CN117660266A - 一株贝莱斯芽孢杆菌、抑菌脂肽及其生物防治菌剂与应用 - Google Patents
一株贝莱斯芽孢杆菌、抑菌脂肽及其生物防治菌剂与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌、抑菌脂肽及其生物防治菌剂与应用。所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，菌株号为12Y，已于2023年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28636。该菌株是一株高效广谱的果实采后病害生防菌，为病原菌的防治提供了很好的生防资源，其脂肽粗提物含有6类脂肽类物质，对于病原真菌、食源性致病细菌都具有良好的抑菌作用。同时能够抑菌保鲜，提高草莓、蓝莓、芒果等果蔬的贮藏保鲜能力。
Description
技术领域
本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌、抑菌脂肽及其生物防治菌剂与应用。
背景技术
采后真菌侵染是导致鲜果腐烂和商品价值下降的主要原因，因此需要有效的采后管理策略。利用拮抗微生物进行生物防治为传统的采后管理提供了一种替代方法。芽孢杆菌（Bacillus spp.）是最常见的拮抗微生物之一，是一种需氧或部分厌氧的革兰氏阳性菌，能产生抗性芽胞，生长稳定，分布广泛。芽孢杆菌具有表型、基因型异质性和广泛存在于环境中的特性，特定的生境赋予芽孢杆菌独特的生理生化特性。海洋是一个资源丰富的生态系统，对海洋微生物的研究还处于起步阶段。由于海洋和陆地生境的显著差异，海洋微生物可能具有独特的生理特性和拮抗特性。研究具有生防活性的海洋芽孢杆菌，不仅有利于开发微生物资源，而且有利于发现新的生防菌剂。虽然芽孢杆菌及其次生代谢产物在果实病害防治中的作用已被广泛报道，例如专利CN112553129B中报道了一株用于防治由粉红聚端孢引起的苹果霉心病或苹果黑点病的贝莱斯芽孢杆菌，该菌株对粉红聚端孢有较强的抑菌能力；专利CN115181693B中报道了一株防治番茄等茄科类作物上的病害，尤其是番茄/烟草灰霉病的贝莱斯芽孢杆菌，但芽孢杆菌对果实保鲜效果的研究尚不多见。。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株贝莱斯芽孢杆菌。
本发明还要解决的技术问题是提供由上述贝莱斯芽孢杆菌制备得到的抑菌脂肽。
本发明还要解决的技术问题是提供一种生物防治菌剂。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述贝莱斯芽孢杆菌或抑菌脂肽的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株贝莱斯芽孢杆菌，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，菌株号为12Y，已于2023年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 28636，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
其中，所述的贝莱斯芽孢杆菌，其形态特征为：乳白色圆形菌落，表面光滑，无褶皱，边缘不整齐；其指数生长期为2h~12h，能够在15-45 ℃下生长，在pH 5-9下生长，耐受0%-4 %的盐度，是一株高效广谱的果实采后病害生防菌。
其中，所述的贝莱斯芽孢杆菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其全基因组在NCBI上的序列号为CP120711.1。
一种抑菌脂肽，由所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵制备得到的。
具体的，是将贝莱斯芽孢杆菌12Y接种到LB培养基中，经发酵培养获得发酵液。
具体的，所述的发酵液用6 M盐酸调节pH到2-3，放置于4℃环境中酸沉过夜，待其充分沉淀后，10000 rpm，离心10 min收集沉淀物，加入适量色谱级甲醇溶解沉淀，用NaOH调节pH至中性，常温磁力搅拌4-6 h抽提，10000 rpm离心10 min获得含有抑菌物质的滤液，于40℃条件下进行减压旋蒸浓缩至3-5 mL，冷冻干燥，最终获得菌株12Y脂肽粗提物。
其中，所述的发酵培养，其发酵条件为：30~40℃、160~200 rpm培养24~78 h。
其中，所述的菌株12Y脂肽粗提物经HPLC-MS分析，质谱结果发现共收集到6个脂肽类物质，分别为C13-Bacillomycin D、C15-Bacillomycin D、C13-iturin、C14-iturin、C15-iturin、C16-FengycinA。
上述贝莱斯芽孢杆菌或上述抑菌脂肽在抑制植物病原真菌和/或食源性致病细菌中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的植物病原真菌包括：灰霉菌（Botrytis cinerea)、藤仓镰孢菌(Fusarium fujikuroi)、暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、咖啡刺盘孢(Colletotrichum coffeanum）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、水葫芦链格孢菌（Alternaria eichhorniae）和链格孢菌（Alternaria alternata）中的任意一种或几种的组合。
