CN114231437A

CN114231437A - 一株贝莱斯芽胞杆菌dmw1菌株及其应用

Info

Publication number: CN114231437A
Application number: CN202111311436.9A
Authority: CN
Inventors: 董莎萌; 伍辉军; 王源超; 陈汉; 张雅铭
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-11-08
Filing date: 2021-11-08
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2041-11-08
Also published as: CN114231437B

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株及其应用，该DMW1菌株分类命名为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)，于2021年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.23191。本发明筛选的菌株对作物土传病原物具有广谱抑制活性，并能作为微生物包衣剂，显著促进作物生长、防治大豆疫霉根腐病和番茄青枯病。

Description

一株贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，涉及一株贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株及其应用，具体涉及一株分离自马铃薯田、具有促生和抑菌活性的耐盐贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株及其作为微生物包衣剂在促进植物生长和防治植物病害中的应用。

背景技术

土传病害严重危害作物和土壤系统健康，造成了严重的经济损失。如卵菌的疫霉(Phytophthora)引起的根腐病；真菌的镰孢属(Fusarium)和轮枝孢属(Verticillium)真菌引起的多种作物枯萎病；细菌的劳尔氏菌属(Ralstonia)引起的作物青枯病。这类土传病原物能在土壤中繁殖，并且逐年积累，成为作物连作的主要障碍。防治这类病害大多使用化学农药，但长期不合理使用，导致“3R”问题逐渐凸显，同时农药也危害土壤中的有益微生物，导致土壤微生态环境的失衡与恶化，加大了土传病害的防治难度。

基于微生物生态理论，利用作物有益微生物来防治作物病害，是一种对生态环境友好、对人畜安全、可持续性的防治措施。植物根际促生细菌(Plant growth-promotingrhizobacteria, PGPR)是这类有益微生物的典型代表。这类细菌能高效利用植物根系分泌物，快速生长繁殖，有效定殖在植物根际或根表等，通过产生多类促生和抑菌物质，以及诱导植物抗病性等，在保护植物健康中发挥着重要作用。其中，芽胞杆菌(Bacillus sp.)类根际促生细菌研究较多，并且广泛应用于生物肥料和生物农药领域。相比根际细菌，内生有益细菌的应用则较少。内生有益细菌来源于根际，除了具有较强的根际定殖能力外，还能定殖在植物的内部，具有开发成高效生防制剂的潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一株贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株及其应用。该菌株分离自马铃薯田、具有促生和抑菌活性并具有耐盐性能。研究表明，该菌株对作物土传病原物具有广谱抑制活性，并能作为微生物包衣剂，显著促进作物生长、防治大豆疫霉根腐病和番茄青枯病。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一株贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株，该DMW1菌株分类命名为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)，于2021年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.23191。

上述贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株是从马铃薯田土壤分离，经平板对峙筛选获的；采用获得的16S rDNA、gyrB、tuf基因序列串联分析鉴定该菌株为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)，DMW1的16srDNA序列如SEQ ID No.1所示，gyrB序列如SEQ ID No.2所示，tuf序列如SEQ ID No.3所示。

上述贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株活菌及其脂肽类提取物对多种土传病原物，如病原卵菌辣椒疫霉和大豆疫霉，病原真菌禾谷镰孢、尖孢镰孢、大丽轮枝孢、粉痂菌和油菜菌核，病原细菌番茄菠萝泛菌、马铃薯疮痂病菌和青枯病菌都具有较强的抑制活性。其活菌及其发酵产物在植物病害生物防治中的应用也是本发明保护的范围。

上述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株发酵后利用酸沉淀法制备的脂肽类粗提物，采用HPLC和MS鉴定该菌株能产生三种脂肽类物质：fengycin、iturin、surfactin。

本发明提供的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株，能在9％盐浓度条件下生存，有较强的耐盐性特性。

上述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株在促进作物生长或/和防治作物病害中的应用。

上述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株作为微生物包衣剂在促进作物生长或/和防治作物病害中的应用。

上述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株作为微生物包衣剂作用于作物种子或/和其他繁殖材料在促进作物生长或/和防治作物病害中的应用。

