CN108676765A - 一株烟草节杆菌及其在防治冬瓜根结线虫中的应用 - Google Patents

一株烟草节杆菌及其在防治冬瓜根结线虫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株烟草节杆菌及其在防治冬瓜根结线虫中的应用。本发明的菌株为烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)菌株08220203，已于2018年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15217。实验表明：烟草节杆菌菌株08220203生物制剂对冬瓜根结线虫病具有较好的防治效果，最后一次施药后14d其防治效果为55.33％，从冬瓜长势看，烟草节杆菌菌株08220203对冬瓜具有明显的促进生长效果，没有药害，安全可靠。

Description

一株烟草节杆菌及其在防治冬瓜根结线虫中的应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治冬瓜根结线虫病的烟草节杆菌及其用途，以及采用该烟草节杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类在植物尤其是蔬菜作物上危害极大的植物病原线虫，不但种类多、分布广、致病性强，而且寄主范围广(3000种以上)，可发生于黄瓜、冬瓜、番茄、茄子、莴苣、胡萝卜、白菜以及豆科蔬菜等多种蔬菜。到目前为止，已报道的根结线虫有80多种，其中南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、北方根结线虫(M.hapla)和花生根结线虫(M.arenaria)因其广分布性和多寄生性，是最重要的植物寄生线虫种类，其中，山东蔬菜主产区的蔬菜根结线虫为南方根结线虫(M.incognita)。蔬菜一旦遭受根结线虫侵染后，会导致其减产、品质下降的同时，还可与其他病原物互作而造成复合侵染，带来更严重的经济损失。近些年来，由于我国北方保护地蔬菜的大面积种植，为根结线虫的越冬提供了更适宜的条件，使保护地蔬菜的根结线虫病呈明显加重趋势，它能使受侵染的蔬菜减产15％～25％，高达70％以上，严重地区使保护地蔬菜到了无法种植的地步，根结线虫病已成为保护地蔬菜生产的严重障碍。
由于根结线虫病害属于土传病害，所以防治较为困难。目前，防治根结线虫的方法包括农业防治和化学防治。其中，农业防治效率低、劳动量大，而且防治作用并不明显；而化学防治的长期用药，使根结线虫产生抗药性，最终导致防治效果不理想，再加上化学药剂的大量使用对蔬菜质量安全与环境造成许多负面影响。而生物防治具有对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性等优点，因此根结线虫的绿色无公害生物防治越来越多的受到人们关注。目前用于番茄根结线虫的生物防治制剂报道较多，用于冬瓜根结线虫的生物防治制剂鲜有报道。
节杆菌(Arthrobacter spp.)是最常分离到的土壤细菌种类之一，在地球上分布广泛，几乎无处不在。从土壤到植物，从高山到海水，从考古壁画到临床样本，都可以分离到节杆菌。节杆菌具有营养多功能性，能降解多种环境污染物，使节杆菌成为经常分离到的污染物降解菌株。此外，节杆菌还可产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。用节杆菌防治冬瓜根结线虫，目前还未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于高效防治冬瓜根结线虫的新的微生物——烟草节杆菌菌株08220203。本发明的烟草节杆菌菌株具有生长速度快、抗逆性强，在植物表面能够快速大量定殖等特点，具有良好的应用前景。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)菌株08220203，是从烟台莱州湿地中分离获得的，已于2018年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.15217。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上该菌株菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，菌落为乳白色变成乳黄色、不透明的圆形凸起。在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，细胞形状呈杆状，存在球杆变化，不形成芽孢，不运动，抗酸染色阴性。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。
本发明烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH调至6.9～7.1。
(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至6.9～7.1。
(3)固体培养基配方：固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶0.3；所述固料按质量比计为：稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶鱼粉＝50∶25∶21∶4；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾42％，硫酸镁8％，硫酸铵4％，轻质碳酸钙46％。
(4)发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还提供一种用于防治冬瓜根结线虫的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203。
并且，本发明还提供了一种用于防治冬瓜根结线虫的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有根结线虫的冬瓜植株施用上述烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203或者上述生物防治制剂。
本发明也提供了上述烟草节杆菌菌株08220203或者上述生物防治制剂在防治冬瓜根结线虫病中的用途。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备所述烟草节杆菌菌株08220203的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，24～26℃下恒温培养；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液接种至发酵培养基，在室温24～26℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述烟草节杆菌的孢子移植到LB液体培养基，24～26℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，24～26℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至发酵培养基，室温24～26℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d；活性菌可达到50亿/克以上。
其中，步骤(1)中的LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至6.9～7.1。
步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶0.3；所述固料按质量比计为：稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶鱼粉＝50∶25∶21∶4；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾42％，硫酸镁8％，硫酸铵4％，轻质碳酸钙46％。
步骤(3)中的发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
实验表明，本发明的烟草节杆菌菌株具有生长速度快、抗逆性强，在植物表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203生物制剂对冬瓜根结线虫病具有较好的防治效果，最后一次施药后14d其防治效果为55.33％，从冬瓜长势看，烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203对冬瓜具有明显的促进生长效果，没有药害，安全可靠。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治冬瓜根结线虫病。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。
实施例1
1、烟草节杆菌(A.nicotianae)08220203的分离与纯化
本发明的烟草节杆菌(A.nicotianae)08220203是从烟台莱州湿地海泥中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
(1)菌株的分离
样品取自烟台莱州湿地。称取1g海泥样品于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，并编号保存。
(2)冬瓜根结线虫病高效拮抗菌株的筛选
①初筛
A.根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备
从冬瓜根部挑取新鲜卵块，置于自制孵化装置中进行孵化，24h后开始收集幼虫，每天收集一次，共收集一周。线虫液稀释为100条/mL，4℃保存待用。
B.菌株对南方根结线虫二龄幼虫的作用
吸取菌悬液2mL，加入直径为7.5cm的灭菌培养皿中，再加入2mL二龄幼虫的悬浮液，以清水作对照，各处理3次重复，25℃培养。分别在12h、24h、36h、48h和60h后观察线虫的活力。
C.菌株对南方根结线虫卵块孵化的作用
吸取菌悬液2mL，加入直径为7.5cm的灭菌培养皿中，再加入10粒卵块，以清水作对照，各处理3次重复，25℃培养。分别在24h、48h和60h后观察幼虫的孵化情况。
②复筛
将筛选到的具有高效拮抗活性的菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治冬瓜根结线虫的烟草节杆菌(A.nicotianae)08220203。实验证明，该烟草节杆菌在防治冬瓜根结线虫中显示出较高效的防治效果，使得冬瓜长势良好。因而，本发明的烟草节杆菌是具有广泛应用前景的烟草节杆菌新菌株，可以用于制备防治冬瓜根结线虫病的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上该菌株菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，菌落为乳白色变成乳黄色、不透明的圆形凸起。在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，细胞形状呈杆状，存在球杆变化，不形成芽孢，不运动，抗酸染色阴性。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
ACTCCGCCCACACAAGGTGGTTTGGCCATCGGCTTCGGGTGTTACCAACTTTCGTGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTAGGGATTAGCTCCACCTCACAGTATCGCAACCCATTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCCATGAGTCCCCACCACTACGTGCTGGCAACATGGAACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTGAACCAGCCCCGAAGGGAAACCCCATCTCTGGAGCGGTCTGGCACATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTACGGCGCGGAAAACGTGGAATGTCCCCCACACCTAGTGCCCAACGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCATGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAAATGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTACATCACTCTAGTCTGCCCGTACCCACCGCAGATCCGAGGTTGAGCCTCGGACTTTCACGGCAGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTACTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGTCCATCCCCCACCGATAAATCTTTCCACCCCGCACCATGCGGTGCGAGGTCATATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCGGGCTTATCCCAGAGTCGGGGGCAGGTTACTCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCACCCAGCAAGCTGGGCTTCATCGTTCGACTGCATTGTAAGCTC。
(3)细胞形态和理化实验结果
烟草节杆菌(A.nicotianae)08220203的细胞形态和理化实验结果如表1所示。
表1烟草节杆菌(A.nicotianae)08220203的细胞形态和理化实验结果
实验项目 结果 实验项目 结果
革兰氏染色 阳性 乳糖 +
细胞形状 杆状 发酵葡萄糖产气 +
形成芽孢 － 利用柠檬酸盐 +
接触酶 + O/F试验 +
氧化酶 － 淀粉水解 +
VP试验 － 分解酪素 +
甲基红试验 － 水解明胶 +
硝酸盐还原 + 蔗糖 －
葡萄糖 + 棉籽糖 －
L-阿拉伯糖 + 松三糖 －
实施例2
1、烟草节杆菌菌种发酵过程
LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至6.9～7.1。
固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶0.3；所述固料按质量比计为：稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶鱼粉＝50∶25∶21∶4；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾42％，硫酸镁8％，硫酸铵4％，轻质碳酸钙46％。配制方法：加入适量的水(10-15倍质量)溶解无机盐，得到无机盐溶液；无机盐溶液与固料混合，并加入水最终调整固体培养基的含水量为40-60％，以将固体培养基攥在手中，指缝中有水但不会滴落为宜。
发酵培养基同固体培养基。
烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养
将烟草节杆菌菌株(A.nicotianae)08220203从试管斜面中挑取少量细菌，移至LB液体培养基中，25℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。
②固体生产菌种的培养
将种子液按10％的质量比接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，25℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。
③大量固体发酵：
将②中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按体积比1∶6接种于发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(25℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，活性菌55亿/克。
为了明确烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203固体发酵培养物对冬瓜根结线虫病的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年3月～6月在山东省聊城市莘县进行试验，现将试验结果报告如下：
1供试材料及方法
1.1供试药剂
按本发明实施例2发酵方法生产的烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203固体发酵培养物(55亿/g)；1.8％阿维菌素乳油(河南绿野之星作物保护有限公司生产，市售)。
1.2试验材料与防治对象
试验材料为冬瓜，品种为一串铃4号；防治对象为冬瓜根结线虫病。
1.3试验地情况
试验地设在山东省聊城市莘县十八里镇宁塘村大棚。该地区由于连续种植冬瓜，冬瓜根结线虫病的发生也日益严重，其毁苗种植事件经常发生，严重的甚至绝收。试验土壤类型为潮土，有机质含量为1.25％，pH值为7.72，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时冬瓜根结线虫处于发病初期。
1.4试验设计及安排
本试验共3个处理，分别为烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203固体发酵培养物20倍液、1.8％阿维菌素乳油1000倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理60株。于发病初期对病株及其附近植株灌根，连续2次，每次每病株灌药液250ml。于2016年3月22日和4月24日各灌根一次。
1.5试验调查及计算方法
1.5.1气象条件
第1次施药(3月22日)当日多云，风力3级，最高气温为18℃，最低气温为5℃，相对湿度为61％。第2次施药(4月24日)，当日晴，风力3级，最高气温为26℃，最低气温为13℃，相对湿度为64％。
1.5.2药效及安全性调查
药效调查：最后一次施药后14d进行调查。调查30株，调查病株及根系受侵染程度，记录病情级数并计算病情指数。
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察冬瓜的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
冬瓜根结线虫病分级标准：
0级：根系上无根结。
1级：轻度感染，仅有少量的小根结，根结率在3％以下。
2级：根结率为3％～25％。
3级：根结较多，根结率为25％～50％。
4级：在根瘤上有再次根结，50％～75％根系有根结。
5级：根结相互连接成根结团块，75％以上根系有根。
1.5.3药效计算方法
防治效果按式(1)、(2)计算：
式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
CK1——空白对照区施药后病情指数；
PT0————药剂处理前施药前病情指数；
PT1————药剂处理后施药后病情指数。
1.5.4对冬瓜的直接影响
观察药剂对冬瓜有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对冬瓜长势的影响。
用下列方式记录药害：
(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高。
(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：
①按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。
药害分级方法：
—：无药害；
+：轻度药害，不影响植物生长；
++：中度药害，可复原，不会降低植物生物量；
+++：中度药害，影响植物正常生长，对植物生物量造成一定程度的降低；
++++：严重药害，植物生长受阻，植物生物量降低严重。
②将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述植物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。
2结果
2.1供试药剂对冬瓜根结线虫的防治效果
表3结果显示，烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203固体发酵培养物和1.8％阿维菌素乳油对冬瓜根结线虫均具有较好的防治效果。从冬瓜根结线虫病田间试验的病情指数来看(表3)，最后一次施药后14d，1.8％阿维菌素乳油的防治效果为69.24％，烟草节杆菌(A.nicotianae)08220203防治效果为55.33％，虽然烟草节杆菌(A.nicotianae)08220203防治效果低于1.8％阿维菌素乳油，但是作为具有对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性等优点的生防菌剂表现出了较好的防治效果。
表2三种药剂处理前冬瓜根结线虫病病害情况
表3三种药剂处理对冬瓜根结线虫病的防治效果
2.2冬瓜安全性调查
经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，冬瓜生长正常，无药害产生，说明烟草节杆菌菌液对冬瓜安全。
3小结
