WO2016019480A1 - Cepa bacteriana paenibacillus polymyxa schc33, y su uso para combatir hongos fitopatogenicos en frutas, hortalizas o plantas - Google Patents

Cepa bacteriana paenibacillus polymyxa schc33, y su uso para combatir hongos fitopatogenicos en frutas, hortalizas o plantas Download PDF

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WO2016019480A1
WO2016019480A1 PCT/CL2015/050031 CL2015050031W WO2016019480A1 WO 2016019480 A1 WO2016019480 A1 WO 2016019480A1 CL 2015050031 W CL2015050031 W CL 2015050031W WO 2016019480 A1 WO2016019480 A1 WO 2016019480A1
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WO
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strain
fruits
plants
paenibacillus polymyxa
schc33
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PCT/CL2015/050031
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Roberto SANTIAGO OLMEDO
Luis Cottet Bustamante
Cesar Huiliñir Curio
Antonio Castillo Nara
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Universidad De Santiago De Chile
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/25—Paenibacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/12—Bacillus polymyxa ; Paenibacillus polymyxa

Definitions

  • the present invention describes a bacterial strain, Paenibacillus polymyxa SCHC33, as a biofungicide against phytopathogenic filamentous fungi, particularly against gray mold, Botrytis cinerea.
  • Said bacterial strain P. polymyxa SCHC33 has important qualities that will allow it to compete with commercial biofungicides of current use. Its fungicidal activity is very potent and independent of the medium in which the bacterium is grown, it is not toxic to humans or vegetables, it grows rapidly in simple culture media with a monod type kinetic behavior without substrate inhibition, so it can be easily produced Large scale and low cost. In addition to the above, its ability to sporulate will allow commercial formulations of high stability and long life.
  • the field of application of this invention includes all fruits, vegetables and ornamental plants that are susceptible to infection by phytopathogenic fungi under pre- and post-harvest conditions.
  • This invention provides an isolated wild bacterial strain, characterized as Paenibacillus polymyxa SCHC33, and its use as a biofungicide. Said bacterial strain was deposited in the Chilean Collection of Genetic Resources Microbials (CChRGM), according to the Budapest treaty for patent purposes.
  • ChRGM Collection of Genetic Resources Microbials
  • RGM2141 The deposit number granted on July 23, 2014, by the deposit authority is RGM2141, being the deposit authority the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources (CChRGM).
  • ChRGM Microbial Genetic Resources
  • the fungicidal capacity of the bacterium is given by the secretion of fungitoxic molecules that interact with the fungus by destroying it and as a consequence, inhibiting the germination of conidia and the proliferation of the fungal vegetative mycelium.
  • Paenibacillus polymyxa SCHC33 is pathogenic or toxic to plants or fruits, nor has it been reported that it would be pathogenic to animals or humans.
  • Experiments carried out in the laboratory reveal that its inoculation in leaves of vine plants does not produce visible alteration in this host after 7 days of incubation at 20 ° C in plates containing only 1.5% agar-agar (w / v ) to maintain moisture at adequate levels.
  • high inoculums of the strain [2 x 10 10 cfu (colony forming unit)] are added to intact or injured grape berries, no effect can be seen after 7 days of incubation under the same conditions described above.
  • the biological agent of the invention corresponds to a wild bacterium, isolated from soils, and has been individualized by biochemical, microbiological, electron microscopy and sequencing of 16S rDNA.
  • P. polymyxa SCHC33 is a Chilean native strain and corresponds to a saprophytic organism, not pathogenic of plants or animals, therefore, the use of its living cells as a biofungicide against B. cinérea is appropriate.
  • the present invention relates to compositions containing said bacterial strain or extracts containing the same, or to solutions or mixtures containing compounds derived therefrom (for example, fungitoxic molecules secreted by said bacterial strain), all of them capable of protect plants and their fruits during pre and post harvest periods, from attack by phytopathogenic microorganisms.
  • compounds derived therefrom for example, fungitoxic molecules secreted by said bacterial strain
  • the present invention also includes any mutant derived from the wild strain that possesses essentially the same or better properties.
  • the invention relates to the process for obtaining said bacterial strain or its derivatives and its applications in the protection of plants, and especially fruits.
  • the present invention provides a formulation for controlling fungal diseases of plants using the pure strain P. polymyxa SCHC33.
  • the use of this bacterium constitutes a natural alternative for synthetic chemical fungicides, ensuring a safer environment to achieve control or eliminate diseases caused by phytopathogenic fungi
  • the present invention provides a composition containing said strain in a form and quantity suitable for its biological activity.
  • the mixture contains non-toxic agents that allow the bacterium to adhere to the plant on which it is inoculated, plant nutrients and preservatives in harmless quantities, and can be found as a liquid suspension or powder obtained by lyophilization.
  • Botrytis cinerea is a phytopathogenic fungus and necrotrophic, infecting plant species of great economic importance, including fruit trees, ornamental plants and vegetables. It produces a disease known as gray rot causing a serious pre and post harvest problem in strawberries, raspberries, Peaches, apples, pears, chestnuts, kiwi and grapes, among other fruits. In the vine this fungus produces cluster rot, a disease that is currently considered as one of the most serious at the level of export fruit production in Chile, since it is capable of causing large losses not only at the field level but also during storage and transfer (Williamson B, Tudzynski B, Tudzynski P, van Kan JA. 2007. Botrytis cinerea: the cause of gray mold disease.
  • Paenibacillus lentimorbus CMC3723 (deposit number KACC91379) is disclosed with the capacity to suppress pathogens in plants, in particular the pear tree rust (pear scab), Botrytis and Sclerotinum cepivorum, in addition to preventing the growth of plant pathogens.
  • Paenibacillus lentimorbus CMC3723 was isolated from the soil and has the effect of suppressing Venturia nashicola, Botrytis cinerea, Sclerotium cepivorum and Colletotrichum acutatum.
  • the agent to prevent diseases caused by these pathogens in plants contains a culture of Paenibacillus lentimorbus CMC3723.
  • a method for isolating, culturing, determining its activity against fungi and phytopathogenic bacteria, identifying Paenibacillus lentimorbus CMC3723 and preparing a culture medium containing it is also described.
  • the bacterial strains Paenibacillus lentimorbus CMC3723 and Paenibacillus polymyxa SCHC33 belong to the same genus, but to totally different species.
  • Paenibacillus polymyxa NBl with antibacterial activity and a composition containing it, useful for preventing diseases caused by plant pathogens.
  • Paenibacillus polymyxa NBl acts as an antagonistic agent against plant pathogens and its deposit number is KFCC 11413P.
  • the plant pathogens described are Colletotrichum acutatum ,. Pythium ultimum, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani AG4 r Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum.
  • the KR20030075092 patent teaches a Paenibacillus sp. SD17 that produces anti-fungal agents for the biological control of plant diseases and a composition for the biological control of plant diseases that contains the microorganism for the effective control of plant diseases.
