WO2019208971A1 - 질소 고정능 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

질소 고정능 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이의 용도 Download PDF

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bacillus
plant growth
plant
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김정웅
홍기창
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주식회사경농
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a Bacillus bellenosis strain having nitrogen fixing ability and plant growth promoting activity and its use.
  • microorganisms are often used as microbial fertilizers to control pests by formulating and processing them after mass culture.
  • Nitrogen-fixing bacteria have the ability to convert N 2 in the atmosphere into ammonia available to plants, so that C is sufficient but it is capable of promoting plant growth in an N-deficient environment.
  • Nitrogen-fixed bacteria can be placed under Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR), a group of bacteria that have a beneficial effect on plant growth and yield, because it promotes plant growth by another mechanism besides nitrogen fixation. to be. Therefore, the development of a microbial agent excellent in nitrogen fixing ability is required.
  • PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria
  • Korean Registered Patent No. 0755509 discloses 'New strain of Azospirilum Brasilens CW301, a biofertilizer using the same, and a manufacturing method thereof, having a nitrogen-fixing capacity and promoting crop growth.
  • Bacillus subtilis BK418 strain having a nitrogen fixing ability for improvement and environmental purification and its culture method is disclosed, but as in the present invention, 'Bacillus Velensis strain having nitrogen fixing ability and plant growth promoting activity and its use' Nothing is disclosed about.
  • the present invention is derived from the above requirements, the present invention does not use a chemical agent to reduce the occurrence of environmental pollution due to the use of chemical pesticides and chemical fertilizers and has a nitrogen fixing ability capable of environmentally friendly plant cultivation and crop cultivation To develop a microbial agent comprising the same.
  • Bacillus velezensis KN775 strain isolated from the present invention has a nitrogen fixing ability to fix the nitrogen in the atmosphere to convert to ammonium nitrogen, and promotes the growth of crops due to nitrogen fixation as an environmentally friendly microbial agent
  • the present invention was completed by directly confirming that it can be used very usefully through crops that are cabbage, bok choy and courgette.
  • the present invention provides a Bacillus velezensis strain having a nitrogen fixing ability and plant growth promoting activity.
  • the present invention also provides a microbial agent for promoting plant growth containing the strain or its culture as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for producing a microbial agent comprising the step of culturing the strain.
  • the present invention also provides a method for promoting the growth of a plant comprising the step of immersing or irrigating the strain into a plant or seed of the plant.
  • Bacillus velezensis KN775 strain having a nitrogen fixing ability of the present invention has a high efficiency of nitrogen fixing ability, showing the ability to promote the growth of crops by nitrogen fixing, environmentally friendly plant cultivation and safe cultivation of crops Possible microbial agents may be provided.
  • Bacillus Velensis KN775 strain of the present invention can positively affect plant growth, thereby broadening the range of bacteria beneficial for crop production as effective plant growth promoting bacteria. Therefore, the novel strain of the present invention can be used to improve the yield and quality of crops by replacing the chemical fertilizer in the eco-friendly organic farming where the use of fertilizer is limited, it is very useful for the related industry.
  • Figure 2 is a result of confirming the culture optimization and endogenous spore density using the industrial medium of Bacillus Velensis KN775 strain isolated in the present invention as the number of viable cells.
  • Figure 3 is a result of measuring the live weight and leaf color (SPAD) after the pot test proceeds to the treatment of cabbage Bacillus Velensis KN775 strain isolated in the present invention.
  • Figure 4 is a result of measuring the live weight and leaf color (SPAD) after the pot test proceeding to treat the Bacillus Velensis KN775 strain isolated in the present invention to the bok choy.
  • SPAD live weight and leaf color
  • Figure 6 is a result of examining the growth state of zucchini larvae after treatment of the Bacillus Velensis KN775 strain isolated in the present invention to the courgette plant.
  • Control EXTN treatment with Bacillus vallismortis as an active ingredient.
  • the present invention provides a Bacillus velezensis strain having a nitrogen fixing ability and plant growth promoting activity.
  • the Bacillus vegetans strain may be a Bacillus vegetans KN775 strain having an accession number of KCTC13396BP, but is not limited thereto.