进一步优选的，所述的作物为大豆或/和番茄；该菌株能促进大豆、番茄的生长，并且能定殖在植物根际。所述的作物病害为由病原卵菌辣椒疫霉和大豆疫霉，病原真菌禾谷镰孢、尖孢镰孢、大丽轮枝孢、粉痂菌和油菜菌核，病原细菌番茄菠萝泛菌、马铃薯疮痂病菌和青枯病菌等中的至少一种引起的作物病害。例如，大豆疫霉根腐病和番茄青枯病中的至少一种。

上述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株作为微生物包衣剂在作物种子或/和其他繁殖材料中的应用。

上述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株在制备微生物包衣剂中的应用。

一种微生物包衣剂，该微生物包衣剂中包含上述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株。

作为一种优选技术方案，按重量百分含量计，上述微生物包衣剂主要成份如下：贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株的发酵液10wt％-20wt％，成膜剂1wt％-3wt％，增稠剂1wt％，着色剂0.3wt％，防腐剂0.5wt％，防冻剂5wt％，其余为水。

所述贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株的发酵液的芽胞浓度为10⁹-10¹⁰CFU/ml；

所述的成膜剂为聚乙烯醇，羧甲基纤维素钠等

所述的增稠剂为海藻酸钠，壳聚糖等

所述的着色剂为酸性品红，新胭脂红，亮蓝等

所述的防腐剂为苯甲酸钠或山梨酸钾等。

所述的防冻剂为丙二醇或丙三醇等。

上述微生物包衣剂，对番茄和大豆种子按照微生物包衣剂/种子质量为1:200—1:300进行包衣处理，对大豆株高促进效果达到11％，对根长的促进效果达到24％，对鲜重促进的效果达到20％，对干重的促进效果达到29％；对番茄的株高促进效果达到20％，对茎粗的促进效果达到24％，对鲜重促进的效果达到34％，对干重的促进效果达到45％。该菌株具有良好番茄根际定殖能力，在7d和21d其根际定殖量分别为9.8×10⁵cfu/g和7.4×10⁶cfu/g。

上述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1包衣剂对大豆疫霉引起的根腐病有较好防效，防治效果达到68％，对茄科劳尔式菌引起的番茄青枯病的防治效果达到73％。

本发明的有益效果：

本发明筛选的菌株对作物土传病原物具有广谱抑制活性，并能作为微生物包衣剂，显著促进作物生长、防治大豆疫霉根腐病和番茄青枯病。

附图说明

图1三基因联合建树证明DMW1为贝莱斯芽胞杆菌。将测序所得该菌株的16s rRNA、gyrB 及tuf序列拼接，并构建芽胞杆菌16s rRNA、gyrB、tuf序列库，使用Mage 5根据序列相似度进行进化树构建，序列库的组成序列均来自于NCBI基因库，DMW1菌株在所构建库中的位置如图1所示。

图2DMW1菌株的活菌及脂肽提取液对于油菜菌核病菌、尖镰孢菌、大丽轮枝菌、禾谷镰孢菌四种病原真菌及泛菌和番茄青枯病菌的抑菌效果。

图3DMW1菌株经HPLC和质谱检测发现其能产生三种脂肽类物质：fengycin、iturin、 surfactin。

图4DMW1包衣剂能促进大豆和番茄的生长。

图5DMW1包衣剂防治能防治大豆根腐病和番茄青枯病。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：

DMW1菌株为贝莱斯芽胞杆菌。从马铃薯田土壤分离，经平板对峙筛选获的获得一株 DMW1菌株，采用获得的16S rDNA、gyrB、tuf基因序列串联分析鉴定该菌株为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。

将该贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株于2021年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所,保藏号CGMCC No.23191。

贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株的16S rRNA、gyrB和tuf基因的PCR扩增和序列测定。

将该菌株接种于液体LB培养基，200rpm，37℃摇培12h，离心收集菌体，选用庄萌公司的细菌提取试剂盒提取基因组DNA，后用正向引物27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3’)和反向引物1492R(5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)，对16S rDNA 基因进行PCR扩增，凝胶电泳观察16srRNA片段扩增情况后以PCR原液送测序。PCR条件为：95℃，4min；94℃，1min；54℃，1min；72℃，1min；32cycle；72℃，10min，4℃保存。16S rDNA部分基因序列长度约为1500bp，其结果如序列表SEQ ID No.1所示。

gyrB基因扩增PCR反应条件同上，正向引物GYRB-F(5’- AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’)和反向引物GYRB- R(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’)，gyrB部分基因序列长度约为1500bp，其结果如序列表SEQ ID No.2所示。

tuf基因扩增PCR反应条件同上，正向引物TUFGPF(5’- ACGTTGACTGCCCAGGACAC-3)和反向引物TUFGPR(5’- GATACCAGTTACGTCAGTTGTACGGA-3’)，tuf部分基因序列长度约为1200bp，其结果如序列表SEQ ID No.3所示。