  • the microorganism Paenibacillus sp. SD17 (KCTC10016BP) produces antifungal agents for the biological control of plant diseases that include diseases caused by Pythium spp. , Rhizoctonia solani AG1-1, Rhizoctonia solani AG 2-2, Phytophthora infestans or Botrytis cinerea.
  • a composition for the biological control of plant diseases that contains 5 to 30% by weight of the culture medium of Paenibacillus sp.
  • SD17 (KCTC-10016BP); 0.2 to 3.0% by weight of an agent that activates spore germination, which corresponds to yeast extract; 0.02 to 0.5% by weight of a water soluble pigment; 1 to 5% by weight of a surfactant and an additive or resin.
  • EP1241247 discloses antagonistic bacteria for plant protection against phytopathogenic bacteria and fungi.
  • the isolated bacteria are of the species Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas chlororaphis,
  • Pseudomonas putida Serratia plymuthica and Bacillus subtilis. They can be applied as a mixture or separately for the control, for example, of the following plant diseases: crown gall caused by Agrobacterium tumefaciens in grapes; diseases caused by Corynebacterium spp., Pseudomonas syringae and Xanthomonas campestris, in tomato and cabbage. Diseases caused by botrytis cinérea in cucumber and tomato; Oidio caused by Erysiphales spp.
  • strain SCHC33 produces a halo of inhibition of greater diameter and therefore, its fungicidal activity is greater.
  • Figure 1 corresponds to scanning electron micrographs of Paenibacillus polymyxa SCHC33.
  • material secreted by bacteria corresponding to a bio-film formed by exopolysaccharides, is clearly observed.
  • B there is a cluster of bacilli surrounded by ellipsoidal spores obtained from liquid culture.
  • Figure 2 is a transmission electron micrograph of Paenibacillus polymyxa SCHC33. Dividing cells and their corresponding peritrial flagella are observed.
  • Figure 3 shows the partial nucleotide sequence of Paenibacillus polymyxa SCHC33 16S rDNA.
  • Figure 4 corresponds to confrontation bioassays of Paenibacillus polymyxa SCHC33 against cinematic Botrytis.
  • A the result of the bioassay performed in a minimum glucose free medium is shown.
  • B the result of the bioassay carried out in a culture medium containing glucose as a carbon source.
  • Figure 6 shows the bacterial growth and glucose consumption curves for an initial concentration of glucose 2 [g / L].
  • A the increase in biomass and glucose consumption over time can be seen.
  • B corresponds to the semilogarithmic curve of biomass over time.
  • Figure 7 shows the effect curve of the initial glucose concentration on the specific growth rate of Paenibacillus polymyxa SCHC33.
  • Figure 8 shows the experimental growth curve and the fit of the evaluated kinetic models (Monod, Moser and Tessier models).
  • Figure 9 the region of the 16S rDNA that was amplified by PCR and from which its sequence was obtained is schematized. In red primers used for PCR. In blue primers used for sequencing.
  • Figure 10 shows the 2-liter bioreactor with constant aeration that was used to determine the kinetic parameters of the growth of Paenibacillus polymyxa SCHC33.
  • the SCHC33 strain corresponds to the polymyxa species and the genus Paenibacillus. Its characterization by means of microbiological and biochemical tests is that presented in Table 1. It produces colorless / white colonies without pigmentation in agar-papa-dextrose (PDA) and in MLG medium (malt extract 10 g / L, glucose 2 g / L, agar-agar 15 g / L).
  • PDA agar-papa-dextrose
  • MLG medium malt extract 10 g / L, glucose 2 g / L, agar-agar 15 g / L.
  • the cultures consist of mobile Gram-positive bacilli, while at the level of scanning electron microscopy (SEM), bacillary morphology with a cell size in the range of 3 to 5 ⁇ in length was clearly observed. 0.5 to 0.8 ⁇ in diameter (see figure 1). Likewise, clusters of cells bound by a material with adhesive characteristics corresponding to exopolysaccharides were clearly observed. (EPS), those that allow the formation of biofilms (see figure 1A), very important for the adhesion of the bacteria to the surface of the plant that you want to protect against the attack of phytopathogenic organisms (bacteria or fungi).
  • SEM scanning electron microscopy
  • Plating bioassays were performed in which a fungal mycelium disc was placed at the center of the Petri dish and the bacteria were inoculated at the ends of the plate (see figure 4). The halos of fungus growth inhibition were clearly observed, both in a medium without glucose (see Figure 4A) and in a medium containing this monosaccharide (see Figure 4B).
  • culture media such as agar-papadextrose (PDA); Luria Bertani medium containing 0.5% yeast extract, 1% tryptone and 0.5% NaCl; ML medium containing 1.5% malt extract and 0.7% yeast extract, among others, the fungicidal activity remains intact.
  • the negative control presented small areas of necrosis attributed to the wounds caused in order to facilitate infection and the positive control, in which only conidia of the fungus was inoculated, suffered an infection by the cinematic Botrytis that covered practically 100% of the surface of the leaves.
  • Paenibacillus polymyxa SCHC33 using a ratio of conidia: bacteria of 1:10, the damage produced by the fungus only covered 20.5% of the leaf surface, decreasing to 11.7% when The ratio was 1: 100.
  • the second method was to sow 8 pieces of mycelium 5 mm in diameter at equidistant points from the center of the Petri dish, where the bacterial isolate was inoculated. Again the growth was observed for 7 days at 20 ° C. As a control, the same tests were performed replacing bacterial isolates with sterile water.
  • PCR For PCR, 10 ng of genomic DNA, 0.5 ⁇ of each first, 200 ⁇ dNTPs, 2.5 U of DNA polymerase, reaction buffer IX and 1.5 mM MgCl 2 were used in a total volume of 50 ⁇ L .
  • the cycles consisted of an initial stage of denaturation of 4.5 minutes at 95 ° C and 40 cycles of 1 min at 95 ° C, 1 min at 60 ° C and 2 min at 72 ° C, ending in a 5 min stage at 72 ° C.
  • PCR products were resolved by gel electrophoresis 1% agarose (w / v).
  • the pair of primers 27F / 800R was used (see figure 9) and the sequences obtained were analyzed by BlastN.
  • samples of Paenibacillus polymyxa SCHC33 were prepared for visualization and analysis by scanning and transmission electron microscopy.
  • samples of liquid bacterial cultures were used, which were prepared by the technique of metallic shading with gold.
  • transmission electron microscopy negative stains were performed with 1% potassium phosphotungstate (w / v), pH 7.0 to samples of liquid bacterial cultures and visualized in the Phillips Tecnai 12 Bio Twin microscope at 80 kV
  • the increase in biomass was recorded every 30 minutes as the optical density of the bacterial culture at a wavelength of 600 nm, and using the Liquicolor ® commercial kit, the decrease in dissolved glucose in the medium was measured.
  • bacterial growth and glucose consumption graphs were constructed over time, and semi-logarithmic graphs to calculate the specific growth rate ( ⁇ ) of Paenibacillus polymyxa SCHC33, when glucose is used as the main substrate.
  • the value of the affinity constant per substrate (K s ) and the biomass yield per substrate (Y x / S ) were obtained from the same experimental data.