  • the Bacillus Velensis KN775 strain was isolated from the wild mountain soil in Gyeongju, Gyeongsangbuk-do, and the Bacillus Velensis KN775 strain was deposited with KCTC13396BP on November 20, 2017 at the Korea Institute of Biotechnology.
  • the Bacillus Velensis KN775 strain increased the yield by supplying nutrients to the plant, in particular, the supply of nitrogen through nitrogen fixing ability.
  • microbial agents such as cabbage, bok choychae, and courgette through induction and formulation of endogenous spores through optimizing culture, it is possible to supply ammonia nitrogen to plants by fixing nitrogen in the atmosphere by eco-friendly farming without the use of chemical fertilizers. And increase the amount of harvest.
  • the present invention also provides a microbial agent for promoting plant growth containing the strain or its culture as an active ingredient.
  • the plant promoting growth may include most plants, preferably cabbage, bok choy or courgette, but is not limited thereto.
  • the microbial preparation may include Bacillus veletensis KN775 strain as an active ingredient, the microbial preparation is an organic working material for chemical fertilizer replacement. These preparations can be formulated in various ways, such as conventional plant growth promoting preparations, such as conventional liquid, granules, etc.
  • the composition of the composition for the plant or the soil for growing the plant is the type of plant, age, climate It may vary depending on conditions.
  • the microbial preparations for promoting plant growth according to the present invention may be prepared as solutions, powders, suspensions, dispersions, emulsions, oily dispersions, pastes, dusts, scattering materials or granules, but are not limited thereto.
  • the microbial agent may further comprise a surfactant suitable for formulation.
  • the surfactants include, but are not limited to, polycarboxylate, sodium lignosulfonate, calcium lignosulfonate, sodium dialkyl sulfosuccinate, sodium alkyl aryl sulfonate, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, sodium tripolyphosphate, Polyoxyethylene alkyl aryl phosphoric ester, polyoxyethylene alkyl aryl ether, polyoxyethylene alkyl aryl polymer, polyoxyalkylone alkyl phenyl ether, polyoxyethylene nonyl phenyl ether, sodium sulfonate naphthalene formaldehyde, triton X-100, One or more than one selected from the group consisting of tween 20 and tween 80 can be used.
  • the microbial preparation according to the present invention may be prepared in liquid form and may be used in the form of powdered powder by adding an extender thereto or granulated by formulating it.
  • the formulation is not particularly limited. In other words, it is possible to formulate a microbial agent in the form of organic materials to overcome this in eco-friendly organic farming where chemical fertilizer supply is limited. It also provides a use as a microbial agent that promotes the growth of crops using the Bacillus Velensis KN775 strain.
  • the culture cultured the strain may be formulated with a liquid agent, irrigation, immersed or sprayed into the seed of the crop or coated on the seed.
  • the present invention also provides a method of preparing a microbial preparation comprising culturing the Bacillus vegetosis KN775 strain of the present invention.
  • the method of culturing the Bacillus bellensis KN775 strain and the preparation method of the microbial agent may use any method known in the art, and are not particularly limited to the specific method.
  • the present invention also provides a method for facilitating the growth of a plant comprising the step of dipping or irrigation of the plant or strain of the Bacillus Velensis KN775 of the present invention.
  • a method for promoting the growth of the plant a method generally performed generally, that is, spraying (for example, spraying, misting, atomizing, powder spraying, granulating spraying, sleeping, permanent use, etc.), soil application (for example, For example, mixing, irrigation, etc.), surface use (for example, coating, smearing, coating, etc.), dipping, poisoning, and smoking.
  • the amount of use can be appropriately determined according to the body type, the damage situation, the application method, the application place, and the like.
  • the culture medium and the microbial preparation using the strain cultured the Bacillus Velensis KN775 strain can be carried out by immersing the seeds or plants or irrigation, that is, spraying.
  • the culture solution and the preparation may be poured into the soil around the plant or the seed may be soaked in the culture solution and the preparation, but is not limited thereto.
  • Plants capable of promoting growth by the method of the present invention may include most plants, preferably cabbage, bok choy or zucchini, but is not limited thereto.
  • the growth promotion of the plant may preferably be to increase the live weight, leaf color, leaf or yield of the plant, but is not limited thereto.
  • the production amount preferably means, but is not limited to, the number of fruits of the plant.
  • a sample of Yasan soil was collected in Gyeongju