其中，所述的食源性致病细菌包括：大肠杆菌（Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的任意一种或两种的组合。
上述贝莱斯芽孢杆菌或上述抑菌脂肽在果实保鲜中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的果实为草莓、蓝莓、芒果或西红柿。
具体的，在贝莱斯芽孢杆菌12Y脂肽粗提物提高草莓贮藏性试验中发现，菌株12Y的脂肽粗提物处理能够抑制呼吸作用，延缓成熟衰老，保持抗病能力，较好地维持草莓的品质，减少草莓的腐烂发病，从而能够显著延长草莓贮藏寿命及其货架期。
具体的，在贝莱斯芽孢杆菌12Y脂肽粗提物提高蓝莓贮藏性试验中发现，复合涂膜液处理的蓝莓商品率最高，失重率低，外观表现最好，既提供了保护屏障，又因为添加脂肽类物质（菌株12Y脂肽粗提物）抑菌能力得到了提高；菌株12Y脂肽不管是直接应用还是添加到涂膜液中均能够显著抑制微生物生长、更好地维持果实的硬度；菌株12Y脂肽不仅在贮藏前期能刺激花色苷的合成，还能在贮藏后期维持花色苷的较高水平，同时复合膜液作为菌株12Y脂肽载体，能更有效地刺激花色苷的合成；菌株12Y脂肽处理可以有效诱导酚类物质的合成；菌株12Y脂肽、复合涂膜处理均能有效提高总黄酮含量，提高蓝莓贮藏性，从而延长果实贮藏期，减少果实采后损失。
具体的，在田间使用贝莱斯芽孢杆菌12Y提高草莓果实贮藏性的试验中发现，田间处理可显著延长草莓果实的贮藏寿命，提高草莓的商品性；田间菌悬液的灌根处理及菌株12Y脂肽粗提物的叶片喷施处理能显著抑制草莓果实病情指数的增加，减少草莓病害的发生；田间处理能有效抑制水分蒸发，减少失重率，延长货架期，起到良好的保鲜作用。
一种生物防治菌剂也在本发明所保护的范围之内。
具体的，所述的生物防治菌剂含有如下任意一种或两种：（1）所述的贝莱斯芽孢杆菌；（2）所述的抑菌脂肽。
有益效果：
（1）本发明从南海海泥中筛选得到了一株贝莱斯芽孢杆菌12Y，其指数生长期为2h~12h，能够在15-45 ℃、pH 5-9下生长，耐受0%-4%的盐度，对多种果实采后病原真菌都具有很好的抑制率，是一株高效广谱的果实采后病害生防菌，为病原菌的防治提供了很好的海洋生防资源。
（2）本发明利用筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌12Y制备得到了一种脂肽粗提物，其含有6类脂肽类物质（C13-Bacillomycin D、C15-Bacillomycin D、C13-iturin、C14-iturin、C15-iturin、C16-FengycinA），对于植物病原真菌和/或食源性致病细菌都具有良好的抑菌作用，同时能够抑菌保鲜，提高草莓、蓝莓、芒果、西红柿等果实的贮藏能力和食用安全。
（3）本发明同时还提供了一种生物防治菌剂，其制备简单，防治效果好，能够显著减少果蔬病害的发生，提高果蔬的贮藏保鲜能力，具有广泛的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为菌株12Y对两株病原菌的抑制效果（CK为对照组，T为处理组）
图2为菌株12Y在LB培养基上的菌落形态特征
图3为菌株12Y的生长曲线
图4为菌株12Y在不同温度、不同pH、不同盐度下的生长状况
图5为基于16S rDNA序列构建的菌株12Y系统发育树
图6为菌株12Y的基因组圈图
图7为菌株12Y的ANI聚类热图
图8为比较基因组圈图（注：最里面一圈为基因组大小的标示，每个刻度为500 kb；由内到外每个圈分别代表的是GC含量；GC skew；12Y基因组；FZB42基因组；KMU01基因组；KCTC13613基因组；SCSIO05746基因组；LL3基因组）
图9为泛基因组-核心基因组预测图
图10为六株Bacillus亚种的花瓣韦恩图（描述了共享基因（核心基因组，即花瓣图的中心）、特有基因（花瓣图的花瓣）和每个菌株基因组中的总基因数（括号中的数字））
图11为菌株12Y的抑菌谱
图12为菌株12Y的脂肽粗提物（1 mg/mL）抑菌效果（d5）（注：右侧牛津杯为脂肽粗提物溶液，左侧牛津杯为无菌水）
图13为菌株12Y脂肽粗提物的液相图谱
图14为各处理组草莓外观变化图
图15为各处理组草莓的病情指数和失重率的影响
图16为各处理组草莓的呼吸强度和TSS含量
图17为各处理组草莓的硬度
图18各处理组蓝莓的外观品质
图19为各处理组蓝莓的商品率、失重率和色差（L*值和b*值）
图20为各处理组蓝莓的TSS含量和TA含量
图21为各处理组蓝莓的菌落总数和霉菌酵母总数
图22为各处理组蓝莓的硬度
图23为各处理组蓝莓的抗性物质含量
图24为田间使用菌株12Y对采后草莓外观的影响
图25为田间使用菌株12Y对贮藏期间草莓病情指数的影响
图26为田间使用菌株12Y对贮藏期间草莓失重率的影响
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：南海海泥生防菌菌株的分离纯化与鉴定
1、菌株分离、纯化
2022年4月8日从我国南海(3619m，120°05′E，20°06′N)采集海泥样品，利用梯度稀释平板法，吸取10-2，10-3，10-4，10-5梯度的稀释液各100 μL在PDA培养基和LB培养基上分别进行涂布；在28℃和37℃的条件下分别培养48 h，挑取单菌落进行四区划线纯化，纯化两代得到纯菌株。