  • V c Values calculated based on the model
  • leaves inoculated only with conidia and leaves inoculated only with bacteria were prepared, in addition to a control consisting of leaves inoculated only with sterile water and a control using the active principle of the commercial biofungicide called Serenade ® , Bacillus subtilis QST 713 (Table 6) .
  • the results were analyzed qualitatively, determining the presence or absence of mycelium growth of Botrytis cinerea on the surface of the clusters. The observations were made during a 30 day incubation period at 20 ° C.

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Abstract

Composición biofungicida proveniente de un cultivo biológicamente puro de un aislado bacteriano chileno obtenido de suelos de la séptima región del Maule, Chile, correspondiente a Paenibacillus polymyxa SCHC33, cepa con el número de depósito RGM2141 otorgada por la autoridad de depósito de la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), para ser utilizado como agente de control biológico, amigable con el medio ambiente, contra enfermedades fúngicas de vegetales, particularmente frutos susceptibles a la infección por Botrytis cinerea, inhibiendo en forma eficiente la germinación de conidios y la proliferación del micelio de dicho hongo fitopatógeno, además, protege a hojas de plantas y frutos de la infección por el mismo hongo, y tiene el potencial para ser usado en el control biológico de otros hongos y en general de microorganismos fitopatógenos.

Description

CEPA BACTERIANA PAENIBACILLUS POLYMYXA SCHC33, Y SU USO PARA COMBATIR HONGOS FITOPATOGENICOS EN FRUTAS, HORTALIZAS O PLANTAS.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe una cepa bacteriana, Paenibacillus polymyxa SCHC33, como biofungicida contra hongos filamentosos fitopatógenos , particularmente contra el moho gris, Botrytis cinérea. Dicha cepa bacteriana P. polymyxa SCHC33 posee cualidades importantes que le permitirán competir con los biofungicidas comerciales de uso actual. Su actividad fungicida es muy potente e independiente del medio en que se cultive la bacteria, no es tóxica para humanos ni vegetales, crece rápidamente en medios de cultivos simples con un comportamiento cinético tipo Monod sin inhibición por sustrato, por lo que se podrá producir fácilmente a gran escala y a un bajo costo. Sumado a lo anterior, su capacidad de esporular permitirá realizar formulaciones comerciales de alta estabilidad y larga vida útil .
El campo de aplicación de esta invención comprende a todos los frutos, hortalizas y plantas ornamentales que son susceptibles a la infección por hongos fitopatógenos en condiciones de pre- y post-cosecha .
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Esta invención proporciona una cepa bacteriana silvestre aislada, caracterizada como Paenibacillus polymyxa SCHC33, y su uso como biofungicida. Dicha cepa bacteriana fue depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) , conforme al tratado de Budapest con fines de patentamiento .
El número de depósito otorgado el 23 de julio de 2014, por la autoridad de depósito es RGM2141, siendo la autoridad de depósito la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) . Esta bacteria silvestre, autóctona chilena, fue aislada desde suelos de la séptima región del Maule, Chile y tiene la capacidad de matar a distintos aislados y cepas silvestres del hongo fitopatógeno B. cinérea . La capacidad fungicida de la bacteria está dada por la secreción de moléculas fungitóxicas que interaccionan con el hongo destruyéndolo y como consecuencia de ello, inhibiendo la germinación de conidios y la proliferación del micelio vegetativo fúngico.
Muchos de los biofungicidas de uso actual podrían ser potencialmente patógenos para el humano y las plantas. En contraposición a ello, no se ha descrito que Paenibacillus polymyxa SCHC33 sea patógena ni tóxica para plantas ni frutos y tampoco se ha reportado que sería patógena de animales ni de humanos. Experimentos realizados en el laboratorio, revelan que su inoculación en hojas de plantas de vides no produce alteración visible en este hospedador después de 7 días de incubación a 20°C en placas que contenían sólo agar-agar al 1,5% (p/v) para mantener la humedad en niveles adecuados. Del mismo modo, cuando se adicionan altos inóculos de la cepa [2 x 1010 ufe (unidad formadora de colonia)] a bayas de uva intactas o con heridas, no se aprecia efecto alguno después de 7 días de incubación en las mismas condiciones descritas anteriormente .
El agente biológico de la invención corresponde a una bacteria silvestre, aislada de suelos, y ha sido individualizado por técnicas bioquímicas, microbiológicas, microscopía electrónica y secuenciación del rDNA 16S. P. polymyxa SCHC33 es una cepa autóctona chilena y corresponde a un organismo saprofito, no patógeno de plantas ni de animales, siendo por lo tanto, adecuado el uso de sus células vivas como biofungicida contra B. cinérea.
En forma adicional, la presente invención se refiere a composiciones que contengan dicha cepa bacteriana o a extractos conteniendo la misma, o a soluciones o mezclas que contengan compuestos derivados de la misma (por ejemplo, moléculas fungitóxicas secretadas por dicha cepa bacteriana) , todos ellos capaces de proteger a las plantas y sus frutos durante los períodos de pre- y post-cosecha, del ataque por microorganismos fitopatógenos .
La presente invención incluye también a cualquier mutante derivada de la cepa silvestre que posea esencialmente las mismas o mejores propiedades.
De igual manera, la invención se refiere al procedimiento para la obtención de dicha cepa bacteriana o sus derivados y a las aplicaciones de la misma en la protección de las plantas, y en especial de los frutos.
Además, la presente invención proporciona una formulación para controlar las enfermedades fúngicas de plantas utilizando la cepa pura P. polymyxa SCHC33. El uso de esta bacteria constituye una alternativa natural para los fungicidas químicos sintéticos, lo que garantiza un medio ambiente más seguro para lograr el control o eliminar las enfermedades producidas por hongos fitopatógenos
Por último, la presente invención proporciona una composición que contiene a dicha cepa en forma y cantidad adecuada para su actividad biológica. La mezcla contiene agentes no tóxicos que permiten la adherencia de la bacteria al vegetal sobre el cual se inocula, nutrientes vegetales y preservantes en cantidades inocuas, pudiendo encontrarse como suspensión líquida o polvo obtenido por liofilización.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las infecciones que provocan los hongos fitopatógenos a nivel de cualquier tipo de tejido vegetal son extremadamente devastadoras, de rápida propagación y ocurren prácticamente en cualquier lugar del planeta tierra. Los métodos que se utilizan actualmente para controlar estas enfermedades, están basados principalmente en el uso de fungicidas químicos que a pesar de su potencial toxicidad y a que la mayoría de ellos son moléculas recalcitrantes, se siguen aplicando masivamente, porque permiten un control relativamente eficiente de las enfermedades fúngicas y porque aún existen pocas alternativas eficaces y ambientalmente más seguras.
