였고, 상기 균주를 처리한 폐수에서 질소 함량 저감을 확인하였다(도 3 및 실험예 3 참조).
따라서, 본 발명의 균주에는 질소 폐수 내의 질소를 저감하는 효과가 있다는 것을 확인하였고, 이에 따라, 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 16S rRNA를 암호화하고 있는 유전자(rDNA)를 확인하였다. 상기 균주의 16S rRNA를 암호화하고 있는 유전자(rDNA)는 16S rRNA gene sequencing에서 확인되었다(도 4 및 실시예 2 참조).
또한, 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 16S rRNA를 암호화하고 있는 유전자(rDNA)를 이용한 계통분류학적 모식도를 확인하였다(도 5 및 실시예 2 참조). 상기 균주의 계통분류학적 모식도는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0 version에서 확인된 것이다.
이에 본 발명은 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 질소 저감용 미생물 제제를 제공한다.
이 때, 상기 건조물은 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 동결건조 분말인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 미생물 제제는, 균주 또는 이의 배양물에 첨가제, 증량제, 영양제 등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 첨가제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있고, 증량제 및 영양제로는 skim milk(배지), yeast extract(효모 추출물), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트(bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주를 배양하는 단계, (b) 상기 배양된 균주의 균체를 배지에 현탁한 후 동결건조 하여 동결건조 분말을 제조하는 단계, 및 (c) 상기 동결건조 분말을 포함하는 미생물 제제를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 질소 저감용 미생물 제제의 제조방법을 제공한다.
이 때, 상기 (a)단계는 토양으로부터 분리한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주를 배지에 획선도말 하고 동일한 배양조건에서 배양하는 단계이다. 이 때, 상기 배지는 보통 한천배지(또는 영양 한천배지, nutrient agar)인 것이 바람직하나, 이제 제한되지 않는다.
상기 (b)단계는 상기 배양된 균주의 균체를 0.05 내지 1% w/v의 효모 추출물이 포함된 탈지우유(skim milk) 배지에 균체를 현탁한 후 1 내지 10일간 동결건조 하여 동결건조 분말을 제조하는 단계이다. 이 때, 상기 탈지우유(skim milk) 배지는 0.4 내지 0.6% w/v의 효모 추출물이 포함된 탈지우유(skim milk) 배지를 사용하는 것이 동결건조 후 균주의 생존율 및 생장이 더 원활하여 바람직할 수 있다.
또한, 상기 (c)단계는 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 동결건조 분말 0.1 내지 10중량% 및 포도당 90 내지 99.9중량%를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 단계이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1.
1-1. 토양으로부터 바실러스 시아멘시스 ( Bacillus siamensis ) 1HC -NA 균주의 분리
질소 저감 미생물 제제로써 활용 가능한 미생물을 분리하기 위해 경상북도 상주 소재 콩 재배 근권 토양에서 토양시료를 수집하였다. 토양으로부터의 미생물 분리는 토양 시료 1 g을 0.85% NaCl solution 9 mL에 넣어 충분히 교반하고, 9 mL의 0.85% NaCl solution을 이용하여 단계별 희석을 실시하였다. 희석을 한 각 시료 구간에서 100 μL를 덜어 낸 다음 nutrient agar에 도말 하였다. 단일 콜로니로 자란 미생물들은 콜로니 외형을 이용한 형태학적 분류방법을 이용하여 분리를 하였고 분리한 미생물을 이용하여 질소 저감 미생물 제제로써의 활성을 평가하여 최종 분리 균주를 선정하였다. 최종 분리된 균주는 16S rRNA gene 영역을 증폭하여 염기서열을 분석하여 동정하였다.
1- 2. 동결건조 분말 및 미생물 제제의 제조
상기 실시예 1-1의 분리균주를 nutrient agar 배지에 획선도말한 후 배양하고 이를 이용하여 동결건조 제제를 만들어 실험에 사용하였다. 동결건조 제제 제작에는 균체를 0.5% (w/v) yeast extract가 포함된 skim milk 배지에 균체를 현탁 한 후 5일간 동결건조 하여 동결건조 분말을 제작하였다. 또한, 대조군으로 사용될 질소 저감 미생물 제제 해외 제품과 동일한 조성을 만들기 위해 실험에 사용할 상기 균주의 동결건조 분말 1%와 포도당 99%를 혼합함으로써 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 제조 하였다.
실험예
1. 아질산 산화 활성 측정
아질산 산화 활성 확인을 위해 상기 실시예 1-1의 분리균주를 nutrient agar 배지에 획선도말한 후 배양하여 단일 콜로니를 얻었다. 분리한 단일 콜로니를 nitrite oxidation agar (NaNO2 0.006 g, MgSO4 ·7H2O 0.1 g, FeCl3 ·7H2O 0.03 g, CaCl2·2H2O 0.3 g, KH2PO4 1 g, Na3C6H5O7 0.3 g, NaHCO3 1 g, Agar 15 g)에 획선도말 하고 생육 및 griss test에 의한 균주 주위로의 투명환 형성 여부를 기준으로 하여 아질산 산화 활성을 확인하였다. 상기 균주는 control 균주인 E. coli DH5a에 비해 nitrite oxidation agar 에서의 생육 및 아질산 산화 활성이 더 나은 것으로 확인되었으며, 이의 결과를 도 1에 나타내었다.
2. 탈질화 활성 측정
탈질화 활성 확인을 위해 상기 실시예 1-1의 분리균주를 nutrient agar 배지에 획선도말한 후 배양하여 단일 콜로니를 얻었다. 분리한 단일 콜로니를 denitrification agar (NaNO3 1 g, Asparagine 1 g, 1% BTB solution 5 mL, Na3C6H5O7 8.5 g, MgSO4 ·7H2O 1.0 g, FeCl3 ·7H2O 0.05 g, CaCl2 ·2H2O 0.2 g, KH2PO4 1 g, Agar 15 g)에 획선도말 하고 생육 여부를 기준으로 하여 탈질화 활성을 확인하였다. Control 균주로 E. coli DH5a를 사용 하였으며 상기 균주는 denitrification agar에서 균주 주위에 초록색에서 파란색으로의 색 변화를 확인하였으며, 이의 결과를 도 2에 나타내었다.