对各分离株进行生防潜力的评价。以链格孢（Alternaria alternata）和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）为指示菌，利用划线对峙培养法，将病原菌培养7 d后用打孔器在病原菌平板上打出若干7 mm的菌饼，每个PDA平板中央打孔接入一个菌饼，然后用接种针在病原菌两侧平行划线接入拮抗菌（距离菌饼上下2 cm），28℃条件下培养7d。以只接入病原菌的平板作为对照，待对照组菌落长满平板时用游标卡尺测量病原菌菌饼与待测菌株之间的平均距离，根据抑菌带宽评价抑菌效果。得到一株对两株病原菌都有较好抑制作用的菌株，命名为12Y，12Y对两株病原菌的抑制效果见图1。
2、菌株12Y的鉴定
（1）菌落形态特征：将菌株12Y在LB培养基上进行四区划线纯化，得到的单菌落（图2）为乳白色圆形菌落，表面光滑，无褶皱，边缘不整齐，初步判断属于细菌。
（2）理化性质分析：为了了解菌株12Y的生长特性，将菌株接入LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 10g/L，pH 7.4）中，测试菌株12Y在37℃下的生长曲线，以OD600作为菌株生长状况的评估指标。由图3可知，菌株12Y的指数生长期为2h~12h。
同时将菌株12Y接入LB培养基中，分别在不同温度、不同pH、不同盐度下测试菌株12Y的生长状况，以OD600作为菌株生长状况的评估指标。具体结果见图4，菌株12Y能够在15-45 ℃下生长，在pH 5-9下生长，耐受0%-4 %的盐度。
（3）分子生物学及系统发育分析
通过上述对菌株的菌落特征和菌体特征进行初步判断，菌株为芽孢杆菌属（Bacillus Cohn）。利用CTAB法提取菌株12Y的DNA，以27F和1492R通用引物扩增菌株的16SrDNA基因片段（菌株12Y的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示）。将扩增得到的PCR产物送至擎科生物有限公司（南京）进行测序，得到的测序结果进行blast比对，下载同源性高的菌株基因序列，利用MEGA-X软件进行序列比对，采用NJ（neighbor-joining）法进行分子发育树的构建以确定其物种地位。
从系统发育树（图5）可以看出，菌株12Y与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）CBMB205具有高度同源性，聚为一支。因此鉴定菌株12Y为Bacillus velezensis。
将菌株12Y送至保藏中心保藏，分类命名为：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），菌株号为：12Y，已于2023年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 28636，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y全基因组测序与分析
1、全基因组测序与分析
（1）全基因组测序：培养贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y至其指数生长期，离心获得菌体沉淀后，将菌体低温保藏送至擎科生物有限公司（南京）进行DNA提取，全基因组测序及组装。结果发现，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y的全基因组为一个长4,371,985 bp的环状染色体，其GC含量为46.07%，编码基因数量为4366。基因组圈图（图6）是菌株12Y基因组的可视化表现。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y的全基因组在NCBI上的序列号为CP120711.1。
（2）注释结果分析：全基因组中共有3001个蛋白编码基因得到了GO注释，分别有2183、1483和2371个基因参与了生物过程、细胞组分和分子功能。
通过eggNOG数据库进行注释发现，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y包含556个未知功能基因，占注释基因组的17.12%。注释基因比例较高的功能类别包括氨基酸转运和代谢（280个基因，占8.62%）、碳水化合物转运和代谢（222个基因，占6.83%）以及转录（239个基因，占7.36%）。
KEGG注释的结果与eggNOG的结果相似，相当多的基因富集在氨基酸生物合成和碳代谢途径的代谢类别中。同时，可以发现贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y具有出色的环境信息处理能力。尤其是KEGG注释结果显示，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y有可能产生延长因子、超氧化物歧化酶和胞外高分子物质，而这些物质都被报道为微生物相关模式分子（MAMPs）。也就是说，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y能够通过分泌多种MAMPs诱导MAMP触发免疫（MTI）。
此外，还通过Cazymes数据库进行了注释。共有173个基因被定位到CAZymes家族，其中包括53个糖苷水解酶（GHs）基因。GHs家族包含多种负责不同功能的蛋白质，其中包括几丁质酶、纤维素酶和葡聚糖酶等细胞壁降解酶（CWDEs），纤维素酶和葡聚糖酶已被证明可降解病原菌细胞壁并造成损害，其他一些CWDEs在MAMPs中也发挥着重要作用，可引起植物MTI。同时，多糖是病原真菌细胞壁不可缺少的成分，产生GHs降解真菌细胞壁是生物防治菌的作用机制之一。这表明贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y可能通过产生不同的糖苷水解酶来破坏病原菌，达到抑菌目的。