Botrytis cinérea es un hongo fitopatógeno polífago y necrótrofo, infectando especies vegetales de gran importancia económica entre las que se incluyen árboles frutales, plantas ornamentales y hortalizas. Produce una enfermedad conocida como pudrición gris generando un grave problema pre y post-cosecha en frutillas, frambuesas, duraznos, manzanas, peras, castañas, kiwi y uvas, entre otros frutos. En la vid este hongo produce la pudrición del racimo, enfermedad que se considera actualmente como una de las más serias a nivel de producción de frutas de exportación en Chile, ya que es capaz de provocar grandes pérdidas no sólo a nivel de campo sino que también durante su almacenamiento y traslado (Williamson B, Tudzynski B, Tudzynski P, van Kan JA. 2007. Botrytis cinérea: the cause of grey mould disease. Mol Plant Pathol. 8: 561-80; Elad, Y., Williamson, B., Tudzynski, P. and Delen, N. eds . 2007. Botrytis: Biologyr Pathology and Control. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers) .
El control actual de este importante fitopatogeno se realiza mayoritariamente con fungicidas químicos, sin embargo, en los últimos años se han descrito algunos microorganismos con actividad antifúngica contra B. cinérea. Uno de los ejemplos más promisorios es el Serenade®, cuyo principio activo es una bacteria del género Bacillus, específicamente Bacillus subtilis QST 113r descubierta en muestras de suelo de un huerto por la empresa AgraQuest Inc. en Davis, California. Este biofungicida está registrado en varios países, incluyendo Chile, tiene baja toxicidad y se está utilizando comercialmente en Chile y Estados Unidos para el control de enfermedades como oídio {Uncinula necator) , pudrición gris por Botrytis cinérea y pudrición ácida en vides.
En la patente KR20100024454, se divulga a Paenibacillus lentimorbus CMC3723 (número de depósito KACC91379) con capacidad para suprimir patógenos en plantas, en particular la roña del peral (pear scab) , Botrytis y Sclerotinum cepivorum, además de prevenir el crecimiento de patógenos de plantas. Paenibacillus lentimorbus CMC3723 fue aislado del suelo y tiene el efecto de suprimir Venturia nashicola, Botrytis cinérea, Sclerotium cepivorum y Colletotrichum acutatum. El agente para prevenir las enfermedades causadas por estos patógenos en plantas contiene un cultivo de Paenibacillus lentimorbus CMC3723. También se describe un método para aislar, cultivar, determinar su actividad contra hongos y bacterias fitopatógenas, identificar Paenibacillus lentimorbus CMC3723 y preparar un medio de cultivo que lo contenga. En este caso, las cepas bacterianas Paenibacillus lentimorbus CMC3723 y Paenibacillus polymyxa SCHC33 pertenecen al mismo género, pero a especies totalmente distintas .
La publicación KR20090105149 describe a Paenibacillus polymyxa NBl con actividad antibacteriana y una composición que la contiene, útiles para prevenir enfermedades causadas por patógenos de plantas. Paenibacillus polymyxa NBl actúa como un agente antagónico contra patógenos de plantas y su número de depósito es KFCC 11413P. Los patógenos de plantas descritos son Colletotrichum acutatum,. Pythium ultimum, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani AG4 r Botrytis cinérea y Fusarium oxysporum.
La patente KR20030075092 enseña un microorganismo Paenibacillus sp. SD17 que produce agentes anti-fúngicos para el control biológico de enfermedades de plantas y una composición para el control biológico de enfermedades de plantas que contiene al microorganismo para el control efectivo de enfermedades en plantas. El microorganismo Paenibacillus sp. SD17 (KCTC10016BP ) produce agentes antifúngicos para el control biológico de enfermedades de plantas que incluyen enfermedades provocadas por Pythium spp. , Rhizoctonia solani AG1-1, Rhizoctonia solani AG 2-2, Phytophthora infestans o Botrytis cinérea. Una composición para el control biológico de enfermedades de plantas que contiene 5 a 30% en peso del medio de cultivo de Paenibacillus sp. SD17 (KCTC-10016BP) ; 0,2 a 3,0% en peso de un agente que activa la germinación de esporas, que corresponde a extracto de levaduras; 0,02 a 0,5% en peso de un pigmento soluble en agua; 1 a 5% en peso de un surfactante y un aditivo o resina.
La publicación EP1241247 divulga bacterias antagonistas para la protección de plantas contra bacterias y hongos fitopatógenos . Las bacterias aisladas son de las especies Paenibacillus polymyxa , Pseudomonas chlororaphis,
Pseudomonas putida, Serratia plymuthica y Bacillus subtilis . Se pueden aplicar como una mezcla o en forma separada para el control por ejemplo de las siguientes enfermedades de plantas: agalla de la corona causada por Agrobacterium tumefaciens en uvas; enfermedades causadas por Corynebacterium spp., Pseudomonas syringae y Xanthomonas campestris, en tomate y repollo. Enfermedades causadas por Botrytis cinérea en pepino y tomate; Oidio causado por Erysiphales spp. en pepino y tomate; marchitamiento fúngico {damping-off) causado por Fusarium oxysporum en pepino, melón y tomate; enfermedades causadas por Helminthosporum sativum en cereales; la enfermedad de pudrición de la raíz causada por Rhizoctonia solani en algodón y porotos; enfermedades causadas por Sclerotium rolfsii en porotos; Dactylium dendroides en callampas y otras .
Si comparamos la actividad antifúngica, que se obtiene en los bioensayos de enfrentamiento en placa contra Botrytis cinérea, de Paenibacillus polymyxa de la publicación EP1241247 con la de la cepa bacteriana Paenibacillus polymyxa SCHC33 bajo idénticas condiciones de ensayo, la cepa SCHC33 produce un halo de inhibición de mayor diámetro y por lo tanto, su actividad fungicida es mayor.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 corresponde a microfotografias electrónicas de barrido de Paenibacillus polymyxa SCHC33. En (A) se observa claramente material secretado por las bacterias, correspondiente a una biopelicula formada por exopolisacáridos . En (B) se observa agrupación de bacilos rodeados por esporas elipsoidales obtenidas de cultivo liquido .
La figura 2 es una microfotografia electrónica de transmisión de Paenibacillus polymyxa SCHC33. Se observan células en división y sus correspondientes flagelos peritricos .
La figura 3 muestra la secuencia nucleotidica parcial del rDNA 16S de Paenibacillus polymyxa SCHC33.
La figura 4 corresponde a bioensayos de enfrentamiento de Paenibacillus polymyxa SCHC33 contra Botrytis cinérea. En (A) , se muestra el resultado del bioensayo realizado en un medio mínimo libre de glucosa. En (B) , se observa el resultado del bioensayo realizado en un medio de cultivo conteniendo glucosa como fuente de carbono.
En la Figura 5, se presentan los resultados de los bioensayos de inhibición de la germinación de conidios de Botrytis cinérea sobre hojas de vides. (A) y (B) corresponden a los controles negativos. (C) y (D) son los controles positivos. En (E) y (G) , se muestra el efecto biocontrolador de Serenade® sobre la germinación de conidios para una relación conidios : bacterias de 1:10 y 1:100, respectivamente. En (F) y (H) , se observa el efecto biocontrolador de Paenibacillus sobre la germinación de conidios para una relación conidios : bacterias de 1:10 y 1:100, respectivamente.