3. 질소 저감 활성 측정
질소 저감 활성 측정을 위해 총 질소 함량이 200 mg/L인 합성 질소 폐수(((NH4)2SO4 0.47 g, NaNO2 0.25 g, NaNO3 0.65 g, FeCl3 0.2 mg, CaCl2 0.2 mg, MnSO4 0.9 mg)를 1 L 제조하여 멸균한 후 합성 질소 폐수 volume의 1%에 해당하는 10 g의 해외 미생물 제제와 10 g의 상기 실시예 1-2의 미생물 제제를 처리해 주었다.
상기 해외 미생물 제제는 BiOWiSH technology사에서 제조되는 BiOWiSH-Aqua 제품이며, 상기 해외 미생물 제제의 주 균주 성분은 Bacillus sp. 이다.
처리한 시점으로부터 12시간 단위로 sampling을 실시해 주었으며 2일간 실험을 진행하였다. 총 질소 저감률을 측정 하기 위하여 sampling 한 시료를 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리 후 상등액을 취하고 이를 1,000 배 희석한 용액을 실험의 시료로 사용하였다. 실험법은 환경부에서 고시하는 수질오염공정시험방법에 나와있는 총 질소 함량 측정법을 적용하여 실시하였으며 총 질소 함량 저감률 측정을 위한 검량 곡선은 0 ~ 0.1 mg의 질소 함량이 되도록 질산 용액을 제조하여 동일한 방법으로 측정한 후 회귀방정식을 확보하였다. 실험 결과 상기 균주를 이용한 미생물 제제는 2일간 20%의 질소 저감률을 나타내었으며 이의 결과는 도 3에 나타내었다.
실시예 2 : 분리 균주의 동정
아질산 산화, 탈질화, 질소 저감 활성을 확인한 균주의 동정을 위하여 회수한 균체로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후(Thompson, 1980), 분리한 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의하여 16S rRNA gene을 증폭하였다. 이 때 사용한 다용도 프라이머(universal primer)는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 각각 사용하였다(Lane 1991). 증폭한 PCR 산물은 PCR 정제 시스템(Solgent, Daejeon, Korea)을 이용하여 정제하였다. 정제한 PCR 산물의 전체 염기서열을 분석하기 위한 염기서열분석(sequencing)은 솔젠트(Solgent, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 실시하였다.
분석한 염기서열 결과는 NCBI의 BLASTN을 이용하여 비교하였으며, 염기서열의 상동성 및 계통발생학적 모식도(phylogenetic tree)는 Bioedit와 Mega6 프로그램을 통해 인접결합방법(neighbor-joining methods)을 사용하여 분석하였다. 이의 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
분리한 균주는 기존에 보고된 공시 균주인 바실러스 시아멘시스 (Bacillus siamensis) KCTC 13613T와 99%의 상동성을 가지는 것으로 확인하였다. 상기 균주는 기존의 바실러스 시아멘시스 (Bacillus siamensis) KCTC 13613T와 1% 상이하기 때문에, 시아멘시스 종에 속하는 신규한 균주로 인정받아, 이를 바실러스 시아멘시스 (Bacillus siamensis) 1HC-NA으로 명명하고, 상기 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 13372BP). 또한 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바실러스 시아멘시스 (Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 염기서열을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13372BP
수탁일자 : 20171020
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Bacillus siamensis 1HC-NA strain having nitrogen removal activation, and microbial agent comprising the same for removing nitrogen <130> MP17-262 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1394 <212> DNA <213> Bacillus siamensis 1HC-NA 16S rRNA <400> 1 atgcagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60 acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120 atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180 ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240 ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300 ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360 gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420 gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600 aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660 tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780 agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840 gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960 tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080 ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200 caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260 gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380 cccgaagtcg gtga 1394