3.1从病情指数和防治效果来看，烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203(保藏号CGMCC No.15217)对冬瓜根结线虫病具有较好的防治效果，最后一次施药后14d其防治效果为55.33％。
3.2从冬瓜长势看，烟草节杆菌(A.nicotianae)菌株08220203对冬瓜具有明显的促进生长效果，没有药害，安全可靠。
SEQUENCE LISTING
<110> 毕乃亮
<120> 一株烟草节杆菌及其在防治冬瓜根结线虫中的应用
<130> 0
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1400
<212> DNA
<213> 烟草节杆菌（Arthrobacter nicotianae）菌株08220203的16s rDNA基因序列
<400> 1
actccgccca cacaaggtgg tttggccatc ggcttcgggt gttaccaact ttcgtgactt 60
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agcgttgctg atctgcgatt 120
actagcgact ccgacttcat ggggtcgagt tgcagacccc aatccgaact gagaccggct 180
tttagggatt agctccacct cacagtatcg caacccattg taccggccat tgtagcatgc 240
gtgaagccca agacataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccgagtt 300
gaccccggca gtctcccatg agtccccacc actacgtgct ggcaacatgg aacgagggtt 360
gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420
acctgtgaac cagccccgaa gggaaacccc atctctggag cggtctggca catgtcaagc 480
cttggtaagg ttcttcgcgt tgcatcgaat taatccgcat gctccgccgc ttgtgcgggc 540
ccccgtcaat tcctttgagt tttagccttg cggccgtact ccccaggcgg ggcacttaat 600
gcgttagcta cggcgcggaa aacgtggaat gtcccccaca cctagtgccc aacgtttacg 660
gcatggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccat gctttcgctc ctcagcgtca 720
gtaaatgccc agagacctgc cttcgccatc ggtgttcctc ctgatatctg cgcatttcac 780
cgctacacca ggaattccag tctcccctac atcactctag tctgcccgta cccaccgcag 840
atccgaggtt gagcctcgga ctttcacggc agacgcgaca aaccgcctac gagctcttta 900
cgcccaataa atccggataa cgcttgcgcc ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccggcg cttcttctgc aggtaccgtc actttcgctt cttccctact gaaagaggtt 1020
tacaacccga aggccgtcat ccctcacgcg gcgtcgctgc atcaggcttt cgcccattgt 1080
gcaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg 1140
ccggtcaccc tctcaggccg gctacccgtc gtcgccttgg tgagccatta cctcaccaac 1200
aagctgatag gccgcgagtc catcccccac cgataaatct ttccaccccg caccatgcgg 1260
tgcgaggtca tatccggtat tagacccagt ttcccgggct tatcccagag tcgggggcag 1320
gttactcacg tgttactcac ccgttcgcca ctaatccacc cagcaagctg ggcttcatcg 1380
ttcgactgca ttgtaagctc 1400

Claims (8)

1.烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)菌株08220203，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.15217。
2.权利要求1所述的烟草节杆菌菌株08220203在防治冬瓜根结线虫中的应用。
3.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的烟草节杆菌菌株08220203。
4.权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)制备烟草节杆菌菌株08220203的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中进行培养；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至发酵培养基，在发酵室中进行发酵培养。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，
步骤(2)中的固体培养基包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶0.3；所述固料按质量比计为：稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶鱼粉＝50∶25∶21∶4；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾42％，硫酸镁8％，硫酸铵4％，轻质碳酸钙46％；
步骤(3)中的发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)将烟草节杆菌菌株08220203的孢子移植到LB液体培养基，24～26℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，24～26℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至发酵培养基，于室温24～26℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
7.权利要求3所述的生物防治制剂在防治冬瓜根结线虫中的应用。
8.一种用于防治冬瓜根结线虫的生物防治方法，包括向具有根结线虫的冬瓜植株施用权利要求1所述的烟草节杆菌菌株08220203或者权利要求3所述的生物防治制剂。
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