En la figura 6 se muestran las curvas de crecimiento bacteriano y consumo de glucosa para una concentración inicial de glucosa 2 [g/L] . En (A) , se aprecia el aumento de biomasa y consumo de glucosa en el tiempo. (B) corresponde a la curva semilogaritmica de biomasa en el tiempo .
En la figura 7 se presenta la curva de efecto de la concentración inicial de glucosa en la velocidad especifica de crecimiento de Paenibacillus polymyxa SCHC33.
En la figura 8 se muestra la curva de crecimiento experimental y el ajuste de los modelos cinéticos evaluados (Modelos de Monod, Moser y Tessier) .
En la figura 9 se esquematiza la región del rDNA 16S que se amplificó por PCR y de la cual se obtuvo su secuencia. En rojo primers utilizados para la PCR. En azul primers utilizados para la secuenciación . En la figura 10 se muestra el biorreactor de 2 litros de capacidad con aireación constante que se utilizó para la determinación de los parámetros cinéticos del crecimiento de Paenibacillus polymyxa SCHC33.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La cepa SCHC33 corresponde a la especie polymyxa y al género Paenibacillus . Su caracterización mediante pruebas microbiológicas y bioquímicas es la que se presenta en la Tabla 1. Produce colonias incoloras/blancas sin pigmentación en agar-papa-dextrosa (PDA) y en medio MLG (extracto de malta 10 g/L, glucosa 2 g/L, agar-agar 15 g/L) .
Tabla 1. Características mor ológicas y fisiológicas de Paenibacillus polymyxa SCHC33.
Figure imgf000012_0001
Caracterización ultraestructural de Paenibacillus polymyxa
SCHC33 por microscopía electrónica de barrido y microscopía electrónica de transmisión
A nivel de microscopía óptica, los cultivos están constituidos por bacilos Gram positivos móviles, mientras que a nivel de microscopía electrónica de barrido (SEM) , se observó claramente la morfología bacilar con un tamaño celular en el rango de 3 a 5 μπι de longitud por 0,5 a 0,8 μπι de diámetro (ver figura 1) . Asimismo, se observó claramente agrupaciones de células unidas por un material de características adhesivas correspondiente a exopolisacáridos (EPS) , los que permiten la formación de biopeliculas (ver figura 1A) , muy importantes para la adherencia de la bacteria a la superficie del vegetal que se desee proteger contra el ataque de organismos fitopatógenos (bacterias u hongos) . No se observaron apéndices bacterianos por SEM, sin embargo, usando la técnica de tinción negativa fue posible detectar, al microscopio electrónico de transmisión (TEM) , la presencia de flagelos peritricos de aproximadamente 3 a 5 μπι de longitud (ver figura 2), lo que concuerda perfectamente con los antecedentes descritos para este tipo de bacterias (Lal S. and Tabacchioni S. 2009. Ecology and biotechnological potential of Paenibacillus polymyxa: a minireview. Indian J. Microbiol 49: 2-10) .
Caracterización molecular de Paenibacillus polymyxa SCHC33 Además de la caracterización microbiológica y bioquímica de la bacteria, se procedió a su caracterización molecular mediante la obtención de la secuencia nucleotídica de una porción del rDNA 16S y su posterior análisis bioinformático . En la figura 3 se muestra la secuencia nucleotídica parcial del rDNA 16S de Paenibacillus polymyxa SCHC33 (1.255 nucleótidos) . La comparación de esta secuencia con secuencias existentes en bases de datos utilizando BlastN, generó los resultados que se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Resultados del alineamiento del rDNA 16S de Paenibacillus polymyxa SCHC33 en BlastN. Se indican los valores de los parámetros calculados por el programa informático .
Código Descripció Puntuac Puntuac Cobertu Val Identid de n ión ión ra de or ad Acceso máxima total la E máxima pregunt
a
HE5770 Cromosoma 1991 27696 97% 0,0 98% 54 principal
de
Paenibacil
lus
polymyxa
MI, genoma
completo
CP0022 Paenibacil 1991 27658 97% 0,0 98% 13 lus
polymyxa
SC2,
genoma
completo
EF6564 Paenibacil 1991 1991 97% 0,0 98% 57 lus
polymyxa
M-l,
secue cia
parcial
del gen
del rRNA
16S
AY3024 Paenibacil 1991 1991 97% 0,0 98% 39 1 us
polymyxa
WY110,
secuenci a
parcial
del gen
del rRNA
16S
JF6836 Paenibacil 1989 1989 97% 0,0 98% 20 1 us
polymyxa
RS-10,
secuenci a
parcial
del gen
del rRNA
16S
Por lo tanto, las pruebas microbiológicas, de microscopía electrónica, de secuenciación del rDNA 16S y su análisis bioinformático, confirman que se trata de una nueva cepa de Paenibacillus polymyxa, que se aisló de suelos de la Séptima Región del Maule, Chile y fue denominada SCHC33.
Determinación de la actividad antifúngica de Paenibacillus polymyxa SCHC33 contra el hongo fitopatógeno Botrytis cinérea
Se realizaron bioensayos de enfrentamiento en placas en los que se puso un disco de micelio fúngico al centro de la placa de Petri y la bacteria se inoculó en los extremos de la misma (ver figura 4) . Se observaron claramente los halos de inhibición del crecimiento del hongo, tanto en un medio sin glucosa (ver figura 4A) como en un medio conteniendo este monosacárido (ver figura 4B) . Además si se utilizan distintos medios de cultivo como por ejemplo agar-papa- dextrosa (PDA); medio Luria Bertani que contiene 0,5% extracto de levaduras, 1% de triptona y 0,5% de NaCl; medio ML que contiene 1,5% de extracto de malta y 0,7% de extracto de levaduras, entre otros, la actividad fungicida se mantiene intacta. Si adicionalmente a los medios de cultivo anteriormente mencionados se les adiciona glucosa, no se altera la actividad fungitóxica contra B. cinérea. Este resultado es muy relevante, ya que se ha observado en otras bacterias Gram (-) como Serratia plymuthica, que la secreción de moléculas fungitóxicas es reprimida en medios de cultivo que contienen glucosa. Por lo tanto, para la producción de biomasa bacteriana a nivel industrial, se puede usar cualquier medio de cultivo.