将测序所得该菌株的16s rRNA、gyrB及tuf序列拼接，并构建芽胞杆菌16s rRNA、gyrB、tuf序列库，使用Mage 5根据序列相似度进行进化树构建，序列库的组成序列均来自于NCBI基因库，DMW1菌株在所构建库中的位置如图1所示。

实施例2：

贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株的活菌及其脂肽类提取物对病原卵菌、真菌和细菌都有抑制活性。

贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株的普通发酵培养方法为：将DMW1菌株接种到LB液体培养基中进行大量摇培，温度为37℃，摇床转速为200rpm,发酵时间为12 小时。其中LB培养基组成为：10gTryptone，10g NaCl，5g Yeast extract，pH7.0，1000ml distilled water。

贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株的活性物质提取发酵培养方法。

将DMW1菌株事先普通发酵所得菌液按1％(v/v)接种量接种到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为37℃，摇床转速为200rpm,发酵时间为48小时。其中发酵培养基组成为：5gL-Glutamicacid，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.5g KCl，1g Yeast Extract，5.0×10^-3g MnSO₄.H₂O，1.5×10^-4g FeSO₄.6H₂O,1.3×10^-4g CuSO₄.5H₂O，2.0×10^-3g L-Phenylalanine， pH＝7.0，1000ml distilled water。

贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株的脂肽提取方法为酸沉淀法。取48h 发酵所得菌悬液，离心得上清，将上清液pH调至2.0，静置5～8h后离心取沉淀，以甲醇溶解沉淀后，调节pH至7.0，静置过夜后，离心去沉淀，取上清进行旋转蒸馏，以甲醇重溶，获取DMW1脂肽类物质粗提液。

采用平板对峙法测定DMW1菌株的活菌及脂肽化合物对病原卵菌、真菌和细菌的抑制活性。选用病原卵菌为大豆疫霉和辣椒疫霉，病原真菌油菜菌核、尖镰孢、大丽轮枝、禾谷镰孢，病原细菌番茄青枯病菌和菠萝泛菌。测定方法为平板对峙法，卵菌和真菌的实验方法为在PDA平板中央放置直径1cm的病菌菌碟，在其四周距离2cm处滴加10μl的芽胞杆菌菌液(OD₆₀₀＝1)或5μl脂肽类粗提物；细菌测定方法为以1％含量混合含病原菌的NA平板，在平板上滴加10μl的芽胞杆菌菌液(OD₆₀₀＝1)或5μl脂肽类粗提物。测定结果显示 DMW1菌株的活菌及脂肽提取液对于油菜菌核病菌、尖镰孢菌、大丽轮枝菌、禾谷镰孢菌四种病原真菌及泛菌和番茄青枯病菌均有较好的抑菌效果，如附图2所示。

实施例3：

贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株经HPLC和质谱检测发现其能产生三种脂肽类物质：fengycin、iturin、surfactin，HPLC及MOLDI-TOF-MS分析图如附图3所示。

实施例4：

贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株，有着较高耐盐性。

活化并摇培DMW1，调整菌悬液OD₆₀₀＝1；将菌悬液1％(v/v)转接至20ml的含不同浓度的NaCl(1％-10％，w/v，g/100ml)LB液体培养基中；每12h测定DMW1菌株在各个NaCl浓度下的OD₆₀₀值，持续跟踪调查96h，相比FZB42菌株(分类号：326423；保藏号：DSM23117)，DMW1菌株的耐盐能力达到9％。

实施例5：

贝莱斯芽胞杆菌DMW1包衣剂能促进大豆和番茄的生长。

贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株按照如下步骤制作成微生物包衣剂。

制备例1：按重量百分含量计，贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株的发酵液(芽胞浓度10⁹-10¹⁰CFU/ml)15wt％，成膜剂聚乙烯醇2wt％，增稠剂海藻酸钠1wt％，着色剂酸性品红0.3wt％，防腐剂苯甲酸钠0.5wt％，防冻剂丙二醇5wt％，其余为水，搅拌混合均匀。