合成抗菌次生代谢物是芽孢杆菌发挥生物防治作用的主要机制。通过antiSMASH预测，共鉴定出15个次级代谢产物合成基因簇（BGCs），包括10个已知BGCs和5个未知BGCs。表1列出了每种BGC的合成序列位点、类型和比对结果。这表明贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y有产生多种抗菌次生代谢物的潜力，这也是它发挥生防作用的主要机制。
表1 BGCs的相关信息
此外，生防菌的应用需要以其安全性为前提，全基因组预测结果表明菌株12Y安全风险很低。首先，鉴定细菌基因组是否具有毒力因子是风险评估的一个主要方面，通过VFDB数据库对菌株12Y全基因组进行毒力因子注释，没有注释出比例大于50%的毒力因子，这表明菌株12Y产生毒力因子的可能性较低。另一方面，根据欧洲食品安全局（European FoodSafety Authority，EFSA）发布的安全资格认证（QPS）推荐微生物清单，Bacillus velezensis可被列入安全资格认证推荐清单，其限定条件是“无致毒性”，这一点在毒力因子预测中也得到了验证。因此，菌株12Y是安全的，后续可用于食品保鲜。
2、比较基因组学分析
将贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y的全基因组序列上传到EzBioCloud数据库进行比对，选择匹配度大于95%的模式菌株进行基因组比较分析。为了精确确定菌株12Y的物种分类地位，在JSpeciesWS网站（http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/）上进行了平均核苷酸同一性（ANI）计算，并使用TBtools绘制了热图（图7）。使用BLAST Ring Image Generator（BRIG）软件绘制了比较基因组圈图（图8），使用细菌泛基因组分析工具（BPGA）进行泛基因组分析（图9）。
ANI是在核苷酸水平比较两个基因组亲缘关系的指标，常用于研究基因组之间的进化距离，被定义为两个微生物基因组同源片段之间平均的碱基相似度，他的特点是在近缘物种之间有较高的区分度。一般认为ANI>95，这两个物种就属于同一种属。图7是对ANI的计算结果进行了可视化绘制得到的热图，可以直观地发现菌株12Y与两株Bacillus velezensis（Bacillus velezensis FZB42和Bacillus velezensis KMU01）的ANI值最高，亲缘关系最近，认为菌株12Y最有可能归属于Bacillus velezensis一类。
比较基因组圈图是不同生物基因组比较结果的可视化，能够很好的展示同源关系较为密切的物种基因组之间的差异。从内向外第一圈代表菌株12Y的长度为4371985bp，第二圈代表GC含量，第三圈代表GC-skew，其中紫色代表G含量小于C的区域，绿色代表C含量小于G的区域。外面第四圈到第九圈均为参考菌株的序列，可以从图8看出，菌株12Y的基因组存在与其他参考菌株基因组明显不同的多段序列，具有独特的序列片段，菌株12Y分离于南海深海，推测为了适应特殊的生存环境菌株12Y可能会进化出独特的生理生化特性，产生新的功能特性，具有进一步研究的意义。
泛基因组可以分为：核心基因（core genome）和非核心基因（dispensable/variable/accessory genome）。核心基因指所有菌株中均存在的基因，与生命体的基础代谢相关，较为稳定，非核心基因指在1个以及1个以上的菌株中存在的基因，可能与个体进化产生的独特性状相关。分析泛基因组的基本情况可以挖掘特有基因序列，从而研究物种内的差异，还可以通过泛基因组探究结构变异中的存在或缺失变化。图9是泛基因组-核心基因组预测图，图9的拟合方程中b=0.175834，说明泛基因组仍然是开放的，但很快就会闭合。开放型泛基因组的物种具有更丰富的遗传资源库、更强的多态性与环境适应性，这六株菌株的泛基因组属于开放型，说明各株菌株存在丰富的进化关系，拥有独特的生理生化特性。图10是六株Bacillus亚种的花瓣韦恩图，可以看出六株菌株的共享基因，也就是核心基因有2963个，从进化的角度来讲，泛基因组中鉴定出的核心基因可能是执行关键功能的基因，也就是在一个物种中倾向于保守的基因，通常会富集到控制着生命体基础代谢的基本细胞功能。此外，从图中可以看出，菌株12Y具有最多的特有基因也就是非核心基因，特有基因促进了物种的多样性，使其能够适应各种环境条件，一般富集到与环境和防御反应，受体和抗氧化剂活性，基因调控以及信号转导等相关的功能。通过对核心基因和特有基因进行功能注释可了解到各基因家族的功能情况，从而挖掘物种特异的功能与独特性状的形成相关通路。
以上菌株12Y的全基因组及比较基因组结果表明，菌株12Y与其他贝莱斯芽孢杆菌菌株在基因组上存在差异，其基因功能与氨基酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢以及转录密切相关，并参与多种物质代谢途径的转化，具有独特的生理生化特性、多样性和环境适应性。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y抑菌谱测定
以实验室保存的多种果实采后病原真菌灰霉菌（Botrytis cinerea)、藤仓镰孢菌(Fusarium fujikuroi)、暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、咖啡刺盘孢(Colletotrichum coffeanum）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、水葫芦链格孢菌（Alternaria eichhorniae）和链格孢菌（Alternaria alternata）为指示菌，用平板对峙法测试贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y的抑菌谱。具体操作步骤如下：将病原菌培养7 d后用打孔器在病原菌平板上打出若干7 mm的菌饼，每个PDA平板中央打孔接入一个菌饼，然后用接种针在病原菌两侧平行划线接入拮抗菌（距离菌饼上下2 cm），28℃、RH 90-95%条件下培养3～5 d。以只接入病原菌的平板作为对照，待对照组菌落长满平板时用游标卡尺测量病原菌菌饼与待测菌株之间的平均距离，根据抑菌带宽评价抑菌效果。菌株12Y具体对每种病原菌的抑制率见图11，从图11可以看出，菌株12Y多种果实采后病原真菌都具有很好的抑制率，可见菌株12Y是一株高效广谱的果实采后病害生防菌。
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y脂肽粗提物的制备、抑菌效果测试和组分分析
1、制备发酵液：将菌株12Y提前在LB平板上活化培养2 d，用接种环挑取平板上的单菌落，加入到100 mL LB培养基中，摇床37℃、180 rpm培养12 h活化，用无菌水将活化菌液的OD600调整到0.8左右，然后按2%（v/v）的接种量接种到3瓶500 mL LB培养基中，摇床37℃、180 rpm培养72 h，4℃、8000 rpm的条件下低温离心发酵液，弃沉淀菌体，取上清液即为发酵液。
2、脂肽粗提物制备：将发酵液用6 M盐酸调节pH到2，放置于4℃环境中酸沉过夜，待其充分沉淀后，10000 rpm，离心10 min收集沉淀物，加入100 mL色谱级甲醇溶解沉淀，用NaOH调节pH至7，于20℃环境中磁力搅拌5 h抽提，10000 rpm离心10 min获得含有抑菌物质的滤液，于40℃条件下进行减压旋蒸浓缩至4 mL，冷冻干燥获得菌株12Y脂肽粗提物。
3、脂肽粗提物抑菌效果测定：以灰葡萄孢（B. cinerea）菌株（南京农业大学植物保护学院陈长军教授惠赠）为指示菌，测试脂肽粗提物对病原真菌的抑制效果。称取一定量的脂肽粗提物，用水溶解，使其达到终浓度1 mg/mL，用0.22 μm滤膜过滤除菌备用。将PDA中央打孔放置灰葡萄孢（B. cinerea）菌饼，在两侧同一距离放置灭菌牛津杯，一侧加入100 μL无菌水作为对照，另一侧加入100 μL脂肽粗提物溶液。28℃培养5 d观察菌落生长情况。从图12可以看出，脂肽粗提物溶液明显抑制菌落的生长蔓延，说明菌株12Y脂肽具有显著的抑菌能力。
4、脂肽粗提物MIC测定
（1）病原真菌：采用二倍等度稀释96孔板法测定脂肽粗提物对病原真菌Botrytis cinerea的最小抑菌浓度（MIC）。将脂肽粗提物用无菌水溶解，并调整至不同浓度（0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512和1024 μg/mL），分别吸取50 μL 1.0×105spores/mL灰葡萄孢（B. cinerea）的孢子悬浮液，50 μL不同浓度脂肽粗提物溶液及100 μL PDB液体培养基于96孔板孔内混合均匀，28 ℃条件下培养2 d测定OD492，结果见表2，发现菌株12Y的脂肽粗提物针对灰葡萄孢（B. cinerea）的MIC为256 μg/mL。
表2 不同脂肽浓度下Botrytis cinerea的生长情况
（2）食源性致病细菌：采用二倍等度稀释96孔板法测定脂肽粗提物对食源性致病细菌大肠杆菌（Escherichia coli）（南京农业大学食品科技学院叶可萍教授惠赠）的MIC。将指示菌株接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养到对数生长期，用LB液体培养基将培养至对数生长期的菌液稀释到2×105CFU/mL待用。在96孔板各孔中预先加入100 μL LB液体培养基，然后在第一孔中加入100 μL用LB液体培养基稀释到5000 μg/mL的脂肽溶液，混匀后取100μL加入第2孔，依次倍比稀释，自第9孔吸出100 μL弃去，第10孔为对照管。将96孔板置于37℃缓慢振荡培养24小时，测定OD600，结果见表3。从表3可以看出，脂肽浓度在312.5 μg/mL以上能够起到抑制食源性致病细菌大肠杆菌（E. coli）生长的作用，即菌株12Y的脂肽粗提物针对大肠杆菌（E. coli）的MIC为312.5 μg/mL。
表3 不同脂肽浓度下Escherichia coli的生长情况
采用二倍等度稀释96孔板法测定脂肽粗提物对食源性致病细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（南京农业大学食品科技学院叶可萍教授惠赠）的MIC。将指示菌株接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养到对数生长期，用LB液体培养基将培养至对数生长期的菌液稀释到2×105CFU/mL待用。在96孔板各孔中预先加入100 μL LB液体培养基，然后在第一孔中加入100 μL用LB液体培养基稀释到1000 μg/mL的脂肽溶液，混匀后取100 μL加入第2孔，依次倍比稀释，自第9孔吸出100 μL弃去，第10孔为对照管。将96孔板置于37℃缓慢振荡培养24小时，测定OD600，结果见表4。表4结合表3可以看出，脂肽对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抑制作用优于对大肠杆菌（E. coli）的抑制作用，在浓度为62.5 μg/mL时就表现出抑制病原菌生长的效果。
表4 不同脂肽浓度下Staphylococcus aureus的生长情况
综上可见，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y的脂肽粗提物可抑制采后病原真菌，也可抑制食源性致病细菌。
5、HPLC-MS分析粗提物组分
将步骤2中冷冻干燥获得的菌株12Y脂肽粗提物样品用50%乙腈溶解后，12000 rpm离心3 min，取上清过0.22 μm滤膜去除杂质。吸取20 μL过滤上清手动上样，过反相柱（XBridge-C18，300A，3.5 μm，4.6 mm×150 mm），HPLC检测条件为：流速1.2 mL/min，柱温25℃，检测波长214 nm。HPLC图谱如图13所示。将液相图谱中出现的单峰，在出液口处用1.5mL离心管收集用于质谱测定分子量。采用正离子模式电喷雾，获得信号峰的质谱图。质谱条件：上样量50 μL，采集范围200-2000 m/z，毛细管电压35 V，毛细管温度275 ℃，喷雾电压4500 V，脱溶剂气速800 L/H。质谱结果发现共收集到6个脂肽类物质，分别为C13-Bacillomycin D、C15-Bacillomycin D、C13-iturin、C14-iturin、C15-iturin、C16-FengycinA。
实施例5：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y脂肽粗提物提高草莓贮藏性试验
利用贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y脂肽粗提物在南京对供试草莓品种秦玉进行处理，在同一大棚挑选成熟度七成~八成、大小一致、无损伤的草莓进行采前喷洒处理。具体操作如下：
将菌株12Y的脂肽粗提物用水溶解，调节浓度至500 μg/mL，处理组（T组）通过手持喷雾器将脂肽溶液均匀喷布于草莓果实表面，至果实微微滴水。对照组1（W组）采用等量清水进行果实表面喷洒，对照组2（CK组）不采取任何处理。每组设置三个平行，每平行处理40颗果实，每组共120颗果实。待果实自然风干后，进行果实的采摘，分装入PET盒中，在恒温箱中（20℃）贮藏，每隔1d测定相关指标，直至8d。
各组草莓的外观变化见图14，病情指数和失重率统计见图15，可以看出W组的病情指数始终最高，除了贮藏结束的d8，W组的病情指数均显著高于其他两组。其次是CK组，CK组到贮藏后期与T组出现显著差异。T组的病情指数始终保持最低水平，说明菌株12Y的脂肽粗提物处理能够较好地维持草莓的品质，减少草莓的腐烂发病。各组贮藏寿命计算结果为T组（4.67±0.00 d），W组（2.11±0.19 d），CK组（4.00±0.33 d），各组之间存在显著差异，说明菌株12Y的脂肽粗提物处理能够显著延长草莓贮藏寿命及其货架期。W组的失重率最高，T组失重率最低。W组与T组之间存在显著性差异，但W组与CK组，CK组与T组的差异较不显著。说明水喷洒处理会加速果实蒸腾失水，菌株12Y的脂肽粗提物喷洒处理没有这种副作用，但与无任何处理组的差异并不显著。
呼吸强度和TSS统计见图16。整体来说，W组的呼吸强度始终保持最高水平，同时T组有最小的呼吸强度，且在贮藏前期显著低于其余两个处理组。此结果与其余指标相符合，说明利用菌株12Y的脂肽粗提物处理能够抑制草莓的呼吸作用，延缓草莓成熟，保持草莓的抗病能力。在贮藏0d~2d之间，各组的TSS含量都上升，说明这个阶段草莓处于成熟阶段，可溶性糖逐渐积累。而T组的上升幅度最小，W组的上升幅度最大，说明水会加速果实成熟，而菌株12Y的脂肽粗提物能延缓果实成熟，这有助延长果实的贮藏寿命。贮藏4d开始，所有组的TSS都开始下降，说明此阶段果实开始以可溶性糖为底物进行呼吸作用，在这一阶段，T组始终维持最高的TSS含量，在d4和d8均显著高于其他两个处理组，这与呼吸强度的结果相符合，说明利用菌株12Y的脂肽粗提物处理能够抑制果实的呼吸作用，减少糖等有机物的消耗，更好地维持果实的风味和营养品质。
各组草莓硬度的变化见图17。在贮藏过程中，各处理组草莓的硬度逐步下降。在成熟过程中，草莓细胞细胞壁中层的果胶质变为可溶性的果胶，果肉细胞相互分离，而细胞壁的完整性被破坏会加速果实的衰老。此外，在贮藏过程中，果实营养物质逐渐消耗，抗病能力下降，病原菌的侵入会分泌降解果肉细胞壁相关酶，侵染寄主组织内部，加剧果实采后软化。从图17中可以看出，T组始终维持最高的硬度水平，且显著高于其他两个处理组，说明菌株12Y的脂肽粗提物能够维持果实较高的抗病能力，维持细胞壁的完整性，延缓果实的软化，从而延长果实贮藏期。
实施例6：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y脂肽粗提物提高蓝莓贮藏性试验
贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y脂肽粗提物提高蓝莓贮藏性试验在南京农业大学食品科技学院324实验室进行。实验当天从南京溧水蓝莓山有机蓝莓种植基地采摘成熟度一致、大小一致、无机械损伤和病害的蓝莓果实，品种为园蓝。采摘结束后以保温箱与冰袋的包装形式送回学校，进行处理。设置三个处理，T1为菌株12Y脂肽粗提物溶液，T2为明胶-羧甲基纤维素钠基础涂膜液，T3为含有菌株12Y脂肽粗提物的脂肽-明胶-羧甲基纤维素钠复合涂膜液。菌株12Y脂肽粗提物的脂肽溶液终浓度均为500 μg/mL。
明胶-羧甲基纤维素钠基础涂膜液的制备：称取1.8 g的明胶溶于50 mL蒸馏水中，使用恒温磁力搅拌器在60℃下充分搅拌30 min，称取0.2 g羧甲基纤维素钠溶于50 mL蒸馏水中，在50℃下充分搅拌30 min，随后将两者在50℃下进行混合充分搅拌30 min，待溶液冷却至35℃时，加入30%总固形物质量的甘油作为增塑剂搅拌30 min，上述搅拌过程转速为1000~1100 r·min-1，静置脱泡备用。
脂肽-明胶-羧甲基纤维素钠复合涂膜液的制备：称取1.8 g的明胶溶于50 mL蒸馏水中，使用恒温磁力搅拌器在60℃下充分搅拌30 min，称取0.2 g羧甲基纤维素钠溶于50mL蒸馏水中，在50℃下充分搅拌30 min，随后将两者在50℃下进行混合充分搅拌30 min，待溶液冷却至35℃时，加入一定量的菌株12Y脂肽粗提物溶液使其终浓度达到500 μg mL-1，充分搅拌1h，再加入30%总固形物质量的甘油作为增塑剂搅拌30 min，上述搅拌过程转速为1000~1100 r·min-1，静置脱泡备用。
蓝莓处理：将蓝莓果实分成四组，每组重量设定为2 kg，按蓝莓果实分别在各组处理液：（1）无菌水（CK）、（2）脂肽粗提物溶液（T1）、（3）明胶-羧甲基纤维素钠基础涂膜液（T2）、（4）脂肽-明胶-羧甲基纤维素钠复合涂膜液（T3）中浸泡30 s，果实与处理液的料液比为1:2，25℃通风条件下晾干后分装到带孔的、已清洗消毒的PET塑料盒中，盒外另覆一层保鲜袋，装入篮子中，置于0±3℃、相对湿度为90%-95%的冷库中进行贮藏，冷藏期间每3天取样一次测定相关生理及品质指标，直至第15天。
各组蓝莓的外观变化见图18，商品率，失重率和色差见图19。随着贮藏时间的延长，蓝莓出现了失水、表面皱缩、失去商品性的情况，最为严重的为CK组，大部分果实都出现了干瘪，因此CK组的商品率显著低于其他三组，T3的商品率最高，其次是T1，T2高于CK组。同时失重率结果显示CK的失重率也显著高于各处理组。在三个处理组中，由于T2，T3进行了涂膜处理，蓝莓表面的亮度有所提高，这与色差的L*值结果符合，但由于T2组未添加脂肽类抑菌物质（菌株12Y脂肽粗提物），相较T1而言，有更多的果实出现腐烂情况。从外观来看，表现最好的是T3组，推测是因为复合涂膜既能提供保护屏障，又因为添加脂肽类物质（菌株12Y脂肽粗提物）抑菌能力得到提高。
TSS和TA的结果统计见图20。TSS均呈先下降后回升，之后又下降的趋势。在d0-d3之间，CK组和T2组的TSS出现显著下降，而T1，T3能够维持较高的TSS水平，到贮藏后期，CK组的TSS组含量显著低于其他各处理组，说明各处理都能在贮藏后期延缓TSS的消耗，但脂肽-明胶-羧甲基纤维素钠复合涂膜液和明胶-羧甲基纤维素钠基础涂膜液对TSS的维持作用没有显著差异。在贮藏过程中，TA含量基本呈下降趋势，这是因为果实会利用有机酸作为呼吸代谢的底物，导致有机酸被消耗。可以看出T3组能够维持最高的TA水平，相比明胶-羧甲基纤维素钠基础涂膜液的处理，脂肽-明胶-羧甲基纤维素钠复合涂膜液维持TA含量的效果最好。
微生物指标的统计见图21。CK组始终保持最高的菌落总数和霉菌酵母总数，显著高于其他三个处理组。在三个处理组中，T1和T3的菌落总数和霉菌酵母总数显著低于T2，两者之间的差异并不显著，但均显著低于T2。这说明明胶-羧甲基纤维素钠基础涂膜液抑制微生物生长的能力较弱，菌株12Y脂肽不管是直接应用还是添加到涂膜液中均能够显著抑制微生物生长。
硬度结果统计见图22。涂膜处理后的蓝莓均在3d时出现硬度的小幅度上升，与其他各组硬度均下降的趋势不同，这可能是因为涂膜液在蓝莓表面成膜，提高了蓝莓的硬度。CK组硬度下降的趋势最为明显，涂膜处理和菌株12Y脂肽单独处理均能延缓硬度的下降，更好地维持果实的硬度，但菌株12Y脂肽的添加对脂肽-明胶-羧甲基纤维素钠复合涂膜液维持果实硬度的作用影响并不显著。
对蓝莓的抗性物质含量进行测定，结果见图23。总的来说，CK组的花色苷含量基本处于最低水平，水处理会干扰蓝莓正常的呼吸代谢，因此在前期CK出现了花色苷含量下降的趋势。值得注意的是，添加了菌株12Y脂肽粗提物的T1组和T3组的花色苷含量显著高于其他两组，说明菌株12Y脂肽不仅在贮藏前期能刺激花色苷的合成，还能在贮藏后期维持花色苷的较高水平。比较T1和T3组的花色苷变化趋势可以发现，T1比起T3能更有效地刺激花色苷的合成，这可能是因为T1处理中菌株12Y脂肽直接作用于果实，T3处理中脂肽是添加到复合膜液里的，发挥作用较慢。但是从贮藏后期来看，T1花色苷含量下降的趋势较T3更为明显，说明T3保持花色苷含量的作用更持久，这可能是使用复合膜液作为菌株12Y脂肽载体的优点。
对蓝莓总酚含量的测定结果见图23。在贮藏3d~12d期间，T1的总酚含量显著高于T3，T3又显著高于其他两个处理组，说明菌株12Y脂肽处理可以有效诱导酚类物质的合成，其中菌株12Y脂肽粗提物直接处理的作用更为明显。对比CK，T2组的酚类物质含量反而更低，这可能是因为涂膜液在果实表面形成屏障，阻碍了酚类物质的合成，这也可能是T3组的总酚含量低于T1组的原因。贮藏15d时，T1的总酚含量迅速下降，但T3仍处于上升状态，这与花色苷的变化趋势相符合，以复合膜液为载体的菌株12Y脂肽能够更持续地发挥作用。
对蓝莓总黄酮含量的测定结果见图23。CK组的总黄酮含量在贮藏0d~3d之间迅速上升，之后持续下降，明胶-羧甲基纤维素钠基础涂膜处理不仅不能促进总黄酮的积累，反而有消极作用。而菌株12Y脂肽、脂肽脂肽-明胶-羧甲基纤维素钠复合涂膜处理均能有效提高总黄酮含量，在贮藏6~15d期间总黄酮含量都显著高于CK组，推测是因为菌株12Y脂肽诱导果实抗性上升，刺激抗性物质的合成。同样，在贮藏后期T3组能够维持更高的总黄酮含量，这说明菌株12Y脂肽在复合涂膜液的载体下更为稳定，能持续诱导果实抗性。
实施例7：田间使用贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y提高草莓果实贮藏性的试验
制备贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y菌悬液：将菌株12Y在LB培养基上划线培养（37℃下培养2d），用无菌水洗下培养好的菌体，用无菌水适当稀释将其浓度调整为1×106 cells/mL。制备贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）12Y脂肽粗提物溶液：将脂肽粗提物用无菌水溶解，浓度为500 μg/mL。选取6行生长在同一大棚、处于开花阶段且生长状态相近的健康“红颜”草莓植株，其中3行作为处理组，3行作为对照组，每行选择草莓苗50株。田间处理组T每株草莓处理方法为：50 mL菌悬液均匀浇灌于草莓苗根际土壤中，同时将2 mL菌株12Y脂肽粗提物溶液均匀喷布于草莓苗叶片表面，共施用菌液和脂肽粗提物溶液2次，间隔两周。对照组CK用等量清水进行叶片喷洒和土壤浇灌。
待草莓果实成熟度达到7-8成后采摘，选取无机械伤、无病虫害、成熟度一致的草莓果实采摘、标记后立即运回研究室，于RH 80-85%、20±0.5℃贮藏。每天观察记录草莓果实的外观品质、病情指数、并测定失重率，计算果实的贮藏期。
结果显示，田间处理组T和对照组CK果实外观变化有显著性差异。如图24所示，对照组CK草莓果实在贮藏5d时开始出现大量的霉变病斑，而田间处理组T的草莓果实仍保持较好的外观品质，与0d相比，田间处理组T的草莓果实完全转红，但仍然完好无损。结果表明：田间菌悬液的灌根处理及菌株12Y脂肽粗提物的叶片喷施处理可有效保持草莓的外观，延缓草莓的病变速率。田间处理组T草莓果实贮藏寿命为10.7d，显著高于对照组CK的5.9d（p<0.05）。表明田间处理可显著延长草莓果实的贮藏寿命，提高草莓的商品性。
贮藏5d后，田间处理组T的草莓病情指数为10.65%，显著低于对照组CK的61.30%（p<0.05）（见图25）。说明田间菌悬液的灌根处理及菌株12Y脂肽粗提物的叶片喷施处理能显著抑制草莓果实病情指数的增加，减少草莓病害的发生。
如图26所示，草莓的失重率随着贮藏时间的延长而逐渐增加，对照组CK的失重率明显高于田间处理组T。在贮藏第5d时，对照组CK的失重率为2.70%，显著高于田间处理组T的2.07%（p<0.05）。说明田间处理能有效抑制水分蒸发，减少失重率，起到良好的保鲜作用。
本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌、抑菌脂肽及其生物防治菌剂与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，菌株号为12Y，已于2023年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 28636。
2.一种抑菌脂肽，其特征在于，由权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵制备得到。
3.根据权利要求2所述的抑菌脂肽，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌12Y接种到LB培养基中，经发酵培养获得发酵液。
4.根据权利要求3所述的抑菌脂肽，其特征在于，所述的发酵培养，其发酵条件为：30~40℃、160~200 rpm培养24~78 h。
5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的抑菌脂肽在抑制植物病原真菌和/或食源性致病细菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物病原真菌包括：灰霉菌Botrytis cinerea、藤仓镰孢菌Fusarium fujikuroi、暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、咖啡刺盘孢Colletotrichum coffeanum、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、水葫芦链格孢菌Alternaria eichhorniae和链格孢菌Alternaria alternata中的任意一种或几种的组合。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的食源性致病细菌包括：大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus中的任意一种或两种的组合。
8.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的抑菌脂肽在果实保鲜中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的果实为草莓、蓝莓、芒果或西红柿。
10.一种生物防治菌剂，其特征在于，所述的生物防治菌剂含有如下任意一种或两种：
（1）权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌；
（2）权利要求2所述的抑菌脂肽。
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