Determinación de la capacidad protectora de Paenibacillus polymyxa SCHC33 contra el ataque de Botrytis cinérea sobre tejido vegetal Se utilizaron 2 cantidades conocidas de bacterias 107 y 108 ufe /mL, con la finalidad de evaluar la eficacia del biocontrol comparativamente con Bacillus subtilis QST 713, el componente activo del biofungicida comercial Serenade®. Los resultados a los 7 días fueron satisfactorios, obteniéndose un nivel de protección del tejido vegetal levemente superior con la bacteria Paenibacillus polymyxa SCHC33. El control negativo presentó pequeñas zonas de necrosis atribuidas a las heridas provocadas con el fin de facilitar la infección y el control positivo, en el que se inoculó sólo conidios del hongo, sufrió una infección por parte de Botrytis cinérea que abarcó prácticamente el 100% de la superficie de las hojas. Tanto en las hojas protegidas por Paenibacillus polymyxa SCHC33, como en las protegidas por Bacillus subtilis QST 713, se observaron importantes disminuciones en el grado de daño producido por el hongo. En el caso de Paenibacillus polymyxa SCHC33, usando una relación de conidios : bacterias de 1:10, el daño producido por el hongo sólo llegó a cubrir el 20,5% de la superficie de la hoja, disminuyendo a un 11,7% cuando la relación fue de 1:100. En los ensayos con Bacillus subtilis QST 713, la necrosis del tejido vegetal producida por el hongo, cubrió el 36,9% de la superficie de la hoja para una relación de 1:10 y disminuyó a un 15,4% cuando la relación fue de 1:100 conidios : bacterias , respectivamente. Estos resultados se muestran en la tabla 3 y en la figura 5, evidenciando que la bacteria posee un gran potencial para ser utilizada como biofungicida mediante la inoculación directa en el campo de vegetales susceptibles a ser infectados por Botrytis cinérea.
Tabla 3. Resultados de superficie dañada de hojas de vides.
Figure imgf000017_0001
Determinación de la capacidad protectora de Paenlbaclllus polymyxa SCHC33 contra el ataque de Botrytis cinérea sobre racimos de uva.
Se realizaron bioensayos de protección contra B. cinérea sobre racimos de uvas de la variedad Thompson seedles, utilizando 2 cantidades conocidas de bacterias, 107 y 108 ufe /mL, para evaluar su eficiencia como agente de biocontrol. Los resultados a los 30 días fueron de una protección comparable a la mostrada en hojas de vides, ya que los racimos inoculados con las bacterias por aspersión, no presentaron crecimiento evidente de micelio de B. cinérea, para ambas cantidades de bacterias utilizadas. Los controles negativos no muestran presencia de B. cinérea, tanto en racimos inoculados sólo con bacterias (108 ufe /mL) como en aquellos inoculados sólo con agua estéril. Además, estos resultados son pruebas evidentes de la inocuidad de la bacteria sobre el fruto utilizado en la experimentación, ya que no se observó ninguna alteración morfológica ni cambios en la coloración y tampoco en las características organolépticas de la uva utilizada. Los controles positivos (racimos de uvas inoculados por aspersión sólo con conidios fúngicos), sufrieron una evidente infección por parte de B. cinérea, observándose claramente el crecimiento vegetativo del micelio del hongo en las bayas de los racimos inoculados.
Determinación de los parámetros cinéticos del crecimiento de Paenlbaclllus polymyxa SCHC33 y ajuste de los resultados a uno de los modelos pre-establecidos
Utilizando un biorreactor de 2 litros de capacidad se obtuvieron 5 curvas de crecimiento bacteriano con distintas concentraciones de glucosa. En la tabla 4, se muestran los datos experimentales obtenidos, y en la figura 6, se aprecian las curvas de crecimiento correspondientes para el cultivo en un medio con glucosa 2 g/L, en primera instancia la curva que relaciona la formación de biomasa en el tiempo y en segundo lugar la curva semilogarítmica utilizada para identificar las fases del crecimiento bacteriano. Así se puede ver como no existe una fase de latencia y la etapa de crecimiento exponencial comienza inmediatamente iniciado el crecimiento, dicho comportamiento se repitió en todas las corridas experimentales realizadas. El consumo de glucosa ocurrió a un ritmo constante y durante toda la etapa de crecimiento exponencial, llegando en las corridas con una concentración de glucosa alta (≥1 g/L) a mantenerse durante el período de desaceleración del crecimiento. No se observó ningún tipo de inhibición, ya sea por sustrato o producto iliitFFaseexponencaaseesaconara
en el crecimiento bacteriano, por lo que el ajuste a modelos cinéticos se restringió a aquellos que no presentan este tipo de situaciones, en este caso Monod, Moser y Tessier (Shuler M., Kargi F. 2002. Stoichiometry of microbial growth and product formation. In Bioprocess engineering: Basic concepts. Edited by Shuler M., Kargi F. Harlow: Pearson, 207-218) .
Tabla . Datos experimentales obtenidos de aumento de biomasa y consumo de glucosa para una curva de crecimiento bacteriano con una concentración inicial de glucosa de 2
[g/L] .
Sustrato Paenibacillus polymyxa
SCHC33
Tiempo bssoo Glucosa DO600 Biomasa ln [h] [g/i] [g/i] Biomasa
0 0, 647 1, 946 0, 122 0, 083 -2,490
0,5 0, 618 1,860 0, 148 0, 088 -2,425
1 0, 576 1,735 0, 198 0, 099 -2,310
1,5 0, 570 1,718 0,225 0, 105 -2, 254
2 0, 562 1, 694 0,283 0, 117 -2, 141
2,5 0,513 1, 549 0, 323 0, 126 -2, 071
3 0,500 1,510 0,430 0, 149 -1, 903
3,5 0,480 1,451 0, 493 0, 163 -1, 817
4 0,443 1,341 0, 621 0, 190 -1, 660
4,5 0, 402 1,220 0, 665 0,200 -1, 612
5 0, 353 1, 074 0,788 0,226 -1,487
5, 5 0,311 0, 950 0, 866 0,243 -1,416
6 0,251 0,772 0, 861 0,242 -1,420
6, 5 0,241 0,742 0, 880 0,246 -1,404
7 0, 189 0,588 0, 943 0,259 -1,350
7,5 0, 150 0,473 0, 964 0, 264 -1,333
8 0, 106 0,342 0, 988 0,269 -1,313
8,5 0, 060 0,206 0, 992 0,270 -1,310
9 0, 038 0, 141 0, 995 0,270 -1,308
9,5 0, 033 0, 126 0, 994 0,270 -1,309
10 0, 016 0, 076 1, 011 0,274 -1, 295
10,5 0, 000 0, 000 1, 030 0,278 -1,280
24 0, 000 0, 000 0, 998 0,271 -1,305 La obtención de la curva que relaciona la velocidad especifica de crecimiento con la concentración inicial de glucosa en el medio mostrada en la figura 7, permitió obtener los parámetros cinéticos intrínsecos de esta bacteria creciendo con glucosa como sustrato principal. Sin embargo, la validación de estos parámetros requiere primero la validación estadística del ajuste cinético a alguno de los 3 modelos antes mencionados ilustrados en la figura 8. En este caso la curva obtenida presentó un comportamiento esperado de acuerdo a la literatura, donde al aumentar la concentración de sustrato aumenta sostenidamente la velocidad específica del crecimiento bacteriano, hasta llegar a un punto máximo a partir del cual la velocidad es constante (Acevedo F., Gentina J. 2004. Cinética de fermentaciones. In Fundamentos de ingeniería bioquímica. Edited by F. Acevedo, J. Gentina, A. Illanes. Valparaíso: Ediciones universitarias de Valparaíso, 151-168).
La evaluación de los 3 modelos cinéticos basándose en los parámetros estadísticos asociados tal como se muestra en la tabla 5, indicó que el crecimiento de Paenibacillus polymyxa SCHC33 utilizando glucosa como sustrato principal, se ajusta a un modelo cinético de tipo Monod, ya que es el modelo con un coeficiente de correlación más cercano a 1 y a la vez el modelo con un parámetro de Chi cuadrado más bajo, con una diferencia de un orden de magnitud respecto a los otros 2 modelos analizados. Luego los parámetros cinéticos intrínsecos de Paenibacillus polymyxa SCHC33 son los obtenidos al analizar Monod, así la velocidad máxima específica de crecimiento para esta bacteria utilizando Glucosa como sustrato principal es μπΐ3χ=0,218 h~ , su constante de afinidad por glucosa es Ks=0, 087 g/L y el rendimiento de producción de biomasa a partir de glucosa es YX/S=0,159 [g biomasa/g glucosa].
Tabla 5. Análisis estadístico de los datos experimentales obtenidos y obtención de los parámetros cinéticos de los 3 modelos evaluados .
Figure imgf000021_0001
PARTE EXPERIMENTAL
Obtención de muestras de suelo
La obtención de muestras se realizó in situ desde suelos agrícolas de la Séptima región del Maule, recolectándose alrededor de 10 muestras al azar, las que fueron trasladadas hacia el laboratorio de Virología de hongos de la Universidad de Santiago de Chile, donde fueron almacenadas a temperatura ambiente hasta su posterior utilización .
Obtención de aislados bacterianos
Las muestras de suelo se sometieron a un tratamiento térmico de 67 °C durante 48 horas y luego se suspendió 1 gramo de cada muestra en 1 mL de agua destilada estéril. Finalmente se sembró 1 mL de esta suspensión por cada muestra en triplicado sobre placas de Petri con medio MLG+C (extracto de malta 10 g/L, glucosa 2 g/L, agar-agar 15 g/L, cicloheximida 50 μg/mL) , obteniéndose microflora diversa a partir de las que se aislaron colonias y se respaldaron para su posterior análisis.
Determinación de actividad antifúngica
La diversas colonias obtenidas se respaldaron de forma individual y se realizaron bioensayos de enfrentamiento en placas de Petri con medio MLG contra Botryti s cinérea CCgl49, cepa altamente virulenta libre de virus, proveniente del laboratorio de Virología de hongos y crecida en medio agar-papa-dextrosa (PDA) hasta la realización de los ensayos. Se evaluó también las variaciones en la actividad antifúngica en medios de distinta composición, principalmente con y sin glucosa. Se realizaron 2 tipos de bioenfrentamientos . El primero consistió en sembrar un disco de micelio de 5 mm de diámetro en el centro de la placa de Petri y en cuatro puntos equidistantes se sembró idéntica cantidad de los distintos aislados bacterianos, observándose el crecimiento durante 7 días a 20°C. El segundo método consistió en sembrar 8 trozos de micelio de 5 mm de diámetro en puntos equidistantes del centro de la placa de Petri, donde se inoculó el aislado bacteriano. Nuevamente se observó el crecimiento durante 7 días a 20°C. Como control se realizaron los mismos ensayos reemplazando los aislados bacterianos por agua estéril.
Se seleccionaron todos aquellos aislados bacterianos que presentaron algún grado de actividad antifúngica contra el hongo, observable como un halo de inhibición en placas de Petri . Posteriormente, se realizaron ensayos similares utilizando suspensión de conidios distribuidos homogéneamente en placas de Petri, las cuales se incubaron por 24 horas a 20°C, para asegurar la correcta adsorción de la muestra en el medio. Luego se sembraron 10 μΐ de cultivo bacteriano, con una densidad óptica de 0,9 a 600 nm en medio liquido, en el centro de la placa y se incubaron durante 7 días a 20°C para observar el halo de inhibición de la germinación de conidios de B. cinérea.
Obtención de clones bacterianos puros, aislamiento de DNA, ampli icación del rDNA 16S por PCR y secuenciacion
A partir de aquellos aislados bacterianos con mayor actividad antifúngica (halos de inhibición ≥1 cm en placa de Petri), se realizaron diluciones seriadas para obtener clones isogénicos que se consideraron cepas bacterianas puras. A las cepas obtenidas se les realizó extracción del DNA genómico utilizando el kit comercial PureLink® Genomic DNA y posteriormente estas muestras se sometieron a amplificación por PCR utilizando los primers universales para eubacterias denominados 8F/1392R (ver figura 9) con la finalidad de obtener un fragmento especifico del rDNA 16S de aproximadamente 1400 pares de bases. Para la PCR, se utilizaron 10 ng de DNA genómico, 0,5 μΜ de cada primer, 200 μΜ dNTPs, 2,5 U de DNA polimerasa, tampón de reacción IX y MgCl2 1,5 mM en un volumen total de 50 μL . Los ciclos consistieron en una etapa inicial de desnaturación de 4,5 minutos a 95°C y 40 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 60°C y 2 min a 72 °C, terminando en una etapa de 5 min a 72 °C. Los productos de PCR se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) . Para su secuenciación se utilizó el par de primers 27F/800R (ver figura 9) y las secuencias obtenidas se analizaron por BlastN.
Análisis ultraestructural por microscopía electrónica
Con la finalidad de obtener imágenes que permitieran dilucidar aspectos morfológicos y estructurales de la bacteria, se prepararon muestras de Paenibacillus polymyxa SCHC33 para su visualización y análisis por microscopía electrónica de barrido y de transmisión. Para la visualización al microscopio electrónico de barrido, (Jeol JSM-25-SII), se utilizaron muestras de cultivos bacterianos líquidos, las que se prepararon por la técnica de sombreado metálico con oro. En el caso de la microscopía electrónica de transmisión, se realizaron tinciones negativas con fosfotungstato de potasio al 1% (p/v), pH 7,0 a muestras de cultivos bacterianos líquidos y se visualizaron en el microscopio Phillips Tecnai 12 Bio Twin a 80 kV.
Obtención de parámetros cinéticos
Para la obtención de los parámetros cinéticos de crecimiento utilizando glucosa como sustrato principal, se llevaron a cabo corridas experimentales de crecimiento discontinuo de la bacteria con concentraciones iniciales de Glucosa de 0,1 g/L, 0,2 g/L, 0,5 g/L, 1 g/L, 2 g/L y 5 g/L en medio de cultivo LG (extracto de levaduras 5 g/L, glucosa) . Se construyeron biorreactores de 2 litros de capacidad, tal como se muestra en la figura 10, con una alimentación de aire esterilizado con filtros de 2 μπι proveniente de un compresor de 20 L/min de capacidad y un toma muestras conectado a una jeringa estéril, con el que se obtuvieron las muestras de cultivo bacteriano. En todas las corridas experimentales se mantuvo constante la aireación (1 vvm) , temperatura (30°C), pH (5) y agitación (200 rpm) en valores recomendados como óptimos por datos bibliográficos .
Para cada corrida experimental se inocularon 200 mL de cultivo bacteriano en fase exponencial de crecimiento, en el biorreactor conteniendo 2 litros de medio de cultivo, considerándose tiempo 0 el momento en que el biorreactor comenzaba la agitación y aireación de la muestra.
Se registró cada 30 minutos el aumento en la biomasa como la densidad óptica del cultivo bacteriano a una longitud de onda de 600 nm, y utilizando el kit comercial Liquicolor® se midió la disminución de la glucosa disuelta en el medio. Con estos datos se construyeron gráficas de crecimiento bacteriano y consumo de glucosa en el tiempo, y gráficas semilogaritmicas para calcular la velocidad especifica de crecimiento (μ) de Paenibacillus polymyxa SCHC33, cuando se utiliza glucosa como sustrato principal. Además se obtuvo el valor de la constante de afinidad por sustrato (Ks) y el rendimiento de biomasa por sustrato (Yx/S) a partir de los mismos datos experimentales.
Ajuste a un modelo cinético de crecimiento bacteriano
Para ajusfar el crecimiento de Paenibacillus polymyxa SCHC33 a alguno de los modelos cinéticos de crecimiento bacteriano, se utilizaron los valores de velocidad especifica de crecimiento obtenidos en cada corrida experimental realizada y se construyó una gráfica que relaciona las concentraciones iniciales de glucosa con las velocidades especificas de crecimiento, obtenidas a partir de las mediciones. Se evaluaron 3 cinéticas de crecimiento bacteriano donde los diferentes modelos matemáticos se ajustaron a los datos experimentales variando una o más constantes, dependiendo del modelo, las cuales se estiman minimizando, por el método de Newton, la suma de los residuos al cuadrado (RSS) entre los valores experimentales y los calculados, utilizando el complemento de Microsoft
Office Excel Solver. Para evaluar cual modelo es el que presentó mejor ajuste a los datos experimentales se utilizaron los siguientes parámetros estadísticos:
Coeficiente de correlación (4-3)
Figure imgf000026_0001
donde :
Vc : Valores calculados en base al modelo
VE : Valores experimentales
N : Número de datos
Chi cuadrado χ2 = -^- (4-2)
N— n
donde :
RSS : Suma de los residuos al cuadrado
N : Número de datos
n : Número de constantes
Bioensayos en tejido vegetal
Se observó la inhibición de la germinación de conidios sobre tejido vegetal utilizando hojas de vides recolectadas inmediatamente antes de usar. Las hojas se lavaron con una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% (v/v) y luego con agua destilada estéril. Posteriormente, se incubaron en placas de Petri con agar-agar al 1,5% (p/v) para mantener la humedad durante los 7 días de duración del ensayo. Las hojas fueron heridas para facilitar la infección y luego inoculadas con cultivo bacteriano en medio liquido y suspensión de conidios en proporciones de 1:10 y 1:100, respectivamente. Como control se prepararon hojas inoculadas sólo con conidios y hojas inoculadas sólo con bacterias, además de un control consistente en hojas inoculadas solo con agua estéril y un control utilizando el principio activo del biofungicida comercial denominado Serenade®, Bacillus subtilis QST 713 (Tabla 6) .
Tabla 6. Tratamientos experimentales realizados.
Figure imgf000027_0001
Los resultados se cuantificaron como porcentaje de superficie de hoja dañada respecto a la superficie total a los 7 días de incubación a 20°C. Para este propósito se utilizó el software ImageJ
(http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html), para obtener las áreas respectivas, todo esto determinado a los 7 días de incubación a 20°C. Determinación de la capacidad protectora de Paenlbacillus polymyxa SCHC33 contra el ataque de Botrytls cinérea sobre racimos de uva.
Se observó la inhibición de la germinación de conidios sobre frutos, utilizando racimos de uvas Thompson seedles . Los racimos se lavaron con una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% (v/v) y luego con agua destilada estéril, posteriormente se incubaron en recipientes cerrados previamente desinfectados durante los 30 días de duración del ensayo. Los racimos se inocularon con suspensiones de conidios y bacterias en proporciones de 1:10 y 1:100 ( conidios : bacterias ) . Como controles se inocularon racimos sólo con conidios, otros sólo con bacterias y un control consistente en racimos que se inocularon sólo con agua destilada estéril (Tabla 7) .
Tabla 7. Tratamientos experimentales realizados.
Figure imgf000028_0001
Los resultados se analizaron de forma cualitativa, determinándose la presencia o ausencia de crecimiento de micelio de Botrytis cinérea sobre la superficie de los racimos. Las observaciones se realizaron durante un periodo de 30 días de incubación a 20°C.

Claims

RE IVINDICACIONES
1. Cepa de la especie bacteriana Paenibacillus polymyxa SCHC33, caracterizada porque es la cepa con el número de depósito RGM2141 otorgada por la autoridad de depósito de la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) .
2. La cepa de la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una actividad fungicida alta que es independiente de los componentes del medio que se utilicen para cultivar la cepa.
3. La cepa de la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque crece conforme a cinética del crecimiento bacteriano que se ajusta al modelo de Monod, lo que permite un rápido aumento de la biomasa celular, sin ningún tipo de inhibición (por sustrato o producto) , manteniendo la actividad fungicida intacta.
4. La cepa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la cepa es psicrotrofa, creciendo en un rango de temperatura de 4°C a 40 °C, con una temperatura óptima de crecimiento de 30°C.
5. La cepa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la cepa crece en un rango de pH de 3 a 10, con un pH óptimo igual a 5,0.
6. Extracto biofungicida, caracterizada porque corresponde a un derivado activo de la cepa de la reivindicación 1, conservando la misma actividad fungicida alta que dicha cepa .
7. Composición biofungicida, caracterizada porque comprende la cepa de acuerdo a la reivindicación 1 y un vehículo agrícola aceptable.
8. La composición biofungicida de la reivindicación 7 caracterizada porque comprende 105-108 ufe /mL de la cepa.
9. La composición biofungicida de la reivindicación 8, caracterizada porque comprende células vegetativas o esporas suspendidas en solución acuosa.
10. Composición biofungicida, caracterizada porque comprende el extracto de acuerdo con la reivindicación 6; y un vehículo agrícola aceptable.
11. Uso de la cepa de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque sirve para preparar un composición útil para el control de infecciones fúngicas producidas por hongos fitopatógenos , en plantas, frutos o tejido vegetal.
12. Uso de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizado porque dicha infección fúngica es producida por un hongo fitopatógeno perteneciente al género Botrytis .
13. Uso de acuerdo a la reivindicación 11, caracterizado porque dicha fruta está en estado de pre-cosecha, post¬ cosecha, o en estado de almacenamiento, traslado o conservación .
14. Método para prevenir la podredumbre de frutos, caracterizado porque comprende asperjar en los frutos, una composición biofungicida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque dicha aspersión es aspersión de cultivos líquidos.
16. Método para prevenir la podredumbre de frutos, caracterizado porque comprende asperjar los frutos con una composición biofungicida de acuerdo a la reivindicación 10.
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