制备例2：按重量百分含量计，贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株的发酵液(芽胞浓度10⁹-10¹⁰CFU/ml)10wt％，成膜剂聚乙烯醇1wt％，增稠剂海藻酸钠1wt％，着色剂酸性品红0.3wt％，防腐剂苯甲酸钠0.5wt％，防冻剂丙二醇5wt％，其余为水，搅拌混合均匀。

制备例3：按重量百分含量计，贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株的发酵液(芽胞浓度10⁹-10¹⁰CFU/ml)20wt％，成膜剂羧甲基纤维素钠3wt％，增稠剂壳聚糖1wt％，着色剂酸性品红0.3wt％，防腐剂山梨酸钾0.5wt％，防冻剂丙二醇5wt％，其余为水，搅拌混合均匀。

制备例1制备的DMW1包衣剂促进大豆和番茄的生长实验：制作成的微生物包衣剂按照1:300对合丰47大豆种子进行包膜处理，包膜处理后的种子播种于装有灭菌1:1草炭土和蛭石混合的土壤中，选用24cm直径盆钵，一盆16颗大豆，每个处理三盆。对照为不含菌的包衣剂。两周后，测定其株高、根长和植株鲜重干重。结果显示，经DMW1包衣处理过的大豆苗长势更好。经测定，株高促进效果为11％，对根长的促进效果达到24％，对鲜重促进的效果达到20％，对干重的促进效果达到29％，如附图4所示。采用相同的方法按照 1:200的比例对番茄种子进行包衣处理，番茄品种为金石王。1个月后，调查各部分指标。经DMW1包衣处理的番茄植株，其长势增长明显，株高增长20％，茎粗增长达到24％，鲜重增长达到34％，干重增长达到45％。

实施例6：

DMW1包衣剂防治能防治大豆和番茄主要病害。

防病实验参考上述促生实验对大豆和番茄种子进行包衣处理。防治大豆疫霉根腐病使用的是含大豆疫霉病菌的土壤。具体措施如下：将草碳土与蛭石按照1:1的比例进行混合灭菌后，装入直径24cm的塑料盆约2/3处，剩下的1/3灭菌土壤拌入3皿疫霉菌游动孢子菌丝块。当大豆种子处理后，种入各处理盆中，保持土壤的湿润度，25℃培养5d后测定各处理发芽率和14d存活率。结果表明DMW1对大豆根腐病的防治效果达到68％，如附图所示。防治番茄青枯病的实验设计如下：番茄的播种参考上述促生实验的进行，利用DMW1包衣剂对种子进行包衣处理，生长1个月后，在相应的处理中，再浇灌孢子含量为50毫升 10⁶CFU/ml的DMW1发酵液，CK组和番茄青枯处理组浇灌同样体积水；1d后浇灌发酵24 h的番茄青枯病菌菌液的10倍稀释液(10⁵CFU/ml)，每样本50毫升，CK组再浇灌50毫升水；继续培养7d调查病害发生情况并分级统计，DMW1对青枯病的防治效果达到73％，如附图所示。

实施例7：

贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1菌株能够定殖于番茄根际。

首先利用绿色荧光蛋白蛋白编码基因对DMW1菌株进行标记。对将饱满番茄种子b表面消毒后置于25℃光照培养箱中催芽约3d；视其发芽情况，加入DMW1发酵菌液(浓度约为10⁶cfu/ml)200μl，以及600μl无菌水，浸种12h，CK组以800μl无菌水浸种；加热固体 MS培养基，晾至适宜温度后以1％掺入OD₆₀₀＝1的DMW1-GFP菌液；迅速倒入18cm高， 1.5cm直径的试管中，液面达到试管的一半；培养基温度降为室温后，将各组预处理的番茄种子分别浸入其响应混菌MS固体培养基中；放置于25℃光照培养箱中，培养至7d、21d 时对其进行定殖菌量进行测定。

根部定殖菌量测定方式：选取稀释涂板计数法，无菌条件下，将试管中番茄苗连根取出，以一次性刀片或高温烧灼的剪刀将根部分离并收集；将收集的番茄根部分置入事先高温烧灼灭菌的研钵中，以液氮研磨至呈粉末状；加入1ml的无菌水，冲洗研钵内壁及研杵端部，并收集其冲洗液，即为稀释母液；稀释梯度设置为：10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；选取适当的3个稀释梯度涂板，每处理的每个梯度设置3个重复；培养12h～36h，显微镜下进行荧光菌落计数，即为各稀释梯度菌量，最后换算各处理根际定殖菌量，该菌株在番茄根际定殖量在7d和21d达到9.8×10⁵CFU/ml和7.4×10⁶CFU/ml。

序列表

<110> 南京农业大学

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gttgaccatg gtaaaacaac attaactgct gctatctcaa cagtacttca taagaaatct 120

ggtaaaggta cagctatggc gtacgatcaa attgatggtg ctccagaaga acgtgagcgc 180

ggtatcacaa tctctactgc acacgttgag tacgaaactg acactcgtca ctatgcacac 240

gttgactgcc caggacacgc tgactatgtt aaaaacatga tcactggtgc tgcgcaaatg 300

gacggagcta tccttgtagt atctgctgct gatggcccaa tgccacaaac tcgtgagcac 360

atccttcttt ctaaaaacgt tggtgtacca tacatcgtag tattccttaa caaatgcgac 420

atggtagacg acgaagagct tcttgagctt gttgaaatgg aagttcgcga tcttcttagc 480

gaatacgact tccctggtga tgatgtacca gttgttaaag gttctgctct taaagctctt 540

gaaggtgacg ctgagtacga agaaaaaatt cttgaactta tggctgcggt tgacgagtac 600

atcccaactc cagaacgcga cactgacaaa ccattcatga tgccagttga ggacgtattc 660

tcaatcactg gtcgtggtac agttgctact ggccgtgtag aacgcggaca agttaaagtc 720

ggtgacgaag ttgaaatcat cggtcttcaa gaagaaaaca gcaaaacaac tgttacaggt 780

gttgaaatgt tccgtaagct tcttgactat gctgaagctg gagacaacat cggtgcgctt 840

cttcgcggtg tagctcgtga agacatccaa cgtggacaag tacttgctaa accaggtaca 900

atcactccac acagcaaatt caaagctgaa gtttacgttc tttctaaaga agagggtgga 960

cgtcatactc cattcttctc taactaccgt cctcagttct acttccgtac aactgacgta 1020

actggtatca tcaatcttcc agaaggcgta gaaatggtta tgcctggaga taacactgaa 1080

atgatcgttg aacttatctc tacaatcgct atcgaagaag gaactcgttt ctctattcgt 1140

gaaggcggac gtacagttgg ttcaggcgtt gtttctacaa tcactgagta a 1191

Claims

1.一株贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株，该DMW1菌株分类命名为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)，于2021年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.23191。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株在促进作物生长或/和防治作物病害中的应用。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株作为微生物包衣剂在促进作物生长或/和防治作物病害中的应用。

4.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株作为微生物包衣剂作用于作物种子或/和其他繁殖材料在促进作物生长或/和防治作物病害中的应用。

5.根据权利要求2～4中任意一项所述的应用，其特征在于：所述的作物为大豆或/和番茄；所述的作物病害为由病原卵菌辣椒疫霉和大豆疫霉，病原真菌禾谷镰孢、尖孢镰孢、大丽轮枝孢、粉痂菌和油菜菌核，病原细菌番茄菠萝泛菌、马铃薯疮痂病菌和青枯病菌中至少一种引起的作物病害。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株作为微生物包衣剂在作物种子或/和其他繁殖材料中的应用。

7.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株在制备微生物包衣剂中的应用。

8.一种微生物包衣剂，其特征在于：该微生物包衣剂中包含权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株。

9.根据权利要求1所述的微生物包衣剂，其特征在于：按重量百分含量计，该微生物包衣剂包含以下成分：权利要求1所述贝莱斯芽胞杆菌DMW1菌株的发酵液10wt％-20wt％，成膜剂1wt％-3wt％，增稠剂1wt％，着色剂0.3wt％，防腐剂0.5wt％，防冻剂5wt％，其余为水。

10.根据权利要求9所述的微生物包衣剂，其特征在于：

所述的成膜剂为聚乙烯醇或羧甲基纤维素钠；

所述的增稠剂为海藻酸钠或壳聚糖；

所述的着色剂为酸性品红，新胭脂红或亮蓝；

所述的防腐剂为苯甲酸钠或山梨酸钾；

所述的防冻剂为丙二醇或丙三醇。