Claims (8)

  1. 질소 저감 활성을 가지는 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주(KCTC 13372BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 아질산 산화능, 탈질화능 또는 질소 저감능을 가지는 것을 특징으로 하는, 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 질소 저감용 미생물 제제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 건조물은 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주의 동결건조 분말인 것을 특징으로 하는, 질소 저감용 미생물 제제.
  6. (a) 제1항의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주를 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양된 균주의 균체를 배지에 현탁한 후 동결건조 하여 동결건조 분말을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 동결건조 분말을 포함하는 미생물 제제를 제조하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 질소 저감용 미생물 제제의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (b)단계에서 동결건조는, 상기 균체를 0.05 내지 1% w/v 효모 추출물이 포함된 탈지우유(skim milk) 배지에 균체를 현탁한 후 1 내지 10일간 동결건조 하는 것을 특징으로 하는, 질소 저감용 미생물 제제의 제조 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 (c)단계에서 미생물 제제는, 동결건조 분말 0.1 내지 10중량%, 포도당 90 내지 99.9중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는, 질소 저감용 미생물 제제의 제조 방법.


KR1020170159334A 2017-11-27 2017-11-27 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제 KR102051873B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170159334A KR102051873B1 (ko) 2017-11-27 2017-11-27 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170159334A KR102051873B1 (ko) 2017-11-27 2017-11-27 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190061210A true KR20190061210A (ko) 2019-06-05
KR102051873B1 KR102051873B1 (ko) 2019-12-04

Family

ID=66845372

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170159334A KR102051873B1 (ko) 2017-11-27 2017-11-27 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102051873B1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210040662A (ko) * 2019-10-04 2021-04-14 부산대학교 산학협력단 산성 폐수 중화용 미생물 제제
CN113980863A (zh) * 2021-11-26 2022-01-28 南京工业大学 一株暹罗芽孢杆菌及其应用
WO2022120503A1 (es) 2020-12-08 2022-06-16 Blanes Spa Formulación agrícola que comprende al menos una cepa bacteriana b. safensis rgm 2450, y/o una cepa bacteriana b. siamensis rgm 2529 y excipientes agrícolas; uso de la formulación y método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas
KR20220105009A (ko) * 2021-01-19 2022-07-26 제주대학교 산학협력단 폐사어 발효물 내 gaba 함량을 증가시키는 바실러스 서브틸리스 jc-03 균주 및 이의 용도

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040090678A (ko) * 2003-04-18 2004-10-26 학교법인 동아대학교 폐수 중의 질소 제거능을 가지는 바실러스속 ｃｈ-ｎ 균주
KR20070002472A (ko) * 2005-06-30 2007-01-05 오계헌 수중의 질소, 인, 또는 질소와 인을 동시 제거하는 능력을가진 바실러스 속 신규 균주 ｃｋ­１０ 및 ｃｋ­１３과이를 이용한 질소 및 인의 제거방법
KR20080107193A (ko) * 2007-06-05 2008-12-10 수원대학교산학협력단 바실러스 서브틸리스 ｋｋ71 균주 및 이의 배양액을유효성분으로 함유하는 혈당강하용 조성물
KR20090057747A (ko) * 2007-12-03 2009-06-08 한국과학기술연구원 질산화 및 탈질화 작용이 우수한 신규 미생물, 이를유효성분으로 함유하는 폐수 처리용 바이오클로드, 이의제조방법 및 이를 이용한 폐수 처리방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040090678A (ko) * 2003-04-18 2004-10-26 학교법인 동아대학교 폐수 중의 질소 제거능을 가지는 바실러스속 ｃｈ-ｎ 균주
KR20070002472A (ko) * 2005-06-30 2007-01-05 오계헌 수중의 질소, 인, 또는 질소와 인을 동시 제거하는 능력을가진 바실러스 속 신규 균주 ｃｋ­１０ 및 ｃｋ­１３과이를 이용한 질소 및 인의 제거방법
KR20080107193A (ko) * 2007-06-05 2008-12-10 수원대학교산학협력단 바실러스 서브틸리스 ｋｋ71 균주 및 이의 배양액을유효성분으로 함유하는 혈당강하용 조성물
KR20090057747A (ko) * 2007-12-03 2009-06-08 한국과학기술연구원 질산화 및 탈질화 작용이 우수한 신규 미생물, 이를유효성분으로 함유하는 폐수 처리용 바이오클로드, 이의제조방법 및 이를 이용한 폐수 처리방법

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210040662A (ko) * 2019-10-04 2021-04-14 부산대학교 산학협력단 산성 폐수 중화용 미생물 제제
WO2022120503A1 (es) 2020-12-08 2022-06-16 Blanes Spa Formulación agrícola que comprende al menos una cepa bacteriana b. safensis rgm 2450, y/o una cepa bacteriana b. siamensis rgm 2529 y excipientes agrícolas; uso de la formulación y método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas
KR20220105009A (ko) * 2021-01-19 2022-07-26 제주대학교 산학협력단 폐사어 발효물 내 gaba 함량을 증가시키는 바실러스 서브틸리스 jc-03 균주 및 이의 용도
CN113980863A (zh) * 2021-11-26 2022-01-28 南京工业大学 一株暹罗芽孢杆菌及其应用
CN113980863B (zh) * 2021-11-26 2022-05-31 南京工业大学 一株暹罗芽孢杆菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR102051873B1 (ko) 2019-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102051868B1 (ko) 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 테퀼렌시스(Bacillus tequilensis) 2F-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제
KR102051873B1 (ko) 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제
CN112625942B (zh) 一种好氧反硝化菌及其应用
Lee et al. Cultured bacterial diversity and human impact on alpine glacier cryoconite
KR101910275B1 (ko) 신규한 스트렙토마이세스 그리세우스 knu-05 균주 및 이의 이용
CN113215033B (zh) 一种磺胺类抗生素降解菌及其应用
CN112551692B (zh) 具有好氧反硝化和异养硫氧化功能的盐单胞菌及其应用
CN110283741A (zh) 一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰杆菌及其应用
KR101759826B1 (ko) 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 메가터리움 knu-01 균주 및 이의 이용
CN114908014B (zh) 促进溶解磷酸铁的油茶内生放线菌及其应用
KR101899650B1 (ko) 작물 생육 촉진 또는 항진균 활성을 가지는 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) KNU-03 균주 및 이의 이용
CN104805035A (zh) 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的红球菌(Rhodococcus sp.)2G
KR101144987B1 (ko) 크리세오박테리움 ｆｂｆ-7 균주 배양물 및 이를 함유하는 뿌리혹선충 방제용 조성물
KR101432425B1 (ko) 연안 갯벌과 갯지렁이로부터 동정된 복수의 균주 속 미생물을 포함하는 유기물 정화제
CN111471611B (zh) 一种净化海水池塘养殖尾水中无机氮磷的赤红球菌hdrr1及其应用
KR101898660B1 (ko) 바실러스 리케니포미스 sn1 균주 및 이를 포함하는 친환경음식물쓰레기처리제제
CN114752538B (zh) 具有土壤改良功能的油茶内生放线菌及其应用
Stabnikov Production of bioagent for calcium-based biocement
KR101898662B1 (ko) 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 kj5 균주 및 이를 포함하는 친환경음식물쓰레기처리제제
KR101475589B1 (ko) 연안 갯벌에서 분리 동정한 균주 및 이를 이용한 갯벌 유기물 정화제
JP2006230332A (ja) 新規微生物及びそれを用いた有機性汚泥の処理方法
KR101455925B1 (ko) 양식장 폐수 처리에 적합한 갯지렁이 유래 바실러스 속 신규 균주 및 미생물 제재
CN113462618B (zh) 一株缓解植物铜毒害的耐铜细菌RCu及其应用
CN106834165B (zh) 可降解青霉素的副球菌、细胞级分及其组合物
CN111471612B (zh) 一种净化海水池塘养殖尾水中无机氮磷的赤红球菌hdrr2y及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant