WO2022120503A1 - Formulación agrícola que comprende al menos una cepa bacteriana b. safensis rgm 2450, y/o una cepa bacteriana b. siamensis rgm 2529 y excipientes agrícolas; uso de la formulación y método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas - Google Patents

Formulación agrícola que comprende al menos una cepa bacteriana b. safensis rgm 2450, y/o una cepa bacteriana b. siamensis rgm 2529 y excipientes agrícolas; uso de la formulación y método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas Download PDF

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Edgar Armando MONTENEGRO MELGAR
Wilson Guillermo PINEDA MIJANGOS
Elena María DARDÓN FRESSE DE ÁVALOS
Héctor Ronaldo RAMAZZINI SANTOS
Ignacio Viteri GARCÍA-GALLONT
Francisco VITERI ARRIOLA
Verónica Melissa DELGADO HERNÁNDEZ
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Blanes Spa
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Definitions

  • the present invention is directed to formulations for agricultural use that contain bacteria or mixtures of these, which have characteristics of crop growth enhancer and biological control of pests.
  • the present invention focuses on the area of biotechnology, particularly on the development of agricultural products that enhance crop growth and prevent and control pathogen infection in crops through the use of formulations that contain one or a mixture of bacteria with these characteristics.
  • Products for agroindustry of biological origin are formulated with microorganisms (for example, bacteria, fungi, viruses) or with active compounds derived from microorganisms or plants. All these products focus on improving productivity, quality, plant health and biological characteristics of soils (Altier et al., 2012). In the case of products that contain microorganisms, these are selected for their ability to promote plant growth directly, facilitating the absorption of nutrients by the plant (biofertilizers) or indirectly contributing to the sanitary management of pest diseases of economic impact (Biocontrollers). It is worth mentioning that many of these strains that are used for these purposes may present characteristics of fertilizers and/or biocontrollers (Altier et al., 2012).
  • Soil is an ecosystem that hosts a variety of beneficial microorganisms. The fraction of soil that presents this type of microorganisms is found where there is the greatest presence of roots (rhizosphere) (Chollo et al., 2012). In the rhizosphere, bacterial consortia that promote plant growth can coexist directly and indirectly (Mayak et al.
  • PGPR are associated with important crops such as Oryiza sativa, Triticum spp., Sorghum spp, Sacharum officinarum, Zea mays and pastures.
  • PGPR are Azospirillum sp., Bacillus sp., Rhizobium sp., Burkholderia sp., Enterobacter sp., Azotobacter sp., Erwinia sp., Herbaspirillum sp., Klebsiella sp., Pseudomonas sp. and Xanthomonas sp. (Chollo et al., 2012).
  • PGPR bacteria belonging to the genus Bacillus. These gram-positive bacteria are ubiquitous, that is, they can inhabit different ecological niches, including the soil (Pignatelli et al., 2009). Soil-dwelling bacteria of the genus Bacillus may have characteristics of PGPR. For example, these bacteria have the ability to fix atmospheric nitrogen (N2). Nitrogenase-type enzymes belonging to this bacterium reduce N2 to ammonia (NH3), the latter being absorbed by the plant.
  • N2 atmospheric nitrogen
  • NH3 ammonia
  • bacteria play an important role in the solubilization of phosphates (P) so that this compound can be available to plants, for this, bacteria use enzymes such as phosphatase, phytase, hydrolases, among others (Hayat et al., 2010 ). Regarding the solubilization of components carried out by these bacteria, the solubilization of potassium (K) is also presented.
  • This compound is necessary for the activation of various plant and animal enzymes that are intended to participate in energy metabolism, such as starch synthesis, nitrate reduction, sugar degradation and one of the most important functions, photosynthesis (Etesami et al., 2017)
  • antimicrobial compounds are secreted by bacteria that act as antagonists against other pathogenic species.
  • These compounds are molecules, particularly peptides and polypeptides of non-ribosomal synthesis composed of polyketides, bacteriocins and siderophores, as well as volatile compounds. In general, they have a broad spectrum of action (bacteria, fungi) and Bacillus strains have a predominant biological control capacity through the secretion of these molecules, inhibiting the growth of pathogens in plants.
  • Bacillus safensis is a species that has the ability to endophyte and inhabit the rhizosphere of plants, which promotes their growth.
  • B. safensis solubilizes soil phosphate (P) and produces siderophore, indole-3-acetic acid and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (Yadav et al. 2011; Chakraborty et al 2013; Kavamura et al 2013).
  • this bacterium can act as a biocontroller, presenting antifungal, antibacterial, and antiviral effects in various cultures, individually or in the company of other bacteria (Sun et al. 2014). - Bacillus siamensis.
  • This bacterium of the genus Bacillus was isolated in 2010 from a Thai crab, calling this strain B. siamensis KCTC 13613. It has been observed that this strain has the ability to significantly inhibit the growth of the mycelium of the plant pathogenic fungi Rhizoctonia solani and Botrytis cinerea, in addition to presenting antimicrobial activity against the gram-positive bacterium Micrococcus luteus (Jeong et al., 2012). On the other hand, it has been observed that B. siamensis can significantly increase the growth of Arabidopsis thaliana seedlings without physical contact with the seedlings, suggesting that the volatile substances produced by these bacteria could promote plant growth (Jeong et al ., 2012).
  • bacteria of the Bacillus genus have characteristics that allow them to coexist with plants, particularly in the rhizosphere, and promote plant growth. Also, bacteria of the genus Bacillus have been reported to produce antimicrobial compounds so that they can control the growth of other plant pathogens. These characteristics have been described in documents such as the one presented by Borris R, in 2011.
  • patent documents are presented that reveal the use of microorganisms of the genus Bacillus, particularly, B. siamensis and B safensis as growth-enhancing agents in plants and biocontrollers.
  • B. siamensis and B safensis as growth-enhancing agents in plants and biocontrollers.
  • patent documents CN 109468243 and KR 1020190061210 which present the use of B. siamensis, particularly, in the first document the use of B. siamensis is disclosed as a biocontrol agent since it presents a significant antagonism against pathogens , in the particular case of this document, the growth inhibition of stem rot and leaf spots is presented.
  • the second document discloses the use of this bacterium as it has nitrogen reduction characteristics, indicating that it can be used to enhance plant growth or for water treatment.
  • Documents CN109456915 and CN108330092 disclose the use of the bacterium B. safensis, as a plant growth-enhancing agent. These documents describe the characteristics of this bacterium such as the degradation of phosphorus (P) in the soil. On the other hand, documents KR1020140079201, CN108865934, CN108330092, CN106119146 describe the use of this bacterium and/or its cultures as antagonists for the growth of plant pathogens, such as B. cinerea
  • the present invention corresponds to an agricultural formulation, which is composed of one or two bacterial strains that have plant growth promoting characteristics (PGPR) and bioprotective and biocontrol characteristics.
  • the formulation may comprise the bacteria individually or a mixture of the strains Bacillus safensis RGM 2450 and Bacillus siamensis RGM 2529. Both bacteria are defined according to their registration number or deposit in the IDA microbial bank in the Chilean genetic microbial sources in I NIA, Quilamapu, Chile.
  • the bacteria of the present invention are used by means of a formulation and their characteristic is a biostimulant, bioprotective and biocontrol function.
  • Another aspect of the present invention relates to a biofertilizer that improves crop yield, comprising a mixture of plant growth-promoting bacteria and agriculturally acceptable excipients.
  • the present invention protects two processes that optimize agricultural crops.
  • the present invention protects the welfare of plants.
  • the present invention aims to increase the availability of elements that are considered nutrients for plants, such as nitrogen (N2), potassium (K) and phosphorus (P), enhancing their growth.
  • the increased availability of nutrients for plants is generated through the use of bacteria naturally present in the soil, which have the ability to solubilize these compounds (K and P) and fix nitrogen (N2 ).
  • the safety of crops is protected by protection against pathogens.
  • this protection is given since the bacteria used have the ability to release substances or molecules that are harmful to pathogenic organisms.
  • the bacteria Bacillus safensis RGM 2450 and Bacillus siamensis RGM 2529 would produce antimicrobial compounds against a broad spectrum of bacteria and fungi. In the case of B.
  • siamensis RGM 2529 it has been shown that this strain could potentially produce antimicrobial compounds with an antibacterial effect on S. aureus ATCC 25923, M. luteus CMCC 28001, B. pumilus CMCC 63202, B. cereus ATCC 14579, B. subtilis ATCC 168, Listeria monocytogenes CICC 21662, Enterococcus faecalis ATCC 29212 and P. fluorescens ATCC 49642, B. thuringiensis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, M. xanthus, P. vulgaris, Serratia marcescens, S. aureus, L. pneumophila, L. monocytogenes, P.
  • Ustilago maydis, Monilinia fructicola, Penicillium expansum, Phomopsis gossypii, Phytophthora capsici, Pyricularia grisea, R. solani, Sclerotium rolfsii, S. sclerotiorum, Alternaria solani, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Fusarium sambucinum, Fusarium oxysporum, Podosphaera fusca, Pythium sulcatum, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizopus sp., Sclerotinia sclerotiorum.
  • B. safensis RGM 2450 would produce antimicrobial compounds against Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum, Erwinia amylovora, Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, B. subtilis, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans.
  • Candida albicans Microcystis aeruginosa, Phytophthora infestans, S. cerevisiae, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, and F. oxysporum f. sp. Capsica.
  • strains can also secrete enzymes such as proteases, serine proteases, among others, for which their antibacterial and antifungal effect has been described. Therefore, as part of the scope of the invention, the bioprotective effect of the strains is included independently and together in the formulation against a wide variety of phytopathogenic fungi and bacteria.
  • the formulation and the bacteria described present a biocontrol effect of phytopathogens, that is, its function is to reduce the growth of the pathogen population, in this case in crops and plants.
  • the bacteria and the formulation are shown to have an antibacterial effect against Fusarum sp., Phytophthora sp., Collectotrichum sp. and Botrytis sp.
  • the tests show that the RGM 2450 and RGM 2529 strains inhibit the growth of this phytopathogen in a significantly greater way than the reference commercial product devoid of its co-formulants (bacteria Bacillus subitillis QST 713), reaching an inhibition percentage of 50%. both when using each RGM strain separately, and when doing so by applying the mixture of both.
  • the mixture of bacterial strains is combined to obtain a biofertilizer in accordance with the principles of the present invention, where the bacterial strains are found in preferred concentrations of 3.0x10 6 - 4.0x10 9 CFU/g (RGM 2529) and 5.0x10 6 - 4x10 9 CFU/g (RGM 2450).
  • Another aspect of the invention relates to a biofertilizer comprising a mixture of bacteria and an agriculturally acceptable excipient whose function is to enhance the growth of crop plants.
  • the excipient for agricultural use and/or agriculturally acceptable comprises the use, but not limited to, of wheat flour, corn starch, gelatin, potato starch, silicon dioxide, citric acid, bicarbonate, polysorbates such as Tweens, lactose, soy lecithin, casein, carboxymethyl cellulose or cellulose gum, sucrose esters, mannitol, sorbitans, pluronic F68, alginate, xanthan gum, PEG (polyethylene glycol), corn syrup, egg, milk, glycerol, fructose, pectins, mineral oil, ester gum, long chain triglycerides.
  • polysorbates such as Tweens, lactose, soy lecithin, casein, carboxymethyl cellulose or cellulose gum, sucrose esters, mannitol, sorbitans, pluronic F68, alginate, xanthan gum, PEG (polyethylene glycol), corn syrup, egg, milk, glycerol
  • a biocontroller comprises an organism that inhibits the growth of another, the latter being a pathogenic organism.
  • the biocontroller comprises the mixture of the strains Bacillus safensis RGM 2450 and Bacillus siamensis RGM 2529.
  • the biofertilizer/biocontroller of the present invention may have as a carrier a pre-packaged soil, a seed coat, a powder, a granulate, a nebulizer, a suspension or a liquid or any of the aforementioned variants. encapsulated.
  • strains Bacillus safensis RGM 2450 and Bacillus siamensis RGM 2529 form part of a formulation that can be administered as a prolonged-release tablet, a wettable solid powder, as an effervescent tablet, as a resuspension, emulsion bacterial or mixtures of these.
  • the administration of the formulation in conjunction with fertilizers is part of the scope of the invention. Its administration with percentages of 0, 33, 66 and 100% of fertilizer is preferred.
  • the different presentation forms of the formulation can be administered to the seed or at the base of the stem.
  • these are impregnated with PBS buffer or similar and completely submerged in the formulation, a concentration of 10 9 CFU/mL of bacteria being preferred.
  • a concentration of 10 8 CFU/mL is preferred.
  • the biofertilizer/biocontroller formulation is effective both for plants that are used in the area of agriculture, as well as for obtaining animal and human food, for example, fruits and vegetables, as well as for plants that can be cultivated with the objective simply to be ornamental.
  • the formulation part of the present invention is focused on its use in agricultural crops, which may include, without being limited to the species of tomato (Solanum lycopersicum), banana (Musa paradisiaca), sugar cane (Saccharum officinarum), peppers ( Capsicum annuum), papaya (Carica papaya), corn (Zea mays), watermelon (Citrullus lanatus), melons (Cucumis meló), avocado (Persea americana), coffee (Coffea arabica), peas (Pisum sativum), beans (Phaseolus vulgaris ), hemp (Cannabis sativa), Wheat (Triticum spp), rice (Oryza sativa), pineapple (Anana
  • the agricultural formulation described in the present invention has a method of action, which is aimed at crop plants and pathogens that affect them, so direct contact of this product with humans could not cause any harm.
  • the biological product of the present invention allows a reduction in greenhouse gases since it reduces the use of traditional agrochemicals, representing an alternative for the replacement of the latter and allows compliance with environmental standards such as those that are established in the Organization for Economic Co-operation and Development (OECD).
  • a method to promote the growth and/or increase the yield of crops and/or protect them against diseases and pests by means of the administration or application of an effective amount of the described formulation.
  • the method includes the administration of the agricultural formulation in the form of a resuspension, emulsion, effervescent tablet, prolonged release tablet or wettable powder.
  • the formulation can be applied by spraying or direct immersion of the seed of the crop of interest and/or by applying it to the base of the stem of the plants.
  • a concentration of 10 9 CFU/mL of bacteria is preferred.
  • a concentration of 10 8 CFU/mL of bacteria is preferred.
  • the treatment that presented the best effect was the mixture of bacteria in a prolonged-release tablet presentation with 100% complementary fertilization, exceeding 250 ⁇ g/mL of chlorophyll.
  • the present invention describes a formulation and method that allow the increase of the growth capacity of the plants and the obtaining of better harvests.
  • the term “obtained from” refers to which sample is isolated or derived from a particular source.
  • the term “derived from” refers to the source from which the sample comes.
  • the term "method” refers to a process that allows performing a task or obtaining a result of a given objective.
  • the term “preventive method” refers to a process or a set of these that allows a task or objective to be carried out in order to prevent a future event.
  • the term “treatment method” includes the process or set of these that are used to alleviate or cure a disease.
  • Biocontrol is understood as a method for the control of pests, diseases and/or weeds whose purpose is the use of living organisms to control the growth of other populations of living organisms.
  • Biocontroller refers to products of non-synthetic origin that are used to control pests in crops.
  • biostimulant When the term "biostimulant” is referred to in the document, it is indicated as a substance or mixture of substances with or without microorganisms that can be applied to crop plants, seeds or roots. These substances or mixtures have the characteristic of improving aspects of the plant such as obtaining better harvests, through the stimulation of biological processes, improvements in the availability of nutrients, improvements in the absorption of nutrients, tolerance to stress, etc.
  • bioprotector it describes any product or device whose function is to protect the characteristics and functions of living beings from external aggressions to which they may be subjected. An example of this in plants is when they are subjected to abiotic stress.
  • biological control organisms refers to microorganisms that have the ability to inhibit the growth of another microorganism and that are used to control pests or diseases.
  • Biofertilizer refers to an agricultural input formulated with at least one growth-promoting bacterium that improves crop yields when applied to it.
  • PGPR corresponds to the English abbreviation of "plant growth promoting rhizobacteria” and refers to bacteria present in the rhizosphere which colonize the root system of plants or their closest environment and enhance its growth.
  • Rhizobacteria it corresponds to those bacteria present in the rhizosphere.
  • a bacterium has PGPR activity, it means that said bacterium is capable of colonizing the root system of plants or their closest environment and enhancing its growth.
  • excipient refers to any substance that can be used without affecting the active ingredient.
  • excipient refers to any substance used to generate, produce or manufacture a product for agricultural use that contains an active ingredient.
  • the term “pill” or “tablet” When referring to the term “pill” or “tablet”, it is indicated as a small piece consisting of a moldable material or ingredient, which can have various sizes, shapes and uses.
  • the term “effervescent tablet” refers to a tablet that within its composition generally contains acidic substances and carbonates or bicarbonates, which react rapidly in the presence of water with release. of carbon dioxide.
  • the term “prolonged-release tablet” refers to a tablet that has characteristics that allow the release of the active ingredient from a formulation slowly, which allows the effect of the active ingredient to be extended between doses.
  • wettable powder refers to those substances (active ingredients and/or excipients) present in a formulation that, when mixed with water before application, form a suspension.
  • the term "resuspension” refers to the incorporation of material or substance which is suspended in liquid when it is present as a precipitate or as a dry material or substance.
  • the term "emulsion” refers to a liquid with a milky appearance that contains small particles or drops of another insoluble substance in suspension.
  • Figure 1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene. The Neighbor-joining method and the K-2 parameter model were used to determine the phylogenetic relationship between the isolated Bacillus sp. with other Bacillus species. Micrococcus luteus DSM 20030T was used as an outgroup. Bootstrap values (expressed as percentages of 1000 repetitions) greater than 50% are displayed at nodes. The bar indicates 2 substitutions per 100 nucleotides. The isolates RGM 2450 and RGM 2529 are highlighted with a black circle. To the left of each type strain (T), the accession number for the NCBI database is indicated.
  • Figure 2 Phylogenetic tree based on pyrE analysis of strain RGM 2450 sp. and related type species. For pyrE genetic marker analyses. The Maximum Likelihood method and the Tamura-Nei model were used to determine the phylogenetic relationship between the RGM 2450 isolate and the type strains of the species B. safensis, B. pumilus and B. altitudinis. The strain B. cereus ATCC 1479T was used as an outgroup. Bootstrap values (expressed as percentages of 1000 repetitions) are displayed at nodes. The bar indicates 5 substitutions for every 100 nucleotides. Strain RGM 2450 is highlighted with a black circle.
  • Figure 3 Phylogenetic tree based on gyrB analysis of strain RGM 2529 and related type species. The Maximum Likelihood method and the Tamura-3-parameter model were used to determine the phylogenetic relationship between the RGM 2529 strain and the type strains. B. cereus ATCC 14579 was used as an outgroup. Bootstrap values (expressed as percentages of 1000 replicates) are shown at nodes. The bar indicates 5 substitutions per 100 nucleotides.
  • FIG. 4 Evaluation of Nitrogen (N2) fixation and Phosphorus (P) solubilization of strains RGM 2450, RGM 2529 and the commercial strain QST 713.
  • the different bacterial strains were cultured in Ashby medium to analyze N2 fixation , while to evaluate the solubilization of P, the test was applied in modified Pikovskaya medium. The brightness of the photos was adjusted by 60% from the original shot.
  • the negative control is not shown in the figure; A) indicates nitrogen fixation tests, B) indicates Phosphorus solubilization tests, while 1) represents the tests on the RGM 2450 strain, 2) tests on the RGM 2529 strain and 3) tests with a commercial product.
  • FIG. 7 Antagonist activity of the strains RGM 2450, RGM 2529 and the commercial strain QST 713 against the phytopathogen Botrytis sp.
  • the graphs show the growth diameter in millimeters (mm) of Botrytis sp, where 1) corresponds to the control (untreated Botrytis), 2) corresponds to a commercial product v/s Botrytis, 3) RGM 2450 v/s Botrytis, 4 ) RGM 2529 v/s Botrytis. The average values are expressed together with their respective standard deviation. The letters indicate that there are significant differences (p-value ⁇ 0.05, ANOVA, LSD).
  • FIG. 1 Antagonist activity of the strains RGM 2450, RGM 2529 and the commercial strain QST 713 against the phytopathogen Colletotrichum sp.
  • the graphs show the growth diameter in millimeters (mm) of Colletotr ⁇ chum sp, where 1) corresponds to the control (untreated Colletotr ⁇ chum), 2) corresponds to a commercial product v/s Colletotr ⁇ chum, 3) RGM 2450 v/s Colletotr ⁇ chum, 4 ) RGM 2529 v/s Colletotrichum.
  • the average values are expressed together with their respective standard deviation.
  • the letters indicate that there are significant differences (p-value
  • FIG. 9 Antagonist activity of the strains RGM 2450, RGM 2529 and the commercial strain QST 713 against the phytopathogen Phytophthora sp.
  • the graphs show the growth diameter in millimeters (mm) of Phytophthora sp., where 1) corresponds to the control (untreated Phytophthora), 2) corresponds to a commercial product v/s Phytophthora, 3) RGM 2450 v/s Phytophthora, 4) RGM 2529 v/s Phytophthora. The average values are expressed together with their respective standard deviation. The letters indicate that there are significant differences (p-value
  • FIG. 10 Antagonistic activity of the strains RGM 2450, RGM 2529 and the commercial strain QST 713 against the phytopathogen Fusarium sp.
  • the graphs show the growth diameter in millimeters (mm) of Fusarium sp., where 1) corresponds to the control (untreated Fusarium), 2) corresponds to a commercial product v/s Fusarium, 3) RGM 2450 v/s Fusarium, 4) RGM 2529 v/s Fusarium. The average values are expressed together with their respective standard deviation. The letters indicate that there are significant differences (p-value ⁇ 0.05, ANOVA, LSD).
  • FIG. 11 Evaluation of N2 fixation and P and K solubilization activities of the RGM 2450 strain in the different formulation formats.
  • the figure shows the different tests in which the fixation of nitrogen (N) and the solubilization of phosphorus (P) and potassium (K) of the RGM 2450 strain were evaluated.
  • Different presentation formats for the formulation are evaluated, where 1) corresponds to the control, 2)-3)-4) correspond to the prolonged release tablet formulation without gelatin, 0.5X gelatin and 1X gelatin respectively, 5) wettable powder and 6) effervescent tablet.
  • FIG. 12 Evaluation of N2 fixation and P and K solubilization activities of the RGM 2529 strain in the different formulation formats.
  • the figure shows the different tests in which the fixation of nitrogen (N) and the solubilization of phosphorus (P) and potassium (K) of the strain RGM 2529 were evaluated.
  • Different presentation formats for the formulation are evaluated, where 1) corresponds to the control, 2)-3)-4) correspond to the prolonged release tablet formulation without gelatin, 0.5X gelatin and 1X gelatin respectively, 5) wettable powder and 6) effervescent tablet.
  • FIG 13 Effect of the RGM 2450 and/or RGM 2529 strains on the growth of tomato seedlings. The evaluation was carried out 21 days after the inoculation of the seeds in the treatments described. A) control; B) Resuspension of strain RGM 2450 in isotonic solution; C) RGM 2450 strain emulsion; D) Resuspension of strain RGM 2529 in isotonic suspension; E) Emulsion of strain RGM 2529; F) Resuspension of the mixture of strain RGM 2450 and 2529 in isotonic solution; G) Emulsion of mixtures of RGM 2450 and 2529 strains. Figure 14. Evaluation of the growth of tomato seedlings from seeds inoculated with bacteria.
  • FIG. 15 Antagonistic activity of PGPR strains against B. cinerea in tests carried out on grape berries.
  • the photo is a representative shot of the activity of the strains RGM 2450, RGM 2529, the mixture of both and the commercial strain QST 713.
  • A) indicates the berries inoculated with B. cinerea and B) indicates the berries not inoculated with B. cinereous
  • the photograph was taken after incubating the experimental units for 72 hours at 25°C. and high humidity.
  • Figure 16 Cumulative weight response surface of tomato fruits. On the Y axis is the accumulated weight (g) in X treatments and Z weeks. The colors represent the different surfaces covered according to the g reached in each treatment.
  • FIG. Quantification of total chlorophyll with respect to each treatment.
  • the bars represent the average values.
  • Figure 18 Grouping that participates in the synthesis and transport of plantazolicin microcin.
  • the gene cluster of strain RGM 2450 is compared with the gene cluster of strain B. pumilus ATCC 7061 and B. venelenzis FZB42 which participate in the synthesis of plantazolicin.
  • FIG. 19 Prediction of gene cluster encoding non-ribosomal peptide synthetase and other enzymes that would participate in the synthesis of bacilibactin.
  • A) Gene group that encodes the enzymes that participate in the synthesis of bacilibactin and adjacent genes that participate in transport and regulation functions.
  • Bacilibactin is synthesized by an NRPS assembly system (DhbACEBF) and secreted into space. extracellular.
  • Bacillibactin chelates iron with very high affinity, and the resulting iron-bacilibactin complex is imported back into the cytosol via the FeuABC-YusV system and hydrolyzed by BesA esterase to release iron, which yields three bacilibactin monomers (2, 3-dihydroxybenzoate-Gly-Thr).
  • the released iron serves as an enzyme cofactor.
  • Figure 20 Prediction of gene cluster encoding NRPS that would participate in cyclolipopeptide synthesis.
  • X identified amino acid; val, valine; le, isoleucine; leu, leucine; asp, aspartate; glu, glutamic acid. Partial prediction of molecule synthesized by NRPS.
  • Figure 21 Organization of the gene cluster that would participate in the synthesis of cyclolipopeptide in strains of the genus Bacillus sp.
  • FIG. 22 Prediction of gene cluster encoding NRPS that would participate in the synthesis of bacilisin.
  • FIG. 23 AcnABCD gene cluster encoding amylocycline.
  • FIG 24 DhbACEBF gene cluster of the RGM que 2529 strain that participates in the synthesis of bacilibactin. In the vicinity of the amylocycline gene neighborhood, the 13,034 bp DhbACEBF gene cluster was detected, which participates in the synthesis and assembly of the bacilibactic siderophore.
  • Figure 25 Genetic grouping that would participate in the synthesis of surfactin. A) Organization of the surfactin gene cluster in the RMG 2529 strain. B) Surfactin gene cluster in strains phylogenetically close to the RGM 2529 strain.
  • Figure 26 Genetic grouping that would participate in the synthesis of fengycine.
  • Figure 27 Genetic grouping that would participate in the synthesis of bacilomycin D.
  • Figure 28 Genetic grouping that would participate in the synthesis of bacilaeno.
  • Example 1 Characterization of the bacterial strains RGM 2450 and RGM 2529.
  • DNA extraction of the RGM 2450 and RGM 2529 strains was performed. Genetic markers were amplified: rRNA 16S and pyrE for the RGM 2450 strain, and 16S rRNA and rpoB for the RGM 2529 strain.
  • the amplification reaction of each genetic marker consisted of 25 to 50 ng of strain DNA, 1X of DreamTaq Green PCR Master Mix, 400 pMol of each primer (Table 1) and water Nuclease-free Millipura in a final reaction volume of 50 ⁇ L.
  • the thermal profile of the amplification consisted of an initial denaturation at 95 °C for 2 min, followed by 35 cycles of amplification (denaturation at 98 °C for 30 s, annealing at 55 °C for 30 s, and extension at 72 °C for 30 s). 45 s) and a final extension at 72 °C for 5 min.
  • the PCR products were visualized by 1% agarose gel electrophoresis and 1X GeIRed staining.
  • the band corresponding to the expected size was cut and purified with Zymo Clean Kit (Qiagen, Hilden, Germany) under the manufacturer's instructions.
  • the purified fragment from this reaction was sent to the Macrogen sequencing center for sequencing. Each marker was sequenced in the sense and anti-sense direction, using the primers in Table 1.
  • the sense and anti-sense sequences obtained from the sequencing of the genetic markers of the strains were assembled using the Vector NTI program.
  • the sequence of the markers of the RGM 2450 and RGM 2529 strains was compared with the type sequences of the species of the bacterial groups to which they belong (Table 2).
  • the identity of the RGM 2450 and 2529 strains was verified using the 16S rRNA genetic marker to determine the genus and bacterial group to which they belong, to later use the specific markers pyrE and rpoB to corroborate the particular species of RGM 2450 and RGM 2529. , respectively.
  • Analysis of the 16S rRNA gene indicated that strain RGM 2450 belongs to the B. pmilus group, while RGM 2529 belongs to the B. amyloliquefaciens group. Table 2.
  • the evolutionary history was determined using a statistical method (Maximum Likehood/Neighbor-joining) and a nucleotide substitution model (Kimura-2-parameters/Tamura-Nei/Tamura-3-parameters model), considering a Gamma distribution to model differences in the rate of change between sites.
  • the hypothesis of phylogenetic relationships was supported using 1000 bootstrap replicates.
  • the phylogenetic trees clearly plot the results presented in Table 2, indicating that the RGM 2450 strain shares a taxonomic name with the bacterial strain B. safensis FO-036b (100% bootstrap) (Fig. 2), while RGM 2529 is found in the same class as with B. siamensis KCTC 13613 T (99% bootstrap) (Fig. 3).
  • strains RGM 2450 and RGM 2528 were grown in 5 mL of LB liquid medium for 16 h (30°C and 200 rpm). 10 ⁇ L of the culture was added to the Pikovskaya agar medium (0.3 g/L NaCl; 0.3 g/L MgSO 4 -7H 2 O; 0.03 g/L MnSO 4 -4H 2 O; 0 0.3 g/L KCl, 0.5 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.03 g/L FeSO 4 7H 2 O, 2 g/L Ca 3 (PO4) 2 , 10 g/L L of glucose, 0.5 g/L of yeast extract, 15 g/L of agar Adjust to pH 7.0 (Vázquez et al., 2000) Incubate for 7 days at 30°C The appearance of a transparent halo around the bacterial colony indicated the ability to solubilize phosphate.
  • strains RGM 2450 and RGM 2528 were grown in 5 mL of LB liquid medium for 16 h (30°C and 200 rpm). 10 ⁇ L of the culture was added to modified Pikovskaya agar medium (0.3 g/L NaCl; 0.3 g/L MgSO 4 -7H 2 O; 0.03 g/L MnSO 4 -4H 2 O; 2 g/L KNO 3 , 0.5 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.03 g/L FeSO 4 7H 2 O, 0.5 g/L Ca 3 (PO4) 2 , 10 g/L glucose, 0.5 g/L yeast extract, 15 g/L agar Adjust to pH 7.0 (Vázquez et al., 2000) Incubate for 14 days at 30°C.
  • modified Pikovskaya agar medium 0.3 g/L NaCl; 0.3 g/L MgSO 4 -7H 2 O; 0.03 g/L MnSO
  • strains RGM 2450 and RGM 2528 were grown in 5 mL of LB liquid medium for 16 h (30°C and 200 rpm). It was centrifuged for 5 min at 3500 g and washed 3 times with sterile PBS buffer (8 g/L NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/L Na 2 HPO 4 , 0.24 g/L KH 2 PO 4 , adjust at pH 7.4).
  • Ashby medium (10 g/L of glucose; 0.2 g/L of KH 2 PO 4 ; 0.2 g/L of MgSO 4 ; 0.2 g/L NaCl; 0.2 g/L CaSO 4 ; 5 g/L CaCO 3 ) and incubated for 7 days at 30°C (Rao, 1999; Velázquez-Gurrola and Ramos-Alegr ⁇ a, 2015 ).
  • the growth of the strain indicated the ability to fix atmospheric nitrogen.
  • the assay was performed in triplicate.
  • the RGM 2450 strain has a similar ability to the commercial product strain that includes the Bacillus subtilis QST 713 strain, while RGM 2529 exhibits a higher range halo that demonstrates its superior ability to perform this work (Fig. 4).
  • both strains have the ability to solubilize K in vitro due to the color change in the medium (Fig. 5).
  • the RGM 2450 strain had the greatest effect on N 2 fixation, showing even better growth on modified Ashby medium.
  • AIA Phytohormone production capacity
  • strains RGM 2450, RGM 2529 to produce the phytohormone indoleacetic acid were determined.
  • the LB agar plate inoculated with a Bacillus strain was placed on top of the plate inoculated with the phytopathogenic fungus.
  • the joined plates were sealed with 4 turns of Parafilm paper.
  • PGI pathogen growth inhibition (%)
  • C Diametral growth of the pathogen (control)
  • T Diametral growth of the pathogen (treated).
  • the RGM 2450 strain caused a 45% inhibition by direct contact and a strong antibiosis effect of 41%. Meanwhile, the RGM 2529 strain showed an inhibition effect of 80% by direct contact and 52% when treated by antibiosis. No growth inhibition was exhibited by production of volatile compounds in any case (Table 6 and Figure 9).
  • Example 2 Preparation of formulations comprising the RGM 2450 and RGM 2529 strains with PGPR activity for different presentation and administration formats
  • the formulation of the present invention can be presented and administered as a formulation in prolonged release tablets, in wettable powders and as effervescent tablets.
  • the first formulation consisted of 28.6% wheat flour, 28.6% corn starch and 42.8% bacterial culture.
  • the third formulation consisted of 32.6% wheat flour, 32.6% corn starch, 32.8% bacterial culture, and 2% 13% gelatin (1X gelatin).
  • the starch was dry sterilized at 180°C for 30 min and the gelatin was resuspended in a 1:8 ratio.
  • the formulations were dosed in 0.62 g capsules with a diameter of 1.4 cm and a thickness of 0.6 cm. They were kept at 4°C for 16 h, then dehydrated at 40°C for 2 h.
  • the pellets were placed on 50 ⁇ L of water in Ashby, Pikovskaya and modified Pikovskaya culture media and incubated at 25°C for 14 days. Additionally, the bacteria present in the formulations were counted by maceration and resuspension of the formulation in 50 mL of sterile distilled water.
  • wettable powder formulation 17% potato starch was mixed with 14.6% silicon dioxide and 68.4% bacterial culture. 1g of the product was weighed and resuspended in 100 mL of sterile distilled water, 20 ⁇ L of the suspension in Ashby, Pikovskaya and modified Pikovskaya culture media and incubated at 30°C for 7 days. Additionally, the count of bacteria present in the formulations was performed.
  • citric acid was mixed with 66.6% bicarbonate and 3.4% of bacterial culture, and as the culture was added, it was homogenized by mixing the components.
  • the resulting mixture was placed in circular molds with a diameter of 35 mm and a depth of 0.5 mm, generating 6 tablets of 4.7 g. They were dissolved in 100 mL of sterile distilled water and 20 ⁇ L of this solution were deposited in Ashby, Pikovskaya and modified Pikovskaya culture media and incubated at 30°C for 7 days. Additionally, the count of bacteria present in the formulations was performed.
  • CFU colony-forming units
  • Viable cells (CFU/g of formulation) Strain RGM 2450 Strain RGM
  • the number of viable cells for the five different formulations was between 3.4*10 6 - 4*10 8 CFU/g and was equal to or greater than the number of viable cells present in the liquid product.
  • commercial Serenade® (1.4*10 7 CFU/g), which includes the QST 713 strain, previously used as a comparative control.
  • the formulations were also analyzed to evaluate that they possess the same characteristics previously evaluated for nitrogen fixation, and phosphorus and potassium solubilization.
  • the RGM 2450 bacterium Fig. 11
  • the effect on nitrogen fixation was not as easily noticeable in the case of the other formulations, so it cannot be confirmed that the strain maintains its abilities when incorporated into a wettable powder or effervescent tablet.
  • the RGM 2529 strain (Fig. 12) was able to grow in the case of extended-release tablets, mainly due to the effect of the formulation in the medium, rather than due to a particular biological activity of the bacteria. There was no effect on the solubilization of P or K. In the wettable powders and the effervescent tablet, the conditions exhibited were the same as those of the control, thus confirming that the solubilization capacity of the strain is maintained at least in these two formulations.
  • Example 3 Use of formulations comprising the RGM 2450 and RGM 2529 strains as plant biostimulants/bioprotectors.
  • a colony of the strain RGM 2450 and RGM 2529 was inoculated, each one separately in 5 mL of LB medium, to generate the pre-inocula of the respective cultures.
  • flasks with LB medium were inoculated with an aliquot of 1% pre-inoculum (ie 800 ⁇ L of pre-inoculum in 80 mL of culture). I know strains RGM 2450 and RGM 2529 grew for 20 h in LB medium at 30°C.
  • the concentration of viable cells of the resuspension of strain RGM 2450 and RGM 2529 in the isotonic NaCl solution was 4 .7 x 10 9 ( ⁇ 8 x 10 8 ) and 1.8 x 10 8 ( ⁇ 5 x 10 7 ) CFU/mL, respectively.
  • the cell concentration of the RGM 2529 strain is underestimated due to the formation of filamentous aggregates (Report 5), which prevent the exact number of cells present from being determined, for which the highest value of CFU/mL that could be obtained was used. batch.
  • the cell concentration used was based on the concentration of CFU/mL present in the commercial products registered in Chile as a biostimulant, TRIBAC BIO (1 x 10 9 CFU/mL, ANASAC company) and TIFI (2 x 10 8 CFU/mL). g, company In pact).
  • the described bacterial emulsion it was prepared in two phases. In the first phase, 5.33 mL of oil and 0.22 mL of Tween 20 were added to a tube. The tube was shaken for 1 minute in a vortex. In the second phase, 0.47 ml of glycerol, 3.75 ml of Silwet and 5 ml of the bacterial suspension from the previous treatment with a concentration 20 times higher were added and stirred for 1 minute in a vortex. The contents of both tubes were then mixed and shaken for 1 minute. An aliquot of the homogenized mixture was taken and resuspended in 9 ml of sterile distilled water to obtain the diluted bacterial emulsion.
  • the seeds that were treated with bacterial resuspensions were incubated with the bacterial cells for 45 min under gentle orbital shaking (100 rpm).
  • the seeds that were treated with the bacterial emulsion were soaked for 5 min in the diluted emulsion.
  • the seeds of the control treatment were treated with 0.9% NaCl.
  • the seeds of each treatment were sown in germination seedbeds containing a mixture of 1: 1 (v:v) autoclaved peat: vermiculite and incubated at 25°C ⁇ 2°C with a photoperiod of 16 h of light and 8 h of light.
  • Table 10 Percentage comparison of tomato seed growth parameters. The values are expressed as percentages (%) of difference between the plants treated with different formulations of RGM 2450 and/or RGM 2529 versus the control group (untreated).
  • Seedlings from seeds treated with bacterial resuspensions and emulsions after 21 days of growth showed a significant increase in wet and dry biomass with respect to the control treatment (Tables 9 and 10; Figures 13 and 14).
  • the wet biomass of the experimental treatments showed an increase between 19 to 103%, while the evaluation of the dry biomass indicated an increase between 19 to 63%.
  • Regarding the length of the shoot only the mixtures of the strains presented a significant increase, between 16 and 26%, the other treatments did not present significant differences with respect to the control.
  • the seedlings of the seeds inoculated with the experimental treatments showed a significant increase in root length, between 15 and 42% with respect to the control.
  • the treatments of mixtures of strains together with the resuspension treatment of the RGM 2529 strain presented significant differences with respect to the control.
  • siamensis RGM 2529 (10 6 CFU/mL), a mixture of both strains, commercial fungicide Serenade® (Bayer), and water.
  • 2 ⁇ L of Resuspension of B. cinerea spores (10 6 CFU/mL) were added. The inoculation was carried out on the hole that was made in the berry with the tip of a syringe.
  • Diameters are expressed as the mean lesion diameter, along with its standard deviation, for the results obtained from repeating the assay in quadruplicate.
  • the tests show a significantly greater inhibition in the growth of the phytopathogen by the strains RGM 2450 and RGM 2529, compared to the commercial product devoid of its co-formulants (only the bacterium Bacillus subitillis QST 713), reaching an inhibition percentage of 50%. % both when using each RGM strain separately, and when applying a mixture of both.
  • Example 4 Field test of the PGPR activity of the strains Bacillus safensis RGM 2450 and Bacillus siamensis RGM 2529: greenhouse tomato cultivation
  • the objective of this application example is to evaluate the effect of the inoculation of the strains Bacillus safensis RGM 2450 and Bacillus siamensis RGM 2529, separately and together, on productive parameters in tomato plants under greenhouse conditions.
  • the effect of formulations in the wettable powder, effervescent tablet and extended-release tablet formats of the RGM 2450 and RGM 2529 strains is evaluated.
  • the microbial concentrates obtained were harvested and stored at 4°C in 2L sterile pyrex bottles (Duranâ). The concentrates were sampled monthly for 5 months, maintaining their average viability in the order of 10 9 CFU/mL. These concentrates were used to inoculate seeds and prepare the different formulations: Prolonged Release Tablet (PLP), Effervescent Tablet (PE) and Wettable Powder (WP). In addition, the different formulations were used together at different concentrations of prolonged release fertilizers to determine the effect of bacteria on tomato crops.
  • PLP Prolonged Release Tablet
  • PE Effervescent Tablet
  • WP Wettable Powder
  • the different formulations were used together at different concentrations of prolonged release fertilizers to determine the effect of bacteria on tomato crops.
  • the seeds used in this trial were of the Roma VF (Vita ⁇ ) variety. Prior to inoculation, they were disinfected with 2% sodium hypochlorite for 3 min, and then washed 5 times with sterile distilled water to remove the disinfectant. All treatments were inoculated with bacteria from seed (except for the control). The bacteria were washed from the adjuvants that could exist in the culture medium in which they grew that could interact with the plant and give altered results due to the presence of nutrients.
  • the seeds were sown superficially in the substrate with a 2:1:1 composition of peat, perlite and compost, respectively, in seedbeds 110 mm deep and with a surface area of 5x5 cm in the greenhouse. Subsequently, the resulting seedlings were transplanted into 5L pots. The trial was carried out in a biosafety greenhouse of 8 x 9 m (width x length) with automatic irrigation and a controlled temperature of 25°C ⁇ 5.
  • the fertilizer Multicote Agri® (12m) from ANASAC was used. This was added and homogenized with the substrate (previously described). In addition, the fertilizer was added at different concentrations described in Table 12, to quantify the response (weight and caliber) of the fertilization-microorganism interaction.
  • Formulations of the product type wettable powder (WP), formulations for extended release tablets (PLP) and for effervescent tablet (EP) were prepared.
  • the PE and WP formulations were dissolved in water to be applied in no more than 10 mL per pot, equivalent to 10 8 CFU/plant (also for the commercial control).
  • the PLP was introduced into the substrate at the base of the plant, between the stem and the automatic irrigation dripper, and its concentration was also equivalent to 10 8 CFU/plant.
  • the applications of the formulations were made at 60 d from the start of cultivation.
  • Table 14 Table of treatments. The percentages correspond to the fertilizations of Multicote Agri in combination with the formulations (PLP, PE and WP) and the bacteria RGM 2529, RGM 2450 and their Mixture (1:1). 4.6 Plant management
  • Chlorophyll was measured by removing the first 3 true leaves below the apex of each plant. From these, a segment was removed from the center of the leaf, attached to the central vein, without counting the latter, until completing 80 mg of leaves according to the methodology proposed by Wellburn (1994).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • EMSIIRE® dimethyl sulfoxide
  • the sizes do not have a significant statistical difference between most of the treatments, differing only in some extreme treatments, p. Eg Witness vs Mix.
  • the average caliber is between 40 to 50 mm.
  • the parameter of cumulative weight of tomatoes per treatment presented significant statistical differences between most of the treatments until the seventh week of harvest.
  • the treatment that presented a response with difference Statistically significant with respect to all the other treatments was the WP Mixture of bacteria with 66% fertilization with a peak that exceeds 900 g, widely surpassing the control and commercial treatments (figure 16).
  • Bacillus safensis RGM 2450 and Bacillus siamensis RGM 2529 was sequenced, assembled and analyzed.
  • Table 15 shows the results obtained for B. safensis RGM 2450 regarding the antimicrobial compounds secreted by B. and potential target phytopathogens.
  • Table 16 describes the potential enzymes that it would secrete.
  • safensis RGM 2450 has the ability to produce antimicrobial compounds such as microcins.
  • RGM 2450 has the ability to produce the non-ribosomal peptide bacilibactica.
  • the DhbACEBF gene cluster was predicted (Fig. 19A), which participates in the synthesis and assembly of the bacilibactica siderophore together with the genes that participate in the transport (FeuABC-YusV) and in the hydrolysis of the siderophore for Fe+3 release (Fig 19B).
  • Bacillibactin has been previously recognized for its inhibitory activity against the fungus F. oxysporum f. sp. Capsica (table 15).
  • ribosomal peptide synthetase is encoded by 5 genes, of which gene 1 (10,707 bp) encodes a multimodular protein that would participate in the synthesis of a 3-amino acid peptide (leucine-leucine-glutamine), the gene 2 (10,701 bp) encodes the synthesis of a second module that participates in the synthesis of a peptide of three amino acids (leucine-aspartic acid-X (could not be predicted)), gene 3 participates in the addition of the amino acid isoleucine, gene 4 has two modules that would allow the addition of the amino acid valine and a molecule of acetyl CoA, which could participate in the delation of the peptide. Gene 5 presents two modules that participate in the addition of another amino acid (X) and a fatty acid (Fig. 20B and 20C), antecedents that suggest that the potential structure that could be formed is a cyclolipopeptide
  • B. safensis RGM 2450 can potentially secrete various enzymes such as proteases, metalloproteases, lipases, among others (table 16).
  • Table 15 Compounds secreted by B. safensis RGM 2450 and potential target phytopathogens. Table 16. Potential enzymes secreted by B. safensis RGM 2450.
  • B. siamensis RGM 2529 would secrete bacteriocins such as amylocyclin.
  • bacteriocin antimicrobial peptide
  • FIG. 23A The acnABCDEF gene cluster encoding aminocycline has been found in strains of the species Bacillus amylol ⁇ quefac ⁇ ens and B. velezensis that have been widely described for their PGPR activity (FIG. 23B).
  • Amylocyclin has been reported in the literature to have antibacterial activity against Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, B. pumilus, Bacillus sphaericus, B. subtilis, Clavibacter michiganensis, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans, and Paenibacillus polymyxa (Table 17).
  • B. siamensis RGM 2529 presents the DhbACEBF gene cluster that participates in the synthesis of bacilibactin (FIG. 24), a siderophore with antifungal activity against F. oxysporum f. sp. capsica (table 17). It also shows the 4 genes (surfAA, surfAB, surfAC and surfAD) that participate in the biosynthesis and assembly of the amino acids that make up surfactin (figure 25A). According to gene cluster analysis of surfactin in strains phylogenetically close to the RGM 2529 strain (figure 25B), when comparing the surfAB homologue of B.
  • the surfAC gene encodes a ribosomal peptide synthetase consisting of 1 modules that participate in leucine assembly. Comparing the surfAC homolog of B. amyloliquefaciens ZB42 with that of RGM 2529, 94.95% identity and 100% coverage are obtained. Finally, the surfAD gene encodes a thioesterase. When comparing the surfAD homologue of B. velezensis ZB42 with that of RGM 2529, 95.36% identity and 100% coverage are obtained.
  • fengycin a compound previously described as antifungal, a 49,465 bp gene cluster was also predicted to participate in the synthesis of this lipopeptide.
  • This gene cluster is made up of 5 genes (fenA, fenB, fenC, fenD and fenF) that code for non-ribosomal peptide synthetases that assemble this cyclolipopeptide together with other genes that participate in its structural modification (FIG. 25A).
  • This gene cluster has been found in strains belonging to the species B. amyloliquefaciens, B. velezensis and B. siamensis (FIG. 25B).
  • FIG. 27A Adjacent to the gene cluster that participates in the synthesis of fengycin, the bamABCD operon that participates in the synthesis of another lipopeptide bacilomycin D was found (FIG. 27A). This operon spans 37,696 bp and has been described in the species B. amyloliquefaciens, B. velezensis and B. siamensis (Fig 27B).
  • bacillomycin D can kill fungi of different genera and species, including Alternaria alternata, Alternaria solani, Botrytis cinerea, Aspergillus flavus, Botryosphaerica ribis, C. albicans, Cryphonectria parasitica, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloesporioides, Didymella bryoniae, Fusarium graminearum , Fusarium sambucinum, Fusarium oxysporum, Podosphaera fusca, Pythium sulcatum, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, R.
  • a 72,346 bp gene cluster was also predicted (Fig. 28A) encoding a hybrid between a polyketide synthase and a non-ribosomal peptide synthetase (PKS-NRPS) that is involved in the production of the antibiotic bacillaene, an inhibitor of prokaryotic protein synthesis.
  • PKS-NRPS non-ribosomal peptide synthetase
  • the bacillano synthase of strain RGM 2529 is composed of 13 PKS modules and 3 NRPS modules like those described in velezensis FZB42 and Bacillus subtilis 168 (FIG. 28B).
  • B. siamensis RGM 2529 can potentially produce the antibacterial and antifungal compound bacillaene, for which it has been reported to have potential action against bacteria such as B. thuringiensis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, M. xanthus, P. vulgaris, Serraria marcescens, S. aureusy).
  • bacteria such as B. thuringiensis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, M. xanthus, P. vulgaris, Serraria marcescens, S. aureusy.
  • fungi it has been described that bacillaene has inhibitory activity against Coriolopsis spp. Fusarium sp, Pseudoxylaria sp., Trichoderma sp., Umbelopsis sp (table 17).
  • B. siamensis RGM 2529 would also be capable of secreting enzymes of the protease, lipase, lactonase and cellulase type (table 18).
  • KSA Potassium solubilizing bacteria

Abstract

Se provee una formulación agrícola para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas que comprende al menos una cepa bacteriana B. safensis depósito RGM 2450, y/o una cepa bacteriana B. siamensis depósito RGM 2529 y excipientes de uso 5 agrícola. La composición sirve como bioprotector y/o biocontrolador de cultivos. Se provee además un método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas.

Description

FORMULACION AGRICOLA QUE COMPRENDE AL MENOS UNA CEPA BACTERIANA B. SAFENSIS RGM 2450, Y/O UNA CEPA BACTERIANA B.
SIAMENSIS RGM 2529 Y EXCIPIENTES AGRÍCOLAS; USO DE LA FORMULACIÓN Y MÉTODO PARA PROMOVER EL CRECIMIENTO Y/O AUMENTAR EL RENDIMIENTO DE CULTIVOS Y/O PROTEGERLOS CONTRA ENFERMEDADES Y PLAGAS.
Campo de la invención
La presente invención está dirigida a formulaciones de uso agrícola que contienen bacterias o mezclas de estas, las cuales presentan características de potenciador de crecimiento de cultivos y de control biológico de plagas. La presente invención se enfoca en el área de la biotecnología, particularmente en el desarrollo de productos agrícolas que potencien el crecimiento de los cultivos y eviten y controlen la infección por patógenos en cultivos mediante el uso de formulaciones que contienen una o una mezcla de bacterias con estas características.
Descripción del estado de la técnica
La producción agrícola requiere de medidas sustentables que permitan la reducción y el buen uso del agua, los fertilizantes y los pesticidas, pero que también permitan mantener la calidad del suelo, fortalecer el crecimiento de cultivos y evitar plagas, estas últimas las causantes de grandes pérdidas económicas. Los insumos para la agroindustria a base de microorganismos benéficos han ¡do apareciendo como respuesta a la demanda de mercados mundiales por alimentos de alta calidad, producidos en forma amigable con el medio ambiente, trazables e inocuos (Altier et al. , 2012).
Los productos para la agroindustria de origen biológico son formulados con microorganismos (por ejemplo, bacterias, hongos, virus) o con compuestos activos derivados de microorganismos o de plantas. Todos estos productos se enfocan en mejorar la productividad, calidad, salud de las plantas y características biológicas de los suelos (Altier et al., 2012). En el caso de productos que contienen microorganismos, estos son seleccionados por su capacidad de promover el crecimiento vegetal de forma directa facilitando la absorción de nutrientes por la planta (biofertilizantes) o de forma indirecta contribuyendo al manejo sanitario de enfermedades por plagas de impacto económico (Biocontroladores). Cabe mencionar que muchas de estas cepas que son utilizadas con estos fines pueden presentar características de fertilizantes y/o de biocontroladores (Altier et al., 2012)
Los microorganismos que colaboran en el crecimiento de las plantas son denominados como PGPR, por sus siglas en inglés (Plant Growth Promoting Rhizobacteria). El suelo es un ecosistema que presenta una variedad de microorganismos beneficiosos. La fracción de suelo que presenta este tipo de microorganismos se encuentra donde existe la mayor presencia de raíces (rizosfera) (Chollo et al., 2012). En la rizosfera pueden convivir consorcios bacterianos promotores del crecimiento vegetal de forma directa e indirecta (Mayak et al. 1999), colonizan las raíces o su entorno más cercano y favorecen el crecimiento de las plantas empleando mecanismos de fijación de nitrógeno atmosférico, la solubilización de fosfatos insolubles, secreción de hormonas y enzimas (Glick et al., 1994; Chollo et al., 2012). Estas bacterias pueden clasificarse en tres grupos principales a) aquellas que colonizan el tejido de la planta y forman nodulos (simbióticas), b) aquellas que se hospedan en estructuras internas de la planta (endofiticas), y c) aquellas que se encuentran cerca del sistema radicular de la planta (Chollo et al., 2012).
Múltiples estudios han publicado que las PGPR se asocian con cultivos importantes tales como Oryiza sativa, Triticum spp., Sorghum spp, Sacharum officinarum, Zea mays y pasturas Dentro de las PGPR más referenciadas son Azospirillum sp., Bacillus sp., Rhizobium sp., Burkholderia sp., Enterobacter sp., Azotobacter sp., Erwinia sp., Herbaspirillum sp., Klebsiella sp., Pseudomonas sp. yXanthomonas sp. (Chollo et al., 2012).
Dentro de las bacterias PGPR mencionadas en el párrafo anterior se encuentran aquellas pertenecientes al género Bacillus. Estas bacterias gram positivo son ubicuas, es decir pueden habitar en diferentes nichos ecológicos, incluyendo el suelo (Pignatelli et al., 2009). Las bacterias del género Bacillus que habitan en los suelos pueden tener características de PGPR. Por ejemplo, estas bacterias tienen la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (N2). Enzimas del tipo nitrogenasa pertenecientes a esta bacteria reducen el N2 a amoniaco (NH3), este último es absorbido por la planta. Ademas, estas bacterias juegan un rol importante en la solubilización de fosfatos (P) para que este compuesto pueda estar disponible para las plantas, para ello, las bacterias utilizan enzimas como a fosfatasa, fitasa, hidrolasas entre otras (Hayat et al., 2010). Con respecto a la solubilización de componentes realizado por estas bacterias, también se presenta la solubilización de potasio (K). Este compuesto es necesario para la activación de diversas enzimas de las plantas y animales que tienen como fin participar en el metabolismo energético, como la síntesis de almidón, reducción de nitratos, degradación de azúcares y una de las funcionas más importantes, la fotosíntesis (Etesami et al., 2017)
Además de las características de las bacterias de género Bacillus en la fijación y solubilización de compuestos que favorecen el crecimiento de las plantas, también se presenta la secreción de compuestos con actividad antimicrobiana. Estos compuestos antimicrobianos, son secretados por las bacterias que actúan como antagonistas frente a otras especies patógenas. Estos compuestos son moléculas, particularmente péptidos y polipéptidos de síntesis no ribosomal compuestos por poliquétidos, bacteriocinas y sideróforos, así como compuestos volátiles. En general poseen un amplio espectro de acción (bacterias, hongos) y las cepas de Bacillus presentan una capacidad de control biológico predominante mediante la secreción de estas moléculas, inhibiendo el crecimiento de patógenos en las plantas.
- Bacillus safensis
Descrita como un promotor de crecimiento vegetal y agente de control patógeno, Bacillus safensis es una especie que tiene la capacidad de endofitar y de habitar la rizosfera de las plantas, lo que promueve el crecimiento de estas. Para potenciar el crecimiento de las plantas, B. safensis solubiliza el fosfato (P) del suelo y producción de sideróforo, ácido indol-3-acético y 1-am¡noc¡clopropano-1- carboxilato deaminasa (Yadav et al. 2011 ; Chakraborty et al. 2013; Kavamura et al. 2013). Además, se ha reportado que esta bacteria puede actuar como biocontrolador, presentando efectos antimicóticos, antibacterianos y antivirales en diversos cultivos de manera individual o en compañía de otras bacterias (Sun et al. 2014). - Bacillus siamensis.
Esta bacteria del género Bacillus fue aislada en el año 2010 desde un cangrejo tailandés, denominando a esta cepa como B. siamensis KCTC 13613. Se ha observado que esta cepa tiene la capacidad de inhibir significativamente el crecimiento del micelio de los hongos patógenos de plantas Rhizoctonia solani y Botrytis cinérea, además de presentar actividad antimicrobiana sobre la bacteria gram positiva Micrococcus luteus (Jeong et al., 2012). Por otro lado, se ha observado que B. siamensis puede incrementar significativamente el crecimiento de plántulas de Arabidopsis thaliana sin contacto físico con las plántulas, lo que sugiere que las sustancias volátiles producidas por estas bacterias podrían promover el crecimiento de las plantas (Jeong et al., 2012).
Diversos documentos pertenecientes al estado de la técnica, han publicado las cualidades de los microorganismos, como las bacterias, para potenciar el crecimiento de plantas y para actuar como controladores biológicos sobre otros patógenos que afecten a las plantas. Por ejemplo, en el documento de Haeyoung y colaboradores, publicado en el año 2012, describe una nueva especie de bacteria halófila, perteneciente el género Bacillus, la cual es capaz de producir compuestos antimicrobianos contra patógenos de plantas (particularmente hongos como Rhizoctonia solani y Botrytis cinérea) y promover el crecimiento de estas por emisión de compuestos volátiles. El documento científico publicado por Wu y colaboradores en el año 2015, presenta una revisión de formulaciones de biocontrol que son generadas a partir de bacterias promotoras del crecimiento vegetal, los cuales han demostrado ser una alternativa para el control de patógenos en los cultivos, además de potenciar el crecimiento de la planta.
Se ha descrito que las bacterias del género Bacillus, presentan características que les permiten convivir con las plantas, particularmente en la rizosfera y promover el crecimiento de las plantas. También, se ha descrito que las bacterias del género Bacillus producen compuestos antimicrobianos para que puedan controlar el crecimiento de otros patógenos en plantas. Estas características han sido descritas en documentos como el presentado por Borris R, en el año 2011.
Con respecto a la invención, los documentos Agbaje y colaboradores (2015) y Haeyoung y colaboradores (2012), han descrito las características de B. siamensis y B. safaensis en la promoción del crecimiento de las plantas como el antagonismo de estas en el crecimiento de patógenos.
Con respecto a la invención, se presentan documentos de patente que revelan el uso de microorganismos del género Bacillus, particulamente, B. siamensis y B safensis como agentes potenciadores del crecimiento en plantas y biocontroladores. Tal es el caso de los documentos de patente CN 109468243 y KR 1020190061210, los cuales presentan el uso de B siamensis, particularmente, en el primer documento se divulga el uso de B. siamensis como un agente biocontrolador ya que presenta un antagonismo significativo contra patógenos, en el caso particular de este documento, se presenta la inhibición del crecimiento de que producen la pudrición de tallos y manchas en hojas. Mientras que en el segundo documento se divulga el uso de esta bacteria ya que presenta características de reducción de nitrógeno, por lo que se indica que puede utilizarse para potenciar el crecimiento de plantas o para el tratamiento de aguas.
Los documentos CN109456915 y CN108330092 divulgan el uso de la bacteria B. safensis, como agente potenciador del crecimiento de plantas. En estos documentos se describen las características de esta bacteria como la degradación de fósforo (P) en el suelo. Por otro lado, los documentos KR1020140079201 , CN108865934, CN108330092, CN106119146 describen la utilización de esta bacteria y/o sus cultivos como antagonistas para el crecimiento de patógenos de plantas, como B. cinérea
Descripción detallada de la invención
La presente invención corresponde a una formulación agrícola, la cual se compone de una o dos cepas bacterias que presentan características promotoras del crecimiento en plantas (PGPR) y características de bioprotector y biocontrolador. La formulación puede comprender las bacterias de forma individual o una mezcla de las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529. Ambas bacterias son definidas de acuerdo a su número de registro o depósito en el banco microbiano IDA en las fuentes microbianas genéticas chilenas en I NIA, Quilamapu, Chile. Las bacterias de la presente invención son utilizadas mediante una formulación y tienen como característica una función bioestimulante, bioprotectora y biocontroladora.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un biofertilizante que mejora el rendimiento de los cultivos, que comprende a la mezcla de bacterias promotoras del crecimiento en plantas y excipientes agrícolamente aceptables.
Otro aspecto de la presente invención protege dos procesos que optimizan los cultivos agrícolas. En primera instancia, la presente invención protege el bienestar de las plantas. En este sentido, la presente invención tiene como objetivo el aumentar la disponibilidad de elementos que son considerados nutrientes para las plantas, como el nitrógeno (N2), el potasio (K) y el fósforo (P), potenciando su crecimiento. En la presente invención, el aumento de la disponibilidad de nutrientes para las plantas se genera mediante el uso de bacterias presentes de forma natural en el suelo, que presentan la capacidad de solubilizar estos compuestos (K y P) y la fijación de nitrógeno (N2).
En segundo lugar, en la presente invención se protege la seguridad de los cultivos mediante la protección contra agentes patógenos. En la presente invención, esta protección está dada ya que las bacterias utilizadas tienen la capacidad de liberar sustancias o moléculas que son perjudiciales para los organismos patógenos. Considerando ambas características (potenciamiento del crecimiento de plantas y protección a patógenos), es que en la presente invención logra aprovechar los mecanismos biológicos de estas bacterias y por consecuencia, reducir o eliminar por completo la aplicación de agroquímicos o fertilizantes necesarios en el suelo, reduciendo el impacto ambiental y humano. De forma particular, las bacterias Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529 producirían compuestos antimicrobianos contra un amplio espectro de bacterias y hongos. En el caso de B. siamensis RGM 2529 se ha demostrado que esta cepa produciría potencialmente compuestos antimicrobianos con efecto antibacteriano sobre S. aureus ATCC 25923, M. luteus CMCC 28001, B. pumilus CMCC 63202, B. cereus ATCC 14579, B. subtilis ATCC 168, Listeria monocytogenes CICC 21662, Enterococcus faecalis ATCC 29212 y P. fluorescens ATCC 49642, B. thuringiensis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, M. xanthus, P. vulgaris, Serratia marcescens, S. aureus, L. pneumophila, L. monocytogenes , P. syringae , R. solanacearum , Xanthomonas axonopodis pv. Glycines, Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, B. pumilus, Bacillus sphaericus, B. subtilis, Clavibacter michiganensis, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans, Paenibacillus polymyxa. En cuanto a hongos, se incluyen en el alcance del efecto bioprotector de la formulación, Coriolopsis spp. Fusarium sp, Pseudoxylaria sp., Tríchoderma sp., Umbelopsis sp., F. oxysporum f. sp. Capsica, A. niger, B. cinérea, F. solani, Monilia fructigena, Pennicilium expansum, P. italicum, R. solani, Alternaría alternata, A. solani, Aspergillus flavus Botryosphaerica ribis , C. albicans, Cryphonectria parasitica, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloesporioides, Didymella bryoniae, F. graminearum, F. oxysporum, Ustilago maydis , Monilinia fructicola, Penicillium expansum, Phomopsis gossypii, Phytophthora capsici, Pyricularia grísea, R. solani, Sclerotium rolfsii, S. sclerotiorum, Alternaría solani, Botrytis cinérea, Fusarium graminearum , Fusarium sambucinum , Fusarium oxysporum , Podosphaera fusca , Pythium sulcatum , Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizopus sp., Sclerotinia sclerotiorum.
B. safensis RGM 2450 produciría compuestos antimicrobianos contra Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum, Erwinia amylovora, Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, B. subtilis, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans. También, podría tener un efecto antifúngico sobre hongos tales como Candida albicans, Microcystis aeruginosa, Phytophthora infestans, S. cerevisiae, Aspergillus fumigatus, Candida albicans y F. oxysporum f. sp. Capsica.
Ambas cepas pueden además secretar enzimas como proteasas, serinproteasas, entre otras, para las cuales se ha descrito su efecto antibacteriano y antifúngico. Por tanto, como parte del alcance de la invención, se incluye el efecto bioprotector de las cepas de forma independiente y en conjunto en la formulación contra una gran variedad de hongos y bacterias fitopatógenas.
En un tercer aspecto, la formulación y las bacterias descritas presentan un efecto biocontrolador de fitopatógenos, es decir, tiene por función disminuir el crecimiento de la población de patógenos, en este caso en cultivos y plantas. Se demuestra que las bacterias y la formulación tienen efecto antibacteriano contra Fusarum sp., Phytophthora sp., Collectotrichum sp. y Botrytis sp.
Los resultados obtenidos evaluados en Fusarum sp., permiten señalar que las cepas RGM 2450 y RGM 2529 causaron una inhibición en el crecimiento de 24% y 4% por contacto directo, y 53% y 41 % por ensayo de antibiosis, respectivamente. Por otro lado, la cepa RGM 2450 causó una inhibición del 45% y antibiosis de 41 % al estar en contacto directo con Phytophthora sp., y la cepa RGM 2529 presento una inhibición del 80% y 52% de antibiosis. Tanto para Fusarum sp. y Phytophthora sp. Amabas bacterias inhiben la producción de compuestos volátiles.
En el caso de Collectotrichum sp., la cepa RGM 2450 inhibió un 43% y un 53% para los ensayos de contacto directo y antibiosis, respectivamente; para RGM 2529 se observó una disminución en el halo de crecimiento del patógeno de un 78% por contacto directo, y de un 70% por antibiosis.
Para Botrytis, los ensayos demuestran que las cepas RGM 2450 y RGM 2529 inhiben el crecimiento de este fitopatógeno de forma significativamente mayor que el producto comercial de referencia desprovisto de sus coformulantes (bacteria Bacillus subitillis QST 713), alcanzando un porcentaje de inhibición del 50% tanto al emplear cada cepa RGM por separado, como al hacerlo aplicando la mezcla de ambas.
En otro aspecto de la invención, la mezcla de cepas bacterianas se combina para obtener un biofertilizante en conformidad con los principios de la presente invención, en donde las cepas bacterianas se encuentran en concentraciones preferidas 3,0x106 - 4,0x109 UFC/g (RGM 2529) y 5,0x106 - 4x109 UFC/g (RGM 2450).
Otro aspecto de la invención se refiere a un biofertilizante que comprende a la mezcla de bacterias y un excipiente agrícolamente aceptable que tienen por función potenciar el crecimiento de las plantas de cultivo.
En otro aspecto de la invención, el excipiente de uso agrícola y/o agrícolamente aceptable comprende el uso, pero sin limitarse de harina de trigo, fécula de maíz, gelatina, almidón de papa, dioxido de silicio, acido cítrico, bicarbonato, polisorbatos como Tweens, lactosa, lecitina de soya, caseína, carboximetil celulosa o goma de celulosa, esteres de sacarosa, manitol, sorbitanos, F68 plurónico, alginato, goma xantan, PEG (polietilenglicol), sirope de maíz, huevo, leche, glicerol, fructosa, pectinas, aceite mineral, goma de ester, triglicéridos de cadena larga.
En otro aspecto de la invención, un biocontrolador comprende un organismo que inhibe el crecimiento de otro, éste último siendo un organismo patógeno. En un aspecto particular de la invención, el biocontrolador comprende la mezcla de las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529.
En otro aspecto de la invención, el biofertilizante/biocontrolador de la presente invención puede tener como portador un suelo pre-empacado, un recubridor de semillas, un polvo, un granulado, un nebulizador, una suspensión o un líquido o cualquiera de las vahantes expuestas encapsuladas.
Es parte del alcance particular de la invención que las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529 forman parte de una formulación que puede administrarse como una pastilla de liberación prolongada, un sólido en polvo mojable, como pastilla efervescente, como una resuspensión, emulsión bacteriana o mezclas de estos. Es parte del alcance de la invención la administración de la formulación en conjunto con fertilizantes. Se prefiere, su administración con porcentajes de 0, 33, 66 y 100% de fertilizante.
Las diferentes formas de presentación de la formulación pueden ser administradas a la semilla o en la base del tallo. En el caso de semillas, éstas se impregnan con tampón PBS o similar y se sumergen por completo en la formulación, prefiriéndose una concentración de 109 UFC/mL de bacterias. Para la aplicación en la base del tallo de las plantas se prefiere una concentración de 108 UFC/mL.
La formulación biofertilizante/biocontrolador es efectiva tanto para plantas que se emplean en el área de la agricultura, así como para la obtención de alimentos de animales y humanos, por ejemplo, frutas y verduras, como para plantas que pueden ser cultivadas con el objetivo simplemente de ser ornamentales. La formulación parte de la presente invención se encuentra enfocado al uso de este en agrocultivos, los cuales pueden comprender, sin limitarse a las especies de tomate (Solanum lycopersicum), banano (Musa paradisiaca), caña de azúcar (Saccharum officinarum), pimientos (Capsicum annuum), papaya (Carica papaya), maíz (Zea mays), sandía (Citrullus lanatus), melones (Cucumis meló), aguacate (Persea americana), café (Coffea arabica), Arvejas (Pisum sativum), frijoles (Phaseolus vulgaris), cañamo (Cannabis sativa), Trigo (Triticum spp), arroz (Oryza sativa), piña (Ananas comosus), Vides (Vitis vinifera), cerezos (Prunus cerasus), manzana (Malus domestica), frutilla (Fragaria ananassa), lechuga (Lactuca sativa), entre otros cultivos.
La formulación agrícola descrita en la presente invención tiene un método de acción, el cual se encuentra dirigido a las plantas de cultivo y a patógenos que afectan a esta, por lo que el contacto directo de este producto con humanos no podría causar ningún daño. Por otro lado, el producto biológico de la presente invención permite una reducción de los gases de efecto invernadero ya que disminuye el uso de agroquímicos tradicionales, representando una alternativa para el reemplazo de estos últimos y permite el cumplimiento de las normas ambientales como las que se establecen en la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE).
Es también parte del alcance de la invención, método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas por medio de la administración o aplicación de una cantidad efectiva de la formulación descrita. El método incluye la administración de la formulación agrícola en forma de resuspensión, emulsión, pastilla efervescente, pastilla de liberación prolongada o polvos mojables.
Como parte del método descrito para mejorar el bienestar de las plantas y protegerlas contra enfermedades, la formulación puede ser aplicada por asperjación o inmersión directa de la semilla del cultivo de interés y/o aplicándola en la base del tallo de las plantas. En el caso de la inmersión de semilla, se prefiere una concentración de 109 UFC/mL de bacterias. Cuando su aplicación se realiza en la base del tallo de las plantas se prefiere una concentración de 108 UFC/mL de bacterias. Los inventores han demostrado que, mediante el método descrito, cuando se aplica la formulación en tomates, se aumenta su capacidad productiva al usar la mezcla de bacterias empleando un 66% de fertilización convencional complementaria. Particularmente, se observó un aumento significativo en el parámetro de peso acumulativo de tomates, superando ampliamente a los tratamientos testigos y la cepa comercial. Respecto del parámetro de concentración de clorofila, en la séptima semana se observaron diferencias significativas para los tratamientos respecto de control. El tratamiento que presentó mejor efecto fue la mezcla de bacterias en presentación de pastilla de liberación prolongada con un 100% de fertilización complementaria, superando los 250 μg/mL de clorofila. La presente invención describe una formulación y método que permiten el aumento de la capacidad de crecimiento de las plantas y de la obtención de mejores cosechas.
Definiciones
Los términos presentados en este documento tienen el mismo significado que se utiliza de forma habitual en el estado de la técnica, a menos que se indique lo contrario. Los términos utilizados en este documento se presentan a continuación:
El término “comprender” (“comprende”, “que comprende”) y las variaciones del mismo, utilizado en la descripción de esta invención, tanto en la memoria descriptiva como en el pliego de reivindicaciones, se deben interpretar en sentido abierto e inclusivo, es decir como “incluyendo, pero no limitando a”.
Cuando se emplea el término “obtenido de”, se hace referencia a que muestra es aislada o derivada de una fuente en particular. De igual forma el término “derivado de”, hace referencia a la fuente de donde proviene la muestra.
Cuando se presenta el término “una realización”, se indica una característica o estructura particular que ha sido descrita en relación con la realización de la invención, en donde se incluye al menos una realización presente en esta, las cuales no necesariamente corresponden a una misma realización o pueden ser combinadas entre ellas.
Cuando se utiliza el término “consistente en”, se indica la enumeración de elementos dentro de una frase, los cuales son obligatorios y no pueden estar presentes en otros elementos. El termino “que consiste esencialmente en” es utilizado para cualquier elemento enumerado después de la frase, este término limita a otros elementos que no interfieren con la actividad o acción específica de la invención.
En otras realizaciones de la invención, el término “método” hace referencia un proceso que permite realizar una tarea u obtener un resultado de un objetivo dado. El término “método preventivo” hace referencia a un proceso o conjunto de estos que permite realizar una tarea u objetivo con el fin de prevenir un hecho futuro. El término “método de tratamiento” comprende al proceso o conjunto de estos que se utilizan para aliviar o curar una enfermedad.
En otras realizaciones de la invención, cuando se hace mención del termino “bienestar” o “bienestar de la planta”, se hacer referencia al estado de la planta en la cual su metabolismo esta funcionando de manera óptima. Por otro lado, cuando se refiere a “capacidad de producción” o “capacidad productiva” se indica como la máxima obtención de bienes, en este caso, sería la máxima obtención de plantas en crecimiento, la máxima capacidad de obtener cosecha, etc. En el caso de “aumento en la capacidad productiva” se hacer referencia al aumento significativo en la cantidad de plantas, o un aumento en la obtención de cosecha o aumento en el crecimiento de las plantas.
Se entiende por “control biológico” a un método para el control de plagas, enfermedades y/o malezas que tiene como finalidad el uso de organismos vivos para el control de crecimiento de otras poblaciones de organismos vivos.
El término “Biocontrolador” se hace referencia a productos de origen no sintético que son utilizados para el control de plagas en cultivos.
Cuando en el documento de hace referencia al termino “bioestimulante” se indica como una sustancia o mezcla de sustancias con o sin microorganismos que puede ser aplicado sobre plantas de cultivo, semillas o raíces. Estas sustancias o mezclas tienen la característica de mejorar aspectos de la planta como la obtención de mejores cosechas, por medio de la estimulación de los procesos biológicos, mejoras en la disponibilidad de nutrientes, mejoras en la absorción de nutrientes, tolerancia al estrés, etc. Al hacer referencia al termino bioprotector , se describe a todo producto o dispositivo que tiene por función proteger las características y funciones de los seres vivos de las agresiones externas a las que pueden estar sometidas. Ejemplo de esto en las plantas, es cuando estas se encuentran sometidas a estrés abiótico.
Cuando se hace referencia a “Organismos para el control biológico”, se refiere a microorganismos que presentan la capacidad de inhibir el crecimiento de otro microorganismo y que son utilizados para el control de plagas o enfermedades.
Cuando se presenta el término “Biofertilizante”, este término hace referencia a un insumo agrícola formulado por lo menos de una bacteria promotora del crecimiento que mejora el rendimiento de los cultivos cuando es aplicado al mismo.
El término “PGPR” corresponde a la abreviación en inglés de “plant growth promoting rhizobacteria” (Rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas) y hace referencia a bacterias presentes en la rizosfera las cuales colonizan el sistema radicular de las plantas o su entorno más cercano y potencian el crecimiento de ésta. Cuando se hace referencia al término “Rizobacterias” corresponde a aquellas bacterias presentes en la rizosfera. Cuando se señala que una bacteria tiene actividad PGPR significa que dicha bacteria es capaz de colonizan el sistema radicular de las plantas o su entorno más cercano y potencian el crecimiento de ésta.
Cuando se presenta el término “excipiente”, se hace referencia a toda aquella sustancia que puede ser utilizada sin afectar al principio activo. Cuando se refiere a “excipiente agrícolamente aceptable” se hace referencia a toda aquella sustancia utilizada para generar, producir o fabricar un producto de uso agrícola que contenga un principio activo.
Cuando se hace referencia al término “pastilla” o “tableta”, se indica como una pieza pequeña consistente de un material o ingrediente moldeable, que puede tener diversos tamaños, formas y usos. En otras realizaciones de la invención el término “Pastilla efervescente” hace referencia a una pastilla que dentro de su composición contienen generalmente sustancias ácidas y carbonates o bicarbonatos, que reaccionan rápidamente en presencia de agua con liberación de dioxido de carbono. En otras realizaciones de la invención el termino “pastilla de liberación prolongada” hace referencia a una pastilla que presenta características que permiten la liberación del principio activo de una formulación de una forma lenta, lo que permite extender el efecto de principio activo entre dosis.
En otras realizaciones de la invención, el término “polvo mojable” hace referencia a aquellas sustancias (principios activos y/o excipientes) presentes en una formulación que al mezclarse con agua antes de su aplicación, forman una suspensión.
En otras realizaciones de la invención, el término “resuspensión” hace referencia a la incorporación de material o sustancia la cual se suspende en líquido cuando esta se encuentra como precipitado o como material o sustancia seca.
En otras realizaciones de la invención, el término “emulsión” hace referencia a un líquido de aspecto lechoso que contiene en suspensión pequeñas partículas o gotas de otra sustancia insolubles.
Descripción de las figuras de la invención
Figura 1. Árbol filogenético en base al gen 16S rDNA. Se empleó el método de Neighbor-joining y el modelo K-2 parámetros para determinar la relación filogenética entre el aislado Bacillus sp. con otras especies de Bacillus. Se utilizó como grupo externo Micrococcus luteus DSM 20030T. Los valores de Bootstrap (expresados como porcentajes de 1000 repeticiones) mayores 50% se muestran en los nodos. La barra indica 2 sustituciones por cada 100 nucleótidos. Se destaca los aislados RGM 2450 y RGM 2529 con un círculo negro. Al lado izquierdo de cada cepa tipo (T) se indica el número de acceso para la base de datos de NCBI.
Figura 2. Árbol filogenético en base al análisis de pyrE de la cepa RGM 2450 sp. y de especies tipos relacionadas. Para los análisis marcadores genéticos pyrE. Se empleó el método de Maximum Likelihood y el modelo Tamura-Nei para determinar la relación filogenética entre el aislado RGM 2450 con las cepas tipos de las especies B. safensis, B. pumilus y B. altitudinis. Se utilizó como grupo externo a la cepa B. cereus ATCC 1479T. Los valores de Bootstrap (expresados como porcentajes de 1000 repeticiones) se muestran en los nodos. La barra indica 5 sustituciones por cada 100 nucleotidos. Se destaca la cepa RGM 2450 con un círculo negro.
Figura 3. Árbol filogenético en base al análisis de gyrB de la cepa RGM 2529 y de especies tipos relacionadas. Se empleó el método de Maximum Likelihood y el modelo Tamura-3-parámetros para determinar la relación filogenética entre la cepa RGM 2529 con las cepas tipos. Se utilizó como grupo externo a B. cereus ATCC 14579. Los valores de Bootstrap (expresados como porcentajes de 1000 repeticiones) se muestran en los nodos. La barra indica 5 sustituciones por cada 100 nucleotidos.
Figura 4. Evaluación de la fijación de Nitrógeno (N2) y solubilización de Fósforo (P) de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713. Se cultivó a las distintas cepas bacterianas en medio Ashby para analizar la fijación de N2, mientras que para evaluar la solubilización de P se aplicó el ensayo en medio Pikovskaya modificado. El brillo de las fotografías fue ajustado en un 60% respecto de la toma original. El control negativo no se muestra en la figura; A) indica ensayos de fijación de nitrógeno, B) indica ensayos de solubilización de Fósforo, mientras que 1) representa los ensayos en la cepa RGM 2450, 2) ensayos sobre cepa RGM 2529 y 3) ensayos con un producto comercial.
Figura 5. Evaluación de la solubilización de Potasio (K) de las cepas RGM 2450, RGM 2529 en comparación con la cepa comercial QST 713. Todas las cepas fueron cultivadas en medio Pikovskaya modificado. A) Placa control sin bacteria; B) Placa cultivada con cepa RGM 2450; C) Placa cultivada con cepa RGM 2529; D) Placa cultivada con cepa de producto comercial QST 713. El brillo de las fotografías fue ajustado en un 60% respecto de la toma original.
Figura 6. Fijación de Nitrógeno para las cepas RGM 2450, RGM 2529 y QST 713 en medio Ashby modificado (sin Nitrógeno). Las cepas fueron cultivadas en un medio Ashby en ausencia de fuentes de N2 para evaluar su capacidad de fijación a través del tiempo. Las líneas representan la evolución en el número de células viables para las cepas RGM 2450 RGM 2529 y QST 713
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Figura 7. Actividad antagonista de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713 contra el fitopatógeno Botrytis sp. A) Actividad antagonista por contacto directo del patógeno con las tres cepas por separado; B) Actividad antagónica por secreción de factores antifúngicos; C) Actividad antagónica por secreción de compuestos volátiles antifúngicos. Los gráficos muestran el diámetro de crecimiento en milímetros (mm) de Botrytis sp, donde 1) corresponde al control (Botrytis sin tratar), 2) corresponde a un producto comercial v/s Botrytis, 3) RGM 2450 v/s Botrytis, 4) RGM 2529 v/s Botrytis. Se expresan los valores promedio junto a su desviación estándar respectiva. Las letras indican que hay diferencias significativas (p-value < 0,05, ANOVA, LSD).
Figura 8. Actividad antagonista de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713 contra el fitopatógeno Colletotríchum sp. A) Actividad antagonista por contacto directo del patógeno con las tres cepas por separado; B) Actividad antagónica por secreción de factores antifúngicos; C) Actividad antagónica por secreción de compuestos volátiles antifúngicos. Los gráficos muestran el diámetro de crecimiento en milímetros (mm) de Colletotríchum sp, donde 1) corresponde al control (Colletotríchum sin tratar), 2) corresponde a un producto comercial v/s Colletotríchum, 3) RGM 2450 v/s Colletotríchum, 4) RGM 2529 v/s Colletotríchum. Se expresan los valores promedio junto a su desviación estándar respectiva. Las letras indican que hay diferencias significativas (p-value
< 0,05, ANOVA, LSD).
Figura 9. Actividad antagonista de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713 contra el fitopatógeno Phytophthora sp. A) Actividad antagonista por contacto directo del patógeno con las tres cepas por separado; B) Actividad antagónica por secreción de factores antifúngicos; C) Actividad antagónica por secreción de compuestos volátiles antifúngicos. Los gráficos muestran el diámetro de crecimiento en milímetros (mm) de Phytophthora sp., donde 1) corresponde al control (Phytophthora sin tratar), 2) corresponde a un producto comercial v/s Phytophthora, 3) RGM 2450 v/s Phytophthora, 4) RGM 2529 v/s Phytophthora. Se expresan los valores promedio junto a su desviación estándar respectiva. Las letras indican que hay diferencias significativas (p-value
< 0,05, ANOVA, LSD).
Figura 10. Actividad antagonista de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713 contra el fitopatógeno Fusarium sp. A) Actividad antagonista por contacto directo del patógeno con las tres cepas por separado; B) Actividad antagónica por secreción de factores antifúngicos; C) Actividad antagónica por secreción de compuestos volátiles antifúngicos. Los gráficos muestran el diámetro de crecimiento en milímetros (mm) de Fusarium sp., donde 1) corresponde al control (Fusarium sin tratar), 2) corresponde a un producto comercial v/s Fusarium, 3) RGM 2450 v/s Fusarium, 4) RGM 2529 v/s Fusarium. Se expresan los valores promedio junto a su desviación estándar respectiva. Las letras indican que hay diferencias significativas (p-value < 0,05, ANOVA, LSD).
Figura 11. Evaluación de actividades de fijación de N2 y solubilización de P y K de la cepa RGM 2450 en los diferentes formatos de formulación. En la figura se presentan los diferentes ensayos en los cuales se evaluó la fijación de nitrógeno (N) y la solubilización de fósforo (P) y potasio (K) de la cepa RGM 2450. Se evalúan diferentes formatos de presentación para la formulación, donde 1) corresponde al control, 2)-3)-4) corresponden a la formulación de pastilla de liberación prolongada sin gelatina, 0,5X de gelatina y 1X de gelatina respectivamente, 5) polvo mojable y 6) pastilla efervescente.
Figura 12. Evaluación de actividades de fijación de N2 y solubilización de P y K de la cepa RGM 2529 en los diferentes formatos de formulación. En la figura se presentan los diferentes ensayos en los cuales se evaluó la fijación de nitrógeno (N) y la solubilización de fósforo (P) y potasio (K) de la cepa RGM 2529. Se evalúan diferentes formatos de presentación para la formulación, donde 1) corresponde al control, 2)-3)-4) corresponden a la formulación de pastilla de liberación prolongada sin gelatina, 0,5X de gelatina y 1X de gelatina respectivamente, 5) polvo mojable y 6) pastilla efervescente.
Figura 13. Efecto de las cepas RGM 2450 y/o RGM 2529 en el crecimiento de plántulas de tomate. La evaluación se realizó 21 días después de la inoculación de las semillas en los tratamientos descritos. A) Control; B) Resuspensión de cepa RGM 2450 en solución ¡sotónica; C) Emulsión de cepa RGM 2450; D) Resuspensión de cepa RGM 2529 en suspensión ¡sotónica; E) Emulsión de cepa RGM 2529; F) Resuspensión de la mezcla de cepa RGM 2450 y 2529 en solución ¡sotónica; G) Emulsión de mezclas de cepas RGM 2450 y 2529. Figura 14. Evaluación del crecimiento de plantines de tomates provenientes de semillas inoculadas con bacterias. La evaluación se realizó 21 días después de la inoculación de las semillas en los tratamientos descritos. A) Evaluación de la biomasa húmeda; B) Evaluación biomasa seca; C) Evaluación del largo del brote; D) Evaluación del largo de la raíz; E) Evaluación del número de hojas verdaderas. Letras distintas indican que hay diferencias significativas entre los tratamientos (p-value < 0,05, ANOVA, LSD).
Figura 15. Actividad antagonista de las cepas PGPR contra B. cinérea en ensayos realizados en bayas de uvas. La foto es una toma representativa de la actividad de las cepas RGM 2450, RGM 2529, la mezcla de ambas y la cepa comercial QST 713. A) indica las bayas inoculadas con B. cinérea y B) indica las bayas sin inocular con B. cinérea. La fotografía fue tomada tras incubar las unidades experimentales durante 72 horas a 25°C. y alta humedad.
Figura 16. Superficie de respuesta de peso acumulado de frutos de tomate. En el eje Y se encuentra el peso acumulado (g) en X tratamientos y Z las semanas. Los colores representan las distintas superficies cubiertas de acuerdo con los g alcanzados en cada tratamiento.
Figura 17. Cuantificación de clorofila total con respecto a cada tratamiento. Las barras representan los valores promedio. Los bigotes representan las desviaciones estándar y las letras la prueba LSD (a=0,05).
Figura 18. Agrupamiento que participa en la síntesis y transporte de la microcina plantazolicina. Se compara el agrupamiento génico de la cepa RGM 2450 con el agrupamiento génico de la cepa B. pumilus ATCC 7061 y B. venelenzis FZB42 que participan en la síntesis de plantazolicina.
Figura 19. Predicción de agrupamiento génico que codifica sintetasa de péptido no ribosomal y de otras enzimas que participarían en la síntesis de bacilibactina. A) Agrupamiento génico que codifican a las enzimas que participan en la síntesis de bacilibactina y de genes adyacentes que participan en funciones de transporte y regulación. B). Esquema que gráfica la función de las enzimas en la síntesis de bacilibactina y rol de este compuesto. La bacilibactina es sintetizada por un sistema de ensamblaje NRPS (DhbACEBF) y secretada hacia el espacio extracelular. La bacihbactina quela el hierro con una afinidad muy alta, y el complejo férrico-bacilibactina resultante se importa nuevamente al citosol a través del sistema FeuABC-YusV y se hidroliza mediante la esterasa BesA para liberar hierro, que produce tres monómeros de bacilibactina (2,3 -dihidroxibenzoato-Gly- Thr). El hierro liberado sirve como cofactor enzimático.
Figura 20. Predicción de agrupamiento génico que codifica a NRPS que participaría en la síntesis de ciclolipopéptido. A) genes que codifican NRPS y su vecindario génico. B) predicción de la sintetasa de péptidos no ribosomal codificada por los genes biosintéticos junto con los aminoácidos que son reconocidos por sus dominios de adenilación. Cal, dominio Co-enzyme A ligasa, Ag, ácido graso; X, aminoácido indentificado; val, valina; ¡le, isoleucina; leu, leucina; asp, aspartato; glu, ácido glutámico. Predicción parcial de molécula sintetizada por NRPS.
Figura 21. Organización de agrupamiento génico que participaría en la síntesis de ciclolipopéptido en cepas del género Bacillus sp. A) Organización de agrupamiento génico en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2450. B) Comparación de agrupamiento génico de la cepa RGM 2450 con el de la cepa B. licheniformis DSM 13 que participa en la síntesis del ciclolipopéptido de lichensina.
Figura 22. Predicción de agrupamiento génico que codifica a NRPS que participaría en la síntesis de bacilisina. A) se ¡lustran los genes que participan en la síntesis y transporte del péptido bacilisina. B) estructura de bacilisina. C) Organización génica del agrupamiento génico en otras cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2450.
Figura 23. Agrupamiento génico acnABCD que codifica la amilociclina. A) agrupamiento génico que codifica a la amilociclina en la cepa RGM 2529. B) Presencia del agrupamiento génico en cepas de especies PGPR.
Figura 24. Agrupamiento génico DhbACEBF de la cepa RGM que 2529 que participa en la síntesis de bacilibactina. En la proximidad del vecidaho génico de amilociclina se detectó el agrupamiento génico DhbACEBF de 13.034 pb que participa en la síntesis y ensamblaje del sideróforo bacilibactica. Figura 25. Agrupamiento genico que participaría en la síntesis de surfactina. A) Organización de agrupamiento génico de surfactina en la cepa RMG 2529. B) Agrupamiento génico de surfactina en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2529.
Figura 26. Agrupamiento génico que participaría en la síntesis de fengicina.
A) Organización de agrupamiento génico de fengicina en la cepa RMG 2529. B) agrupamiento génico de fengicina en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2529. C) estructura de fengicina.
Figura 27. Agrupamiento génico que participaría en la síntesis de bacilomicina D. A) Organización de agrupamiento génico de bacilomicina D en la cepa RMG 2529. B) agrupamiento génico de bacimilocina D en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2529.
Figura 28. Agrupamiento génico que participaría en la síntesis de bacilaeno.
A) Organización de agrupamiento génico de bacilaeno en la cepa RMG 2529. B) agrupamiento génico de bacilaeno en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2529.
Ejemplos de aplicación
Ejemplo 1. Caracterización de las cepas bacterianas RGM 2450 y RGM 2529.
En este ejemplo de aplicación se presenta la caracterización de las cepas bacterianas RGM 2450 y RGM 2529, principios activos de la formulación descrita en la presente invención. Se describe la caracterización molecular y su caracterización desde el punto de vista de su capacidad de fijación de nitrógeno y solubilización de fósforo y potasio, capacidad de producción de fitohormonas (IAA). Se evalúa también su capacidad de control de patógenos.
1.1 Caracterización molecular
Extracción de ADN y amplificación de genes 16s, pyrE y rpoB.
Se realizó la extracción de DNA de las cepas RGM 2450 y RGM 2529. Se amplificaron los marcadores genéticos: rRNA 16S y pyrE para la cepa RGM 2450, y rRNA 16S y rpoB para la cepa RGM 2529. La reacción de amplificación de cada marcador genético constó de 25 a 50 ng de ADN de la cepa, 1X de DreamTaq Green PCR Master Mix, 400 pMol de cada partidor (Tabla 1) y agua Millipura libre de nucleasas en un volumen final de reacción de 50 μL. El perfil térmico de la amplificación consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C por 2 min, seguido de 35 ciclos de amplificación (desnaturalización a 98°C por 30 s, alineamiento a 55 °C por 30 s y una extensión a 72 °C por 45 s) y una extensión final a 72 °C por 5 min. Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y tinción con GeIRed 1X. La banda correspondiente al tamaño esperado se cortó y purificó con Zymo Clean Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) bajo las instrucciones del fabricante. El fragmento purificado de esta reacción se envió a secuenciar al centro de secuenciación Macrogen. Se secuenció cada marcador en la dirección sentido y anti-sentido, empleando los partidores de la Tabla 1. Se ensambló las secuencias sentido y anti-sentido obtenidas de la secuenciación de los marcadores genéticos de las cepas empleando el programa Vector NTI.
Tabla 1. Secuencias de partidores utilizados para amplificar los genes involucrados en la caracterización molecular de las cepas RGM 2450 y RGM 2529.
Partidor Composición del partidor Gen Blanco Referencias
27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG rRNA 16S Weisburg et al., 1990
1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT rpoBF GTTGGCTTCATGACTTGGGA rpoB Fan et a/., 2017 rpoBR ACGTTCCATACCTAAACTTTG pyrEF AGACCGTTTCTTCCATCCA pyrE pyrER CACCTATTACAAATCAAAGC Liu et al., 2013
Análisis de identidad y filogenia de las especies. Se comparó la secuencia de los marcadores de las cepas RGM 2450 y RGM 2529 con las secuencias tipo de las especies de los grupos bacterianos a las cuales pertenecen (Tabla 2). Primero, se verificó la identidad de las cepas RGM 2450 y 2529 empleando el marcador genético 16S rRNA para determinar el género y grupo bacteriano al cual pertenecen, para posteriormente emplear los marcadores específicos pyrE y rpoB para corroborar las especies particulares de RGM 2450 y RGM 2529, respectivamente. El análisis del gen 16S rRNA indicó que la cepa RGM 2450 pertenece al grupo B. pmilus, en tanto RGM 2529 pertenece al grupo B. amyloliquefaciens. Tabla 2. Identidad nucleotídica entre las cepas RGM 2450 y RGM 2529 con bacterias de la especie B. pumilus y B. amyloliquefaciens. En paréntesis junto a cada especie, se encuentra su ID de acceso en la base de datos NCBI.
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Luego, se realizaron análisis filogeneticos en base a los marcadores secuenciados empleando el software MEGA 6.0.6. (Figuras 1 , 2 y 3). Para ello, se alinearon las secuencias de los marcadores genéticos de RGM 2450 y RGM 2529 junto con las secuencias de las cepas de referencia empleando la opción MUSCLE. Posteriormente, se determinó la historia evolutiva empleando un método estadístico (Máximo Likehood/Neighbor-joining) y un modelo de sustitución nucleotídica (modelo Kimura-2-parámetros/Tamura-Nei/Tamura-3-parametros), considerando una distribución Gamma para modelar diferencias de la tasa de variación entre sitios. Se sustentó la hipótesis de las relaciones filogenéticas empleando 1000 réplicas de bootstrap. Los árboles filogenéticos grafican claramente los resultados expuestos en la Tabla 2, indicando que la cepa RGM 2450 comparte un ciado taxonómico con la cepa bacteriana B. safensis FO-036b (bootstrap de 100%) (Fig. 2), en tanto RGM 2529 se encuentra en el mismo ciado que con B. siamensis KCTC 13613T (bootstrap de 99 %) (Fig. 3).
1.2 Solubilización de fósforo y potasio y Capacidad de fijación de nitrógeno
En el caso de la evaluación de la solubilización de fosfato, se creció las cepas RGM 2450 y RGM 2528 en 5 mL de medio líquido LB por 16 h (30°C y 200 rpm). Se adicionó 10 μL del cultivo en el medio agar Pikovskaya (0,3 g/L de NaCI; 0,3 g/L de MgSO4-7H2O; 0,03 g/L de MnSO4-4H2O; 0,3 g/L de KCI; 0,5 g/L (NH4)2SO4; 0,03 g/L de FeSO4 7H2O; 2 g/L de Ca3(PO4)2; 10 g/L de glucosa; 0,5 g/L de extracto de levadura; 15 g/L de agar. Ajustar a pH 7,0 (Vázquez et al., 2000). Se incubó por 7 días a 30°C. La aparición de un halo transparente alrededor de la colonia bacteriana indicó la capacidad de solubilizar fosfato. El ensayo se realizó en triplicado.
Para la evaluación de la solubilización de potasio, se creció las cepas RGM 2450 y RGM 2528 en 5 mL de medio líquido LB por 16 h (30°C y 200 rpm). Se adicionó 10 μL del cultivo en el medio agar Pikovskaya modificado (0,3 g/L de NaCI; 0,3 g/L de MgSO4-7H2O; 0,03 g/L de MnSO4-4H2O; 2 g/L de KNO3; 0,5 g/L (NH4)2SO4; 0,03 g/L de FeSO4 7H2O; 0,5 g/L de Ca3(PO4)2; 10 g/L de glucosa; 0,5 g/L de extracto de levadura; 15 g/L de agar. Ajustar a pH 7,0 (Vázquez et al., 2000). Se incubó por 14 días a 30°C. La aparición de un halo alrededor de la colonia bacteriana indicó la capacidad de solubilizar potasio. Para determinar la capacidad de fijación de nitrógeno, se creció las cepas RGM 2450 y RGM 2528 en 5 mL de medio líquido LB por 16 h (30°C y 200 rpm). Se centrifugó por 5 min a 3500 g y lavó 3 veces con tampón PBS estéril (8 g/L de NaCI, 0.2 g/l KCI, 1.44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4, ajustar a pH 7,4). Finalmente, se resuspendió en 3 mL de solución PBS y se adicionó 10 μL de la suspensión en medio Ashby (10 g/L de glucosa; 0,2 g/L de KH2PO4; 0,2 g/L de MgSO4; 0,2 g/L de NaCI; 0,2 g/L de CaSO4; 5 g/L CaCO3) e incubó por 7 días a 30°C (Rao, 1999; Velázquez-Gurrola y Ramos-Alegría, 2015). El crecimiento de la cepa indicó la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico. El ensayo se realizó en triplicado.
En cuanto a la solubilización de P, la cepa RGM 2450 presenta una habilidad similar a la cepa del producto comercial que incluye la cepa de Bacillus subtilis QST 713, en tanto RGM 2529 exhibe un halo de mayor rango que demuestra su capacidad superior para realizar esta labor (Fig. 4). Por otra parte, se observa que ambas cepas tienen habilidad para la solubilización de K in vitro por el cambio de color en el medio (Fig. 5).
La cepa RGM 2450 tuvo el mayor efecto en la fijación de N2, presentando incluso mejor crecimiento en medio Ashby modificado.
Para el ensayo de fijación de N2 (Fig. 6), se observa que la cepa RGM 2450 creció significativamente mejor en comparación a las cepas RGM 2529 y QST 713 tras 24 horas del experimento, demostrando que su habilidad en la fijación de este elemento es mayor.
1.3 Capacidad de producción de fitohormonas (AIA).
Se determinó la capacidad de las cepas RGM 2450, RGM 2529 para producir la fitorhormona ácido indolacético. Para esto, se crecieron las cepas RGM 2450, RGM 2529 y B. subtilis QST 713 en 5 mL de medio LB a 30°C y 200 rpm. Luego de 16 h de incubación, se midieron la turbidez de los cultivos a λ600 y se inoculó una alícuota (turbidez λ600 = 1 ,0-1 , 2) de cada cepa en medios de cultivo de LB suplementado con triptófano 1000 μg/mL (SIGMA ALDRICH). La concentración de AIA relativa en los sobrenadantes de los cultivos se determinó por el método de Salkowski (Patten y Glick, 2002; Yang et al., 2007). Se recogieron muestras de
1.5 mL y se centrifugaron a 3000 g por 10 min. Se tomó una alícuota de 1 mL de sobrenadante y se mezcló vigorosamente con 4 mL de reactivo de Salkowski (150 mL de H2SO4 concentrado, 250 mL de H2O destilada, 7,5 mL de FeCI3 x 6H2O 0,5 M) y se incubó por 20 min a temperatura ambiente. La formación de coloración indicó la presencia de AIA, que se cuantificó por medición de absorbancia a 535 nm. Se efectuó 1 curva de calibrado preparadas con diluciones seriadas de solución stock de AIA en medio medio LB a un rango de concentración de 0,7 y
12.5 μg/mL.
Tabla 3. Concentración de IAA en cultivos bacterianos RGM 2450, RGM 2529 y QST 713. El ensayo se realizó en medios de cultivo LB que contenían triptófano 1 mg/mL. Las distintas letras representan diferencias significativas entre los tratamientos (p-value < 0,05, ANOVA, Tukey).
Cepa Absorbancia A = 535 Concentración relativa de IAA [mg/mL]
RGM 2450 0,21 ± 0,01 0,0079 ± 0,0006a
RGM 2529 0,21 ± 0,01 0,008 ± 0,001a
QST 713 0,24 ± 0,01 0,0105 ± 0,0009b
Los resultados expuestos en la tabla 3 demuestran que las cepas RGM 2450 y RGM 2529 son capaces de producir IAA en las condiciones entregadas por el medio. No hubo una diferencia significativa al comparar las concentraciones producidas por ambas cepas. Sin embargo, al contrastarlas con la cepa comercial QST 713, las dos produjeron significativamente una menor cantidad de esta fitohormona: alrededor de un 20% menos transcurridas 48 horas de crecimiento. Cabe destacar que altas concentraciones de IAA pueden generar inhibición del crecimiento de las plantas y deformación en el tejido vegetal.
1.4 Capacidad de control de patógenos. Se crecieron las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en medio de cultivo LB por 16 h. Se adicionó una alícuota de 100 μL de este cultivo a una placa de agar LB y se esparció con el asa de Drigalsky por toda la superficie del agar. Paralelamente, se retiró un disco de 6 mm de diámetro del borde de un cultivo de una cepa de Botrytis resistente, crecidas en agar PDA por 7 días. El disco fue depositado en el centro de una placa de agar PDA, para evaluar la inhibición de los fitopatógenos por contacto directo.
Para determinar la inhibición por producción de compuestos volátiles, la placa de agar de LB inoculada con una cepa de Bacillus se dispuso en la parte superior de la placa inoculada con el hongo fitopatógeno. Las placas unidas se sellaron con 4 vueltas de papel Parafilm.
Se realizó el mismo procedimiento, empleando el hongo fitopatógeno Colletotrichum. Se dejo incubando a temperatura ambiente por 7 días.
El porcentaje de inhibición del crecimiento del micelio de los patógenos evaluados por compuestos volátiles y no volátiles se calculó según la fórmula de PGI:
PGI = ((C - T)/ C x 100)
Donde PGI = inhibición del crecimiento del patógeno (%); C = Crecimiento diametral del patógeno (controlar); T = Crecimiento diametral del patógeno (tratado).
De acuerdo con el diseño experimental, se realizaron los análisis de varianza ANDEVA basado en la prueba de F, con un comparador de p-value = 0,05 para determinar el efecto de la exposición de los nemátodos a los extractos de proteínas recombinantes. Finalmente, se determinaron las diferencias estadísticas significtivas a través de la prueba de LSD, p-value = 0,05.
Tabla 4. Evaluación cuantitativa del efecto causado por las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en el crecimiento de Botrytis sp. Los valores se expresan en porcentajes (%) de comparación en la medición del halo de crecimiento del patógeno respecto del grupo control, junto a su desviación estándar respectiva.
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Los resultados muestran que el efecto antagonista de la cepa RGM 2450 contra Botrytis sp. provocó una inhibición cercana al 79% al entrar en contacto directo con el patógeno, un 46% por antibiosis, y de un 79% por producción de compuestos volátiles; la cepa RGM 2529, por su parte, exhibió un 86%, 62% y 84% de inhibición al exponerse al mismo hongo para los ensayos por contacto directo, antibiosis y producción de compuestos volátiles, respectivamente (Tabla 4 y Figura 7).
Tabla 5. Evaluación cuantitativa del efecto causado por las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en el crecimiento de Colletotríchum sp. Los valores se expresan en porcentajes (%) de comparación en la medición del halo de crecimiento del patógeno respecto del grupo control, junto a su desviación estándar respectiva.
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Por otro lado, para Colletotríchum sp. los porcentajes de inhibición observados para RGM 2450 fueron de un 43% y un 53% para los ensayos de contacto directo y antibiosis, respectivamente; para RGM 2529 se observó una disminución en el halo de crecimiento del patógeno de un 78% por contacto directo, y de un 70% por antibiosis. No se apreció ningún efecto inhibitorio en el caso de los compuestos volátiles por parte de ambas cepas (Tabla 5 y Figura 8).
Tabla 6. Evaluación cuantitativa del efecto causado por las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en el crecimiento de Phytophthora sp. Los valores se expresan en porcentajes (%) de comparación en la medición del halo de crecimiento del patógeno respecto del grupo control, junto a su desviación estándar respectiva.
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En el caso de las pruebas contra el patógeno Phytophthora sp., la cepa RGM 2450 causó una inhibición del 45% por contacto directo y un fuerte efecto por antibiosis de un 41 %. En tanto, la cepa RGM 2529 mostró un efecto de inhibición de 80% por contacto directo y 52% al tratarse por antibiosis. No se exhibió inhibición del crecimiento por producción de compuestos volátiles en ningún caso (Tabla 6 y Figura 9).
Tabla 7. Evaluación cuantitativa del efecto causado por las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en el crecimiento de Fusarium sp. Los valores se expresan en porcentajes (%) de comparación en la medición del halo de crecimiento del patógeno respecto del grupo control, junto a su desviación estándar respectiva.
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Finalmente, para Fusarium sp., las cepas RGM 2450 y RGM 2529 causaron una inhibición en el crecimiento de 24% y 4% por contacto directo, y 53% y 41 % por ensayo de antibiosis, respectivamente. No se exhibió inhibición por producción de compuestos volátiles para ninguna de las cepas (Tabla 7 y Figura 10).
Ejemplo 2. Preparación de formulaciones que comprenden las cepas RGM 2450 y RGM 2529 con actividad PGPR para diferentes formatos de presentación y administración
La formulación de la presente invención puede ser presentada y administrada como una formulación en pastillas de liberación prolongada, en polvos mojables y como pastillas efervescentes
2.1 Formulación de pastillas de liberación prolongada.
Se realizaron 3 formulaciones para la generación de pastillas de liberación prolongada con el fin de determinar dosificación en la secreción y preservación de la viabilidad. La primera formulación estuvo constituida por 28,6% de harina de trigo, 28,6% de fécula de maíz y 42,8% de cultivo bacteriano. La segunda formulación consistió 30,4% de harina de trigo, 30,4% de fécula de maíz, 38,2% de cultivo bacteriano y 1 % de gelatina al 13% (0,5X gelatina).
La tercera formulación consistió en 32,6% de harina de trigo, 32,6% de fécula de maíz, 32,8% de cultivo bacteriano y 2% de gelatina al 13% (1X gelatina). Para la formulación la fécula se esterilizó en seco a 180°C por 30 min y la gelatina se resuspendió en una proporción 1 :8. Las formulaciones se dosificaron en capsulas de 0,62 g con 1 ,4 cm de diámetro y 0,6 cm de grosor. Se conservaron a 4°C por 16 h, posteriormente se deshidrataron a 40°C por 2 h. Las pastillas se depositaron sobre 50 μL de agua en los medios de cultivo Ashby, Pikovskaya y Pikovskaya modificado y se incubaron a 25° C por 14 días. Adicionalmente, se realizó el recuento de bacterias presentes en las formulaciones mediante el maceramiento y resuspensión de la formulación en 50 mL de agua destilada estéril.
2.2 Formulación de polvos mojables.
Para la formulación de polvo mojable se mezcló 17% de almidón de papa con 14,6% de dióxido de silicio y 68,4% de cultivo bacteriano. Se pesó 1g del producto y se resuspendió en 100 mL de agua destilada estéril, se adicionó 20 μL de la suspension en los medios de cultivos Ashby, Pikovskaya y Pikovskaya modificado y se incubaron a 30°C por 7 días. Adicionalmente, se realizó el recuento de bacterias presentes en las formulaciones.
2.3 Formulación de pastillas efervescentes.
Para la formulación de las pastillas efervescentes se mezcló 30% de ácido cítrico con 66,6% de bicarbonato y 3,4% de cultivo bacteriano, y a medida que se adicionó el cultivo se procedió a homogenizar mezclando los componentes. La mezcla resultante se dispuso en moldes circulares de 35 mm de diámetro y 0,5 mm de profundidad, generándose 6 pastillas de 4,7 g. Se disolvieron en 100 mL de agua destilada estéril y 20 μL de esta solución se depositaron en los medios de cultivos Ashby, Pikovskaya y Pikovskaya modificado y se incubaron a 30° C por 7 días. Adicionalmente, se realizó el recuento de bacterias presentes en las formulaciones.
Tabla 8. Recuentos de células viables presentes en las distintas formulaciones. Los datos corresponden a los valores en unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de formulación promedio, junto a su respectiva desviación estándar, al realizar el ensayo por triplicado.
Células viables (UFC/g de formulación) Cepa RGM 2450 Cepa RGM
2529
Pastilla sin gelatina 1 ,0*107 ± 2*106 6*106 ± 2*106
Pastilla con 0.5X gelatina 2,6*107 ± 6*106 7*106 ± 3*106
Pastilla con 1X gelatina 8*106 ± 1*106 1 ,2*107 ± 1*106
Polvo mojable 4*108 ± 1*108 4*107 ± 3*107
Pastilla efervescente 5,3*106 ± 6*105 3,4*106 ± 6*106
De acuerdo con lo expuesto en la tabla 8, el número de células viables para las cinco diferentes formulaciones estuvo entre 3,4*106 - 4*108 UFC/g y fue igual o superior al número de células viables presentes en el producto líquido comercial Serenade® (1 ,4*107 UFC/g), que incluye la cepa QST 713, utilizada previamente como control comparativo. Las formulaciones fueron, ademas, analizadas para evaluar que posean las mismas características evaluadas anteriormente para la fijación de nitrógeno, y la solubilización de fósforo y potasio. En el caso de la bacteria RGM 2450 (Fig. 11), esta mantiene su capacidad de fijar nitrógeno, pero es incapaz de solubilizar P al probarse en pastillas de liberación prolongada, mientras que la solubilización de K no se aprecia con claridad. El efecto en la fijación de nitrógeno no fue perceptible con tanta facilidad en el caso de las demás formulaciones, por lo que no puede confirmarse que la cepa mantenga sus habilidades al incorporarse en un polvo mojable o pastilla efervescente.
Por otro lado, la cepa RGM 2529 (Fig. 12) fue capaz de crecer para el caso de las pastillas de liberación prolongada, principalmente por el efecto propio de la formulación en el medio, más que por una actividad biológica particular de la bacteria. No hubo un efecto en la solubilización de P ni de K. En los polvos mojables y la pastilla efervescente, las condiciones exhibidas fueron ¡guales a la del control, por lo que se confirma que la capacidad de solubilización de la cepa se mantiene al menos en estas dos formulaciones.
Ejemplo 3. Uso de formulaciones que comprenden las cepas RGM 2450 y RGM 2529 como bioestimulantes/bioprotectores de plantas.
3.1 Estudio del efecto bioestimulante in vitro.
Se aplicaron distintos tratamientos a semillas de tomate esterilizadas en las siguientes resuspensiones bacterianas y emulsiones: (i) resuspensión de cepa RGM 2450, (¡i) resuspensión de cepa RGM 2529, (i¡¡) mezcla de ambas cepas en una proporción 1 :1 , (iv) emulsión de cepas RGM 2450, (v) emulsión de cepa RGM 2529, (vi) mezcla de la emulsión de cepas en una proporción 1 :1.
Para preparar la resuspensión de bacterias en una solución de NaCI, se inoculó una colonia de la cepa RGM 2450 y RGM 2529, cada una por separado en 5mL de medio LB, para generar los preinóculos de los respectivos cultivos. Se incubaron los preinóculos a 30°C a 200 rpm, hasta llegar a una turbidez de 1 ,0 (X = 600 nm). Posteriormente, se inocularon matraces con medio LB con una alícuota de preinóculo al 1% (es decir 800 μL de preinóculo en 80 mL de cultivo). Se crecieron las cepas RGM 2450 y RGM 2529 por 20 h en medio LB a 30°C. Una alícuota de 25 mL de cada cultivo se centrifugó a 2500 g por 10 minutos. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en una solución ¡sotónica de 0,9% de NaCI. La centrifugación, descarte del sobrenadante y resuspensión en solución de 0,9% de NaCI se realizó 3 veces para eliminar residuos del medio de cultivo. Finalmente, se resuspendieron las células en una solución de 0,9% NaCI suplementado con 0,01 % Tween 20. La concentración de células viables de la resuspensión de la cepa RGM 2450 y RGM 2529 en la solución ¡sotónica de NaCI fue de 4,7 x 109 (± 8 x 108) y 1 ,8 x 108 (± 5 x 107) UFC/mL, respectivamente. La concentración celular de la cepa RGM 2529 está subestimada debido a la formación de agregados filamentosos (Informe 5), que impiden determinar con exactitud la cantidad de células presentes, por los que se utilizó el mayor valor de UFC/mL que se pude obtener por lote. La concentración celular que se empleó fue en base a la concentración de UFC/mL presentes en los productos comerciales registrados en Chile como bioestimulante, TRIBAC BIO (1 x 109 UFC/mL, empresa ANASAC) y TIFI (2 x 108 UFC/g, empresa In pacta).
Para la emulsión bacteriana descrita, ésta se preparó en dos fases. En la primera fase, en un tubo se adicionó 5,33 mL de aceite y 0,22 mL de Tween 20. Se agitó el tubo durante 1 minuto en vortex. En la segunda fase se agregó 0,47 mi de glicerol, 3,75 mi de Silwet y 5 mi de la suspensión bacteriana del tratamiento anterior con una concentración 20 veces mayor y se agitó durante 1 minuto en vortex. Luego se mezcló el contenido de ambos tubos y se agitó durante 1 minuto. Se tomó una alícuota de la mezcla homogenizada y se resuspendió en 9 mi de agua destilada estéril para la obtención de la emulsión bacteriana diluida.
Para aplicar los tratamientos, se emplearon entre 20 a 25 semillas por tratamiento incluido el control. Las semillas que se trataron con resuspensiones bacterianas se incubaron con las células bacterianas por 45 min en agitación orbital suave (100 rpm). Las semillas que se trataron con la emulsión bacteriana se embebieron por 5 min en la emulsión diluida. Las semillas del tratamiento control se trataron con 0,9% de NaCI. Las semillas de cada tratamiento se sembraron en almacigueras de germinación que contenían una mezcla de 1 : 1 (v:v) turba autoclavada: vermiculita y se incubaron a 25°C ± 2°C con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad (Mena-Violante y Olalde-Portugal, 2007; Vaikuntapu et al., 2014; Cordero et al., 2018). A los 21 días de incubación se evaluaron los siguientes parámetros: biomasa húmeda, biomasa seca, longitud de la raíz, longitud del brote, longitud del brote del tomate y número de hojas verdaderas (Mena-Violante y Olalde- Portugal, 2007; Vaikuntapu et al., 2014; Cordero et al., 2018). Para determinación de la biomasa seca, se incubaron las plántulas de tomate a 80°C por 48 h, luego de la incubación se esperó a que alcanzaran la temperatura ambiente y se determinó su masa. Los resultados de la determinación de los parámetros de crecimiento de las réplicas por cada tratamiento se indica en las tablas suplementarias presentes en el anexo del informe.
De acuerdo con el diseño experimental, se realizaron los análisis de varianza AN DEVA basado en la prueba de F, con un comparador de p-value = 0,05 para determinar el efecto de los tratamientos experimentales con respecto al control. Finalmente, se determinaron las diferencias estadísticas significativas a través de la prueba de LSD, p-value = 0,05.
Tabla 9. Impacto del uso de las cepas RGM 2450 y/o RGM 2529 en el desarrollo y crecimiento de semillas de tomate. Los valores de biomasa seca y húmeda están expresados en gramos (g) mientras que el largo de brotes y raíces se expresan en milímetros (mm). En paréntesis se indica la desviación estándar para cada parámetro.
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Tabla 10. Comparación porcentual de los parámetros de crecimiento de las semillas de tomate. Los valores se expresan en porcentajes (%) de diferencia entre las plantas tratadas con distintas formulaciones de RGM 2450 y/o RGM 2529 versus el grupo control (sin tratar).
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Las plántulas de las semillas tratadas con las resuspensiones y emulsiones bacterianas después de 21 días de crecimiento presentaron un incremento significativo en la biomasa húmeda y seca con respecto al tratamiento control (Tablas 9 y 10; Figuras 13 y 14). La biomasa húmeda de los tratamientos experimentales mostró un aumento entre un 19 a 103 %, mientras que la evaluación de la biomasa seca indicó un incremento entre un 19 a 63%. En cuanto a la longitud del brote, solo las mezclas de las cepas presentaron un incremento significativo, entre un 16 y 26%, los otros tratamientos no presentaron diferencias significativas con respecto al control.
Las plántulas de las semillas inoculadas con los tratamientos experimentales, exceptuando el tratamiento de incubación de semillas con la suspensión de la cepa RGM 2450, presentaron un incremento significativo de la longitud de la raíz, entre un 15 y 42% con respecto el control. En la evaluación del número de hojas verdaderas, los tratamientos de mezclas de cepas junto con el tratamiento de resuspensión de la cepa RGM 2529 presentaron diferencias significativas con respecto al control.
Cabe destacar que las semillas inoculadas con mezcla de las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en la solución de NaCI (0,9%) presentaron el mayor incremento de la biomasa húmeda, seca, longitud del brote, longitud de raíz y hojas verdades, obteniendo un 103%, 63%, 26%, 36% y 13%, respectivamente, con respecto al tratamiento control.
3.2 Estudio del efecto bioprotector in vitro.
Se lavaron 200 bayas de uva con detergente al 0,1% y luego de 15 minutos de lavado, se descartó el agua con detergente y se procedió a la desinfección de las bayas con hipoclorito de sodio (NaCIO3) a una concentración final de 0,5%. Se incubaron las bayas con esta solución de desinfección durante 3 minutos, posteriormente se enjuagaron con agua destilada estéril y se depositaron en toalla absorbente dentro de campana de flujo laminar para la eliminación del exceso de agua. Tras esto, se dispusieron 4 bayas por pocilios, en donde cada pocilio correspondía a una repetición que contenía 4 unidades experimentales (bayas). Los tratamientos consistieron en la inoculación de 2 μL de la Resuspensión celular de B. safensis RGM 2450 (1010 UFC/mL), B. siamensis RGM 2529 (106 UFC/mL), una mezcla de ambas cepas, fungicida comercial Serenade®(Bayer), y agua. Después de 24 horas de la inoculación con cada tratamiento, se adicionó 2 μL de Resuspensión de esporas de B. cinérea (106 UFC/mL). La inoculación se realizó sobre el orificio que se realizó a la baya con la punta de una jeringa.
En un segundo ensayo, se aplicaron los mismos tratamientos, pero se evaluó la capacidad del producto comercial sin los excipientes contenidos en su formulación. Para esto, se centrifugó 1 mL de producto a 5000 g por 10 minutos y descartando el sobrenadante, para obtener el compuesto bacteriano activo (cepa B. subtillis QST 713). El pellet se resuspendió con 1 mL de agua destilada para obtener una suspensión celular. Posteriormente, se utilizaron 2 μL de esta solución para inocular las unidades experimentales correspondientes.
Después de la inoculación con B. cinérea, se incubaron las bayas de ambos ensayos durante 72 horas a 25°C y alta humedad, para luego evaluar el cualitativamente el daño producido por el fitopatógeno en los frutos (Figura 15 y Tabla 11).
Tabla 11. Evaluación de la actividad antagonista de las cepas PGPR contra
B. cinérea en bayas de uva. Los diámetros se expresan como el diámetro de lesión promedio, junto a su desviación estándar, para los resultados obtenidos de repetir el ensayo por cuadruplicado.
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Los ensayos muestran una inhibición en el crecimiento del fitopatógeno significativamente mayor por parte de las cepas RGM 2450 y RGM 2529, en comparación con el producto comercial desprovisto de sus coformulantes (solo la bacteria Bacillus subitillis QST 713), alcanzando un porcentaje de inhibición del 50% tanto al emplear cada cepa RGM por separado, como al hacerlo aplicando la mezcla de ambas.
Ejemplo 4. Prueba de campo de la actividad PGPR de las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529: cultivo de tomate en invernadero
El objetivo de este ejemplo de aplicación es evaluar el efecto de la inoculación de las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529, por separado y en conjunto sobre parámetros productivos en plantas de tomates bajo condiciones de invernadero. En particular, se evalúa el efecto de formulaciones en los formatos de administración en polvo mojable, pastilla efervescente y pastilla de liberación prolongada de las cepas RGM 2450 y RGM 2529.
Para la preparación inicial de los cultivos de las bacterias B. safensis RGM 2450 y B. siamensis RGM 2529, se realizó fermentación por lote alimentado en biorractores (Applikon (Applikon Biotechnology a) de tanque agitado hasta 5L de operación.
Los concentrados microbianos obtenidos fueron cosechados y conservados a 4°C en botellas de pyrex estériles (Duranâ) de 2L. Los concentrados fueron muestreados mensualmente durante 5 meses manteniendo su viabilidad promedio en el orden de 109 UFC/mL. Estos concentrados fueron utilizados para inocular semillas y preparar las distintas formulaciones: Pastilla de Liberación Prolongada (PLP), Pastilla Efervescente (PE) y Polvo Mojable (WP, por sus siglas en ingles). Además, las distintas formulaciones fueron utilizadas en conjunto a distintas concentraciones de fertilizantes de liberación prolongada para determinar el efecto de las bacterias sobre el cultivo de tomate.
Para facilitar el entendimiento, se exponen de forma secuencial las etapas del ensayo, dividiéndose en las siguientes etapas: inoculación de semillas y trasplante (4.1), fertilización diferenciada (4.2), preparación de formulaciones (5.3), aplicación de formulaciones a las plantas (4.4), diseño de experimentos (4.5), manejo de las plantas (4.6) y determinación de parámetros de interés productivo en cultivos de tomate: determinación de la longitud, peso y tomates, y determinación de clorofila (4.7). Finalmente, los resultados del ensayo serán expuestos en el punto 4.8.
4.1. Inoculación de semillas y trasplante.
Las semillas utilizadas en este ensayo fueron de la variedad Roma VF (VitaÓ). Previo a su inoculación, éstas fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio al 2% por 3 min, y luego lavadas 5 veces con agua destilada estéril para retirar el desinfectante. Todos los tratamientos fueron inoculados con bacteria desde semilla (a excepción del testigo). Las bacterias fueron lavadas de los coadyuvantes que pudiesen existir en el medio de cultivo en el cual crecieron que pudiesen interactuar con la planta y dar resultados alterados por la presencia de nutrientes. Los lavados fueron realizaron 3 veces con tampón PBS (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1 ,8 mM KH2PO4, pH = 7,2) estéril junto con la posterior centrifugación a 5000 rpm x 5 min, descartando el sobrenadante luego de cada centrifugación. Los pellets fueron resuspendidos en tampón PBS quedando ambas cepas a una concentración de 109 UFC/mL. Posteriormente, las semillas fueron embebidas en tampon con las bacterias por 40 min en agitación a 200 rpm. En el caso del control comercial, se pusieron las semillas en solución con la misma concentración que las cepas de interés, 109 UFC/mL. Luego de la inoculación, las semillas fueron sembradas superficialmente en el sustrato de composición 2:1 :1 de turba, perlita y compost respectivamente, en almácigos de 110 mm de profundidad y 5x5 cm de área superficial en invernadero. Posteriormente, las plántulas resultantes fueron trasplantadas a macetas de 5L. El ensayo fue realizado en un invernadero de bioseguridad de 8 x 9 m (ancho x largo) con riego automático y temperatura controlada de 25°C±5.
4.2 Fertilización diferenciada.
En los ensayos se utilizó el fertilizante Multicote Agri® (12m) de ANASAC. Este fue adicionado y homogenizado con el sustrato (descrito previamente). Además, el fertilizante fue añadido en diferentes concentraciones descritos en la Tabla 12, para cuantificar la respuesta (peso y calibre) de la interacción fertilización- microorganismo.
Tabla 12. Distintos porcentajes de fertilización utilizados por cada planta. El 100% de fertilización corresponde a la dosis de aplicación según lo indicado por el fabricante.
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4.3 Preparación de formulaciones
Las formulaciones fueron realizadas según la Tabla 13 donde se exponen ingredientes y concentraciones para la preparación de las distintas formulaciones bacterianas propuestas. Para la determinación de las masas y volúmenes se consideró que la densidad de las bacterias en el medio de cultivo líquido (caldo microbiano) es igual a 1 g/mL. Para llegar a la concentración de UFC/g de producto indicada, fue necesario diluir o concentrar las bacterias, según se requiera. Esto se realizó en proporción con sus ingredientes, para que cada 100g de formulado quede con una concentración de 2*1010 UFC.
Se prepararon formulaciones del producto tipo polvo mojable (WP), formulaciones para pastillas de liberación prolongada (PLP) y para pastilla efervescente (PE).
Tabla 13. Ingredientes y concentraciones para la preparación de las distintas formulaciones bacterianas propuestas.
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4.4 Aplicación de formulaciones a las plantas La aplicación de las bacterias fue realizada en los formatos de formulaciones ya descritas: PLP, PE y WP. Las aplicaciones se realizaron en la base del tallo de la planta en la maceta de 5L.
Las formulaciones PE y WP fueron disueltas en agua para ser aplicadas en no más de 10 mL por maceta, equivalente a 108 UFC/planta (también para el control comercial). La PLP se introdujo en el sustrato en la base de la planta, entre el tallo y el gotero del riego automático y su fue concentración también fue equivalente a 108 UFC/planta. Las aplicaciones de las formulaciones fueron realizadas a los 60 d desde el inicio de cultivo.
4.5 Diseño de experimentos El experimento fue diseñado con las formulaciones PLP, PE y WP, más un control comercial y testigo junto con 4 dosis de fertilización diferenciada (Tabla 13), lo que resultó en un total de 44 tratamientos (Tabla 14), con 3 repeticiones cada uno alcanzando 132 macetas en total. Se realizó una sola evaluación en su etapa de producción al final del cultivo. Las evaluaciones fueron el peso de tomate acumulado a la séptima semana de cultivo junto a su calibre y clorofila del follaje.
Tabla 14. Tabla de tratamientos. Los porcentajes corresponden a las fertilizaciones de Multicote Agri en combinación con las formulaciones (PLP, PE y WP) y las bacterias RGM 2529, RGM 2450 y su Mezcla (1 :1).
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4.6 Maneio de las plantas
Las plantas fueron manejadas realizando las siguientes aplicaciones y técnicas:
1. Aplicación calcio: debido a los requerimientos nutricionales de calcio por parte de la variedad utilizada. En total, se realizaron 4 aplicaciones de Ultrasol® Calcium, añadiendo 0,8g/ planta en cada aplicación.
2. Corte apical: a los 100 días se cortó el ápice de todas las plantas, con fin de frenar el crecimiento vegetativo y comenzar con el desarrollo y maduración de frutos.
3. Desbrote: Se realizó desbrote de todas las plantas en la medida que estos eran detectados. 4. Deshoje: a los 120 días de cultivo se cortaron con tijeras todas las hojas por debajo del primer racimo, dejando solo 1 hoja (la más cercana) debajo de éste. Esto, ayuda a la circulación de aire entre las plantas y a mejorar el calibre de los frutos.
4.7 Determinación de parámetros de interés productivo en cultivos
Se determinaron o definieron 2 parámetros generales de interés productivo: 1. longitud, peso y tomates (número) y 2. concentración de clorofila. Los protocolos para cada caso se describen a continuación:
1 . Determinación longitud, peso y tomates (número)
Los tomates fueron evaluados midiendo su peso húmedo inmediatamente después de cosechados en balanza digital. El calibre fue medido con un pie de metro en su diámetro longitudinal y ecuatorial. Los valores fueron registrados en plantillas de trabajo que posteriormente fueron pasados a la base de pesos acumulativos y promedios de diámetros (ecuatorial y longitudinal). Los resultados fueron tabulados y graficados como superficie de respuestas en Excel (Office 365) y analizados estadísticamente con la prueba LSD (a=0,05) en el programa Statgraphic Centurion XVI (Statgraphics Technologies, Inc, EEUU).
2. Determinación de Clorofila La clorofila fue medida retirando las 3 primeras hojas verdaderas que vienen por debajo del ápice de cada planta. De éstas se retiró un segmento desde el centro de la hoja, pegado a la nervadura central, sin contar ésta última hasta completar 80 mg de hojas según la metodología propuesta por Wellburn (1994). Para la cuantificación de clorofila A y B: las hojas recolectadas se congelaron y almacenaron a -20°C, luego para cada cuantificación, se agregaron 0,5 mi de dimetilsulfóxido (DMSO, EMSIIRE®) a 80 mg de hojas pulverizadas en nitrógeno líquido en un microtubo cubierto con papel de aluminio. La solución se homogenizó con Vortex. Luego se agregaron 0,5 mi adicionales de DMSO, y la mezcla se incubó en un baño de agua a 65°C durante dos horas, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos. Finalmente, el contenido se centrifugó para evitar interferentes por sólidos en suspensión, y la absorbancia se midió utilizando un espectrofotómetro (Bioware WPA). El contenido de clorofila se calculó utilizando las siguientes fórmulas (Wellburn 1994): Formula 1 : Clorofila a (μg mL-1) = 12.47 * A665.1 - 3.62 * A649.1 Formula 2: Clorofila b (μg mL-1) = 25.06 * A649.1 - 6.5 * A665.1
4.8 Resultados del ensayo
De forma general, los tratamientos mostraron efectos cualitativos y cuantitativos.
Desde el punto de vista cualitativo, para los distintos tratamientos de la mezcla de bacterias, se observó un patrón robusto con abundante masa foliar y menor tamaño de la planta. No fueron evaluados el peso fresco, peso seco y longitud de la planta en este ensayo debido a que todos los tratamientos fueron desbrotados, deshojados y les fue removido el ápice principal para detener su crecimiento apical y favorecer la maduración de los frutos.
En cuanto al calibre de los tomates, hasta la séptima semana de cosecha, los calibres no poseen diferencia estadística significativa entre la mayoría de los tratamientos, diferenciándose solo en algunos tratamientos extremos, p. Ej. Testigo vs Mezcla. El promedio de los calibres se encuentra entre 40 a 50 mm.
El parámetro de peso acumulativo de tomates por tratamiento presentó diferencias estadísticas significativas entre la mayoría de los tratamientos hasta la séptima semana de cosecha. El tratamiento que presentó una respuesta con diferencia estadística significativa con respecto a todos los otros tratamientos fue la Mezcla WP de bacterias con 66% de fertilización con un pico que supera los 900 g superando ampliamente a los tratamientos testigos y comercial (figura 16).
Finalmente, cuando se determinó la concentración de clorofila (μg/mL) en la séptima semana de cosecha se observaron diferencias estadísticas significativas entre la mayoría de los tratamientos. El tratamiento que presentó una respuesta con diferencia estadística significativa con todos los otros tratamientos fue la Mezcla PLP 100% de fertilización, superando los 250 μg/mL de clorofila (figura 17).
Ejemplo 5. Estudio de predicción de compuestos y enzimas antimicrobianas de Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529
Se secuenció, ensambló y analizó el genoma de Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529.
Mediante análisis bioinformático se identificaron y predijeron genes que participan en la síntesis de diferentes péptidos ribosomales y no ribosomales.
En la tabla 15 se presentan los resultados obtenidos para B. safensis RGM 2450 respecto de los compuestos antimicrobianos que secretaría B. y potenciales fitopatógenos blancos. En la tabla 16 se describen las potenciales enzimas que secretaría.
B. safensis RGM 2450 tiene la capacidad de producir compuestos antimicrobianos como microcinas.
De acuerdo con el análisis cuando se compara el agrupamiento génico de la cepa RGM 2450 con el agrupamiento génico de la cepa B. pumilus ATCC 7061 y B. venelenzis FZB42 que participan en la síntesis de plantazolicina, es posible determinar que la cepa RGM 2450 presenta 11 de los 12 genes del agrupamiento génico pzn que participan en la síntesis y transporte de la microcina plantazolicina (Fig. 18). Se ha descrito que esta microcina tiene actividad antibacteriana contra bacterias tales como Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, otras especies de Bacillus, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans (tabla 15). B. safensis RGM 2450 tiene la capacidad de producir el peptido no ribosomal bacilibactica. De acuerdo con el análisis del genoma de RGM 2450 se predijo el agrupamiento génico DhbACEBF (Fig. 19A) que participa en la síntesis y ensamblaje del sideróforo bacilibactica junto con los genes que participan en el transporte (FeuABC-YusV) y en la hidrólisis del sideróforo para la liberación del Fe+3 (Fig 19B). Bacillibactina ha sido reconocido previamente por presentar actividad inhibitoria contra el hongo F. oxysporum f. sp. Capsica (tabla 15).
Con el análisis, se predijo también la potencial producción de ciclolipopéptido. Particularmente, se predijo un agrupamiento génico de 46.673 pb que consta de 5 genes biosintéticos que codifican proteínas modulares que conforman una sintetasa de péptido no ribosomal (Fig. 20A). En base a la predicción bioinformática la sintetasa de péptido ribosomal esta codificada por 5 genes de los cuales el gen 1 (10.707 pb) codifica una proteína multimodular que participarían en la síntesis de un péptido de 3 aminoácidos (leucina-leucina-glutamina), el gen 2 (10.701 pb) codifica la síntesis de un segundo modulo que participa en la síntesis de un péptido de tres aminoácidos (leucina-ácido aspártico- X (no se pudo predecir)), el gen 3 participa en la adición del aminoácido isoleucina, el gen 4 presenta dos módulos que permitiría la adición del aminoácido valina y de una molécula de acetil CoA, la cual podría participar en la delación del péptido. El gen 5 presenta dos módulos que participan en la adición de otro aminoácido (X) y de un ácido graso (Fig 20B y 20C), antecedentes que sugieren que la potencial estructura que se podría formar es un ciclolipopéptido.
Luego, para definir que moléculas podrían corresponder a este potencial ciclolipopéptido que produciría la cepa RGM 2450 se realizó la búsqueda y comparación del agrupamiento génico en otras cepas secuenciadas, observándose un alto grado de conservación (sintenia) en las especies B. safensis y B. pumilus, sugiriendo que cumple un rol importante en el metabolismo secundario (Fig. 21A). Aunque parte de los genes presentan homología con el agrupamiento que participa en la síntesis del surfactante lichensina descrita en B. licheniformis DSM 13 (Fig. 21 B).
Cuando se realizó la predicción de la síntesis del antibiótico bacilisina mediante el análisis bioinformático se identificaron los genes que fueron parte del agrupamiento génico bacABCDE que participa en su síntesis (Fig. 22A). Este compuesto es un antibiótico dipéptido que consiste en un residuo de L-alanina que está unido un aminoácido no proteinógeno, L-anticapsina (Fig 22B). El agrupamiento génico que participa en la síntesis de bacilisina como su vecindario génico se encuentran altamente conservados en Bacillus cercanas filogenéticamente a B. safensis (Fig 22C).
Además, B. safensis RGM 2450 puede potencialmente secretar diversas enzimas tales como proteasas, metaloproteasas, lipasas, entre otros (tabla 16).
Tabla 15. Compuestos que secretaría B. safensis RGM 2450 y potenciales fitopatógenos blancos.
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Tabla 16. Potenciales enzimas que secretaria B. safensis RGM 2450.
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Por su parte, B. siamensis RGM 2529 secretaría bacteriocinas tales como amilociclicina. En base al análisis del genoma de la cepa RGM 2529, se predijo el agrupamiento génico acnABCDEF de 4.170 pb que participarían en la síntesis, maduración y autoprotección del péptido antimicrobiano (bacteriocina) amilociclicina (Fig. 23A). El agrupamiento génico acnABCDEF que codifica aminociclina ha sido encontrado en cepas de la especie Bacillus amylolíquefacíens y B. velezensis que ha sido ampliamente descritas por su actividad PGPR (Fig 23B). En la literatura se ha descrito que amilociclicina tiene actividad antibacteriana contra Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, B. pumilus, Bacillus sphaericus, B. subtilis, Clavibacter michiganensis, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans y Paenibacillus polymyxa (tabla 17)
A partir de los análisis, se demuestra que B. siamensis RGM 2529 presenta el agrupamiento génico DhbACEBF que participa en la síntesis de bacilibactina (figura 24), un sideróforo con actividad antifúngica contra F. oxysporum f. sp. Capsica (tabla 17). Presenta también, los 4 genes (surfAA, surfAB, surfAC y surfAD) que participan en la biosíntesis y ensamblaje de los aminoácidos que componen la surfactina (figura 25A). Según el análisis del agrupamiento génico de surfactina en cepas cercanas filogeneticamente a la cepa RGM 2529 (figura 25B), al comparar el homólogo de surfAB de B. velezensis ZB42 con el de RGM 2529 se obtiene un 94,95% de identidad y 73% de cobertura. Mientras, el gen surfAC codifica una sintetasa de péptido ribosomal que consta de 1 módulos que participan en el ensamblaje de leucina. Al comparar el homólogo de surfAC de B. amyloliquefaciens ZB42 con el de RGM 2529 se obtiene un 94,95% de identidad y 100% de cobertura. Finalmente, el gen surfAD codifica a una tioesterasa. Al comparar el homólogo de surfAD de B. velezensis ZB42 con el de RGM 2529 se obtiene un 95,36% de identidad y 100% de cobertura.
En el caso de fengicina, un compuesto descrito previamente como antifúngico, también se predijo un agrupamiento génico de 49.465 pb que participaría en la síntesis de este lipopéptido. Este agrupamiento génico está constituido por 5 genes (fenA, fenB, fenC, fenD y fenF) que codifican a las sintetasas de péptido no ribosomal que ensamblan este ciclolipopéptido junto con otros genes que participan en su modificación estructural (Fig 25A). Este agrupamiento génico se ha encontrado en cepas pertenecientes a las especies B. amyloliquefaciens, B. velezensis y B. siamensis (Fig 25B). El ensamblaje de los aminoácidos por sintetasas da origen a un ciclodecapeptido que junto con la acción de la enzima ligasa de ácidos grasos (Acetil CoA ligasa de ácidos grasos de cadena larga) forman un ciclolipopéptido (figura 26C).
Contiguo al agrupamiento génico que participa en la síntesis de fengicina se encontró el operón bamABCD que participa en la síntesis de otro lipopéptidos bacilomicina D (Fig 27A). Este operón abarca 37.696 pb y ha sido descrito en las especies B. amyloliquefaciens, B. velezensis y B. siamensis (Fig 27B).
Se ha descrito que bacilomicina D puede eliminar hongos de diferentes géneros y especies, entre ellos Alternaría alternata, Alternaría solani, Botrytis cinérea, Aspergillus flavus' Botryosphaerica ribis, C. albicans, Cryphonectria parasitica, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloesporioides, Didymella bryoniae, Fusarium graminearum, Fusarium sambucinum, Fusarium oxysporum, Podosphaera fusca , Pythium sulcatum , Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, R hizo pus sp., Sclerotinia sclerotiorum, Ustilago maydis , Monilinia fructicola, Penicillium expansum, Phomopsis gossypii, Phytophthora capsici, Pyricularia grísea, R. solani, Sclerotium rolfsii Sclerotinia sclerotiorum (tabla 17).
Se predijo también un agrupamiento génico 72.346 pb (Fig. 28A) que codifica un híbrido entre una poliquétido sintasa y una sintetasa de péptido no ribosomal (PKS-NRPS) que participa en la producción del antibiótico bacillaeno, un inhibidor de la síntesis de proteínas procariotas. La bacilano sintasa de la cepa RGM 2529 se compone de 13 módulos PKS y 3 módulos NRPS al igual que las descritas en velezensis FZB42 y Bacillus subtilis 168 (Fig 28B).
Por lo tanto, B. siamensis RGM 2529 puede producir potencialmente el compuesto antibacteriano y antifúngico bacilaeno, para el cual se ha descrito tiene potencial de acción contra bacterias tales como B. thuríngiensis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, M. xanthus, P. vulgaris, Serraría marcescens, S. aureusy). En el caso de hongos, se ha descrito que bacilaeno presenta actividad inhibitoria contra Coriolopsis spp. Fusarium sp, Pseudoxylaria sp., Trichoderma sp., Umbelopsis sp (tabla 17).
Finalmente, B. siamensis RGM 2529 también sería capaz de secretar enzimas del tipo proteasa, lipasa, lactonasa y celulasa (tabla 18).
Tabla 17. Compuestos que secretaría B. siamensis RGM 2529 y potenciales fitopatógenos blancos.
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Tabla 18. Potenciales enzimas que secretaría B. siamensis RGM 2529.
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Bibliografía:
Mayak S., Tirosh T., Glick B. R. 2004. Plant growth promoting bacteria that confer resistance to water stress in tomato and pepper. Plant Sci. 166; 525-530. Criollo P, Obando M, Sanchez L, Bonilla R. (2012) Effect of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) associated to Pennisetum clandestinum in the altiplano cundiboyacense. Corpoica cieno, tecnol. agropecu. vol.13 no.2
Altier N, Beyhaut E, Dalla M, Rivas F. (2012). Sustentabilidad ambiental: Plataforma de bioinsumos de uso agrícola en base a microorganismos benéficos. Revista I NIA Uruguay N°29, 47-50.
Hayat R, Ali S, Amara U, Khalid R, Ahmed I (2010) Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: a review. Ann Microbiol 60(4), 579-598.
Etesami H, Emami S, Alikhani HA. (2017). Potassium solubilizing bacteria (KSB): Mechanisms, promotion of plant growth, and future prospects - A review. Journal of soil science and plant nutrition, 17: 897-911
Yadav S., Kaushik R., Saxena A.K. & Arora D.K. 2011. Genetic and functional diversity of Bacillus strains in the soils longterm irrigated with paper and pulp mill effluent. J. Gen. Appl. Microbiol. 57: 183-195.
Chakraborty U., Chakraborty B.N., Chakraborty A.P. & Dey P.L. 2013. Water stress amelioration and plant growth promotion in wheat plants by osmotic stress tolerant bacteria. World J. Microbiol Biotechnol. 29: 789-803.
Kavamura V.N., Santos S.N., Silva J. L, Parma M.M., Avila L.A., Visconti A., Zucchi T.D., Taketani R.G., Andreote F.D. & Melo I.S. 2013. Screening of Brazilian cacti rhizobacteria for plant growth promotion under drought. Microbiol. Res. 168: 183- 191
Sun H., He Y., Xiao Q., Ye R. & Tian Y. 2013. Isolation, characterization, and antimicrobial activity of endophytic bacteria from Polygonum cuspidatum. Afr. J. Microbiol. Res. 7: 1496-1504
Jeong H, Jeong DE, Kim SH, Song GC, Park SY, Ryu CM, Park SH, Choi SK. 2012. Draft Genome Sequence of the Plant Growth-Promoting Bacterium Bacillus siamensis KCTC 13613. J Bacteriol. 194:4148-4149. doi: 10.1128/JB.00805-12. Wu, L, Wu, H. J., Qiao, J., Gao, X., and Borriss, R. (2015). Novel routes for improving biocontrol activity of Bacillus based bioinoculants. Front. Microbiol. 6:1395.
Haeyoung Jeong, Da-Eun Jeong, Sun Hong Kim, Geun Cheol Song, Soo-Young Park, Choong-Min Ryu, Seung-Hwan Park y Soo-Keun Choi (2012). Draft Genome
Sequence of the Plant Growth-Promoting Bacterium Bacillus siamensis KCTC 13613. J Bacteriol. 194(15): 4148-4149.
Borriss, R. (2011). “Use of plant-associated Bacillus strains as biofertilizers and biocontrol agents,” in Bacteria in Agrobiology: Plant Growth Response, ed D. K. Maheshwari (Heidelberg: Springer), 41-76.
Agbaje Lateef, Isiaka Adedayo Adelere y Evariste Bosco Gueguim-Kana. (2015). The biology and potential biotechnological applications of Bacillus safensis. Biología 70/4: 411 — 419, 2015 Section Cellular and Molecular Biology.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una formulación agrícola para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas CARACTERIZADA porque comprende al menos: a) Una cepa bacteriana Bacillus safensis depósito RGM 2450, y/o b) Una cepa bacteriana Bacillus siamensis depósito RGM 2529, y c) Excipientes de uso agrícola.
2. Una formulación agrícola para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque la cepa bacteriana Bacillus siamensis deposito RGM 2529 se encuentra en una concentración o cantidad de 3,0x106 - 4,0x109 UFC/g en la formulación.
3. Una formulación agrícola para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque la cepa bacteriana Bacillus safensis depósito RGM 2450 se encuentra en una concentración o cantidad de 5,0x106 - 4x109 UFC/g en la formulación.
4. Una formulación agrícola para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 CARACTERIZADA porque los excipientes de uso agrícola pueden corresponder, sin limitarse, a harina de trigo, fécula de maíz, gelatina, almidón de papa, dióxido de silicio, ácido cítrico, bicarbonato, polisorbatos como Tweens, lactosa, lecitina de soya, caseína, carboximetil celulosa o goma de celulosa, esteres de sacarosa, manitol, sorbitanos, F68 plurónico, alginato, goma xantan, PEG (polietilenglicol), sirope de maíz, huevo, leche, glicerol, fructosa, pectinas, aceite mineral, goma de éster, triglicéridos de cadena larga.
5. Una formulación agrícola para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 CARACTERIZADO porque la formulación se presenta como una pastilla de liberación prolongada.
6. Una formulación agrícola para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 CARACTERIZADO porque la formulación se presenta como un sólido en polvo mojable.
7. Una formulación agrícola para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 CARACTERIZADO porque la formulación se presenta como una pastilla efervescente.
8. Una formulación agrícola para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con las reivindicaciones 1-7 CARACTERIZADO porque la formulación se presenta como una resuspensión o emulsión de las cepas bacterianas o mezclas de estos.
9. Uso de una formulación agrícola de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 CARACTERIZADO porque dicha formulación sirve para aumentar la fijación de nitrógeno de un cultivo.
10. Uso de una formulación agrícola de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 CARACTERIZADO porque dicha formulación sirve para aumentar la solubilización de fósforo, potasio y capacidad de producción de fitohormonas de un cultivo.
11. Uso de una formulación agrícola de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 CARACTERIZADO porque dicha formulación sirve como agente de control o biocontrolador de patógenos en un cultivo.
12. Uso de una formulación agrícola de acuerdo con las reivindicaciones 11 CARACTERIZADO porque dicha formulación sirve como agente bioprotector y/o biocontrolador de patógenos de un cultivo como Fusarum sp., Phytophthora sp., Collectotrichum sp. y Botrytis sp.
13. Uso de una formulación agrícola de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 CARACTERIZADO porque dicha formulación sirve como agente bioprotector y/o biocontrolador de cultivos ante patógenos tales como S. aureus ATCC 25923, M. luteus CMCC 28001, B. pumilus CMCC 63202, B. cereus ATCC 14579, B. subtilis ATCC 168, L. monocytogenes CICC 21662, E. faecalis ATCC 29212 y P. fluorescens ATCC 49642, B. thuringiensis, Klebsiella pneumoniae, M. xanthus, P. vulgaris, Serratia marcescens, S. aureus, L. pneumophila, L. monocytogenes , P. syringae , R. solanacearum , Xanthomonas axonopodis pv. Glycines, B. brevis, B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. sphaericus, B. subtilis, C. michiganensis, M. luteus, P. granivorans, P. polymyxa, Coriolopsis spp. Fusarium sp, Pseudoxylaria sp., Trichoderma sp., Umbelopsis sp., F. oxysporum f. sp. Capsica, A. niger, F. solani, M. fructigena, Pennicilium expansum, P. italicum, R. solani, Alternaría alternata, A. solani, Aspergillus flavus Botryosphaerica ribis , C. albicans, C. parasitica, C. acutatum, C. gloesporioides, Didymella bryoniae, F. graminearum, F. oxysporum, Ustilago maydis, Monilinia fructicola, P. expansum, P. gossypii, P. capsici, P. grísea, R. solani, S. rolfsii, S. sclerotiorum, A. solani, B. cinérea, F. graminearum, F. sambucinum, F. oxysporum, P. fusca, P. sulcatum, P. ultimum, R. solani, Rhizopus sp., S. sclerotiorum, C. michiganense subsp. sepedonicum, E. amylovora, E. coli, S. typhi, S. pyogenes, C. albicans, M. aeruginosa, P. infestans, S. cerevisiae, A. fumigatus.
14. Uso de una formulación agrícola de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 CARACTERIZADO porque dicha formulación sirve como agente para aumentar la concentración de clorofila en un cultivo o planta.
15. Uso de una formulación agrícola de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 CARACTERIZADO porque dicha formulación sirve como agente para aumentar el crecimiento y/o rendimiento de un cultivo.
16. Método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas CARACATERIZADO porque comprende aplicar una cantidad efectiva de la formulación agrícola descrita en las reivindicaciones 1-8 sobre un cultivo.
17. Método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con la reivindicación 16 CARACTERIZADO porque comprende la aplicación de la formulación agrícola en forma de resuspensión, emulsión, pastilla efervescente, pastilla de liberación prolongada, polvos mojables o mezclas de los mismos.
18. Método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con las reivindicaciones 16 y 17 CARACTERIZADO porque su aplicación es por asperjación o inmersión directa de la semilla del cultivo objetivo en la formulación.
19. Método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con la reivindicación 18 CARACTERIZADO porque la semilla se impregna en un tampón y es sumergida por completo en una formulación que comprende una concentración de 109 UFC/mL de la mezcla de bacterias.
20. Método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con las reivindicaciones 16 y 17 CARACTERIZADO porque su aplicación se realiza en la base del tallo de las plantas.
21. Método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con la reivindicación 20 CARACTERIZADO porque su aplicación se realiza en la base del tallo de las plantas a una concentración de 108 UFC/mL.
22. Método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas de acuerdo con la reivindicación 16- 21 CARACTERIZADO porque la formulación puede ser administrada en conjunto con fertilizantes.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220167710A (ko) * 2021-06-14 2022-12-21 대한민국(농촌진흥청장) 토마토 시들음병 및 궤양병을 유발하는 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스에 의한 피해를 감소시키는 바실러스 시아멘시스 k203 및 이의 용도

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140079201A (ko) 2012-12-18 2014-06-26 대한민국(농촌진흥청장) 항균 활성을 갖는 바실러스 사펜시스 hc42 균주
CN106119146A (zh) 2016-06-03 2016-11-16 青岛中达生物技术有限公司 一种沙福芽孢杆菌及其生物防治制剂和应用
CN108330092A (zh) 2018-04-03 2018-07-27 刘若晗 一株具有促生功能的沙福芽孢杆菌及其菌剂与应用
CN108865934A (zh) 2018-07-04 2018-11-23 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种沙福芽孢杆菌hmd9204及其菌剂和应用
CN109456915A (zh) 2018-11-20 2019-03-12 河南农业大学 一种沙福芽孢杆菌株x3及其应用
CN109468243A (zh) 2018-11-13 2019-03-15 河北农业大学 一株暹罗芽孢杆菌及其应用
KR20190061210A (ko) 2017-11-27 2019-06-05 경북대학교 산학협력단 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140079201A (ko) 2012-12-18 2014-06-26 대한민국(농촌진흥청장) 항균 활성을 갖는 바실러스 사펜시스 hc42 균주
CN106119146A (zh) 2016-06-03 2016-11-16 青岛中达生物技术有限公司 一种沙福芽孢杆菌及其生物防治制剂和应用
KR20190061210A (ko) 2017-11-27 2019-06-05 경북대학교 산학협력단 질소 저감 활성을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 1HC-NA 균주 및 이를 이용한 질소 저감용 미생물 제제
CN108330092A (zh) 2018-04-03 2018-07-27 刘若晗 一株具有促生功能的沙福芽孢杆菌及其菌剂与应用
CN108865934A (zh) 2018-07-04 2018-11-23 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种沙福芽孢杆菌hmd9204及其菌剂和应用
CN109468243A (zh) 2018-11-13 2019-03-15 河北农业大学 一株暹罗芽孢杆菌及其应用
CN109456915A (zh) 2018-11-20 2019-03-12 河南农业大学 一种沙福芽孢杆菌株x3及其应用

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGBAJE LATEEFISIAKA ADEDAYO ADELEREEVARISTE BOSCO GUEGUIM-KANA: "The biology and potential biotechnological applications of Bacillus safensis", 2015 SECTION CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 70, no. 4, 2015, pages 411 - 419, XP009537957, DOI: 10.1515/biolog-2015-0062
ALTIER NBEYHAUT EDALLA MRIVAS F: "Environmental Sustainability: Platform for bio-inputs for agricultural use based on beneficial microorganisms", INIA URUGUAY MAGAZINE, no. 29, 2012, pages 47 - 50
BORRISS, R: "Bacteria in Agrobiology: Plant Growth Response", 2011, article "Use of plant-associated Bacillus strains as biofertilizers and biocontrol agents", pages: 41 - 76
CHAKRABORTY UCHAKRABORTY B.N.CHAKRABORTY A.P.DEY P.L.: "Water stress amelioration and plant growth promotion in wheat plants by osmotic stress tolerant bacteria", WORLD J. MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 29, 2013, pages 789 - 803
CRIOLLO POBANDO MSANCHEZ LBONILLA R: "Effect of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) associated to Pennisetum clandestinum in the highlands of Cundiboyacense", AGRICULTURE TECHNOLOGY, vol. 13, no. 2, 2012
ETESAMI HEMAMI SALIKHANI HA: "Potassium solubilizing bacteria (KSB): Mechanisms, promotion of plant growth, and future prospects - A review", JOURNAL OF SOIL SCIENCE AND PLANT NUTRITION, vol. 17, 2017, pages 897 - 911, XP055861657, DOI: 10.4067/S0718-95162017000400005
HAEYOUNG JEONGDA-EUN JEONGSUN HONG KIMGEUN CHEOL SONGSOO-YOUNG PARKCHOONG-MIN RYUSEUNG-HWAN PARKANDSOO-KEUN CHOI: "Draft Genome Sequence of the Plant Growth-Promoting Bacterium Bacillus siamensis KCTC 13613", J BACTERIOL, vol. 194, no. 15, 2012, pages 4148 - 4149
HAY AT RALI SAMARA UKHALID RAHMED I: "Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: a review", ANN MICROBIOL, vol. 60, no. 4, 2010, pages 579 - 598
KAVAMURA V.N.SANTOS S.N.SILVA J.L.PARMA M.M.AVILA L.A.VISCONTI AZUCCHI T.D.TAKETANI R.G.ANDREOTE F.D.MELO I.S.: "Screening of Brazilian cacti rhizobacteria for plant growth promotion under drought", MICROBIOL. RES., vol. 168, 2013, pages 183 - 191, XP029005373, DOI: 10.1016/j.micres.2012.12.002
LATEEF AGBAJE, ADELERE ISIAKA ADEDAYO, GUEGUIM-KANA EVARISTE BOSCO: "The biology and potential biotechnological applications of Bacillus safensis", BIOLOGIA, vol. 70, no. 4, 30 December 2015 (2015-12-30), DE , pages 411 - 419, XP009537957, ISSN: 0006-3088, DOI: 10.1515/biolog-2015-0062 *
MAYAK STIROSH TGLICK B. R.: "Plant growth promoting bacteria that confer resistance to water stress in tomato and pepper", PLANT SCI, vol. 166, 2004, pages 525 - 530
NGO VAN ANH, WANG SAN-LANG, NGUYEN VAN BON, DOAN CHIEN THANG, TRAN THI NGOC, TRAN DINH MINH, TRAN TRUNG DZUNG, NGUYEN ANH DZUNG: "Phytophthora Antagonism of Endophytic Bacteria Isolated from Roots of Black Pepper (Piper nigrum L.)", AGRONOMY, vol. 10, no. 2, pages 286, XP055947797, DOI: 10.3390/agronomy10020286 *
SUN HHE YXIAO QYE RTIAN Y: "Isolation, characterization, and antimicrobial activity of endophytic bacteria from Polygonum cuspidatum", AFR. J. MICROBIOL. RES., vol. 7, 2013, pages 1496 - 1504
WU, LWU, H. J.QIAO, JGAO, XBORRISS, R: "Novel routes for improving biocontrol activity of Bacillus based bioinoculants", FRONT. MICROBIOL, vol. 6, 2015, pages 1395
YADAV SKAUSHIK RSAXENA A.K.ARORA D.K.: "Genetic and functional diversity of Bacillus strains in the soils longterm irrigated with paper and pulp mill effluent", J. GEN. APPL. MICROBIOL., vol. 57, 2011, pages 183 - 195
ZHANG, X. ET AL.: "Control effects of Bacillus siamensis G-3 volatile compounds on raspberry postharvest diseases caused by Botrytis cinerea and Rhizopus stolonifer", BIOLOGICAL CONTRO L, vol. 141, 2020, pages 104135, XP085966627, DOI: 10.1016/j.biocontrol.2019.104135 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220167710A (ko) * 2021-06-14 2022-12-21 대한민국(농촌진흥청장) 토마토 시들음병 및 궤양병을 유발하는 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스에 의한 피해를 감소시키는 바실러스 시아멘시스 k203 및 이의 용도
KR102525964B1 (ko) 2021-06-14 2023-04-28 대한민국 토마토 시들음병 및 궤양병을 유발하는 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스에 의한 피해를 감소시키는 바실러스 시아멘시스 k203 및 이의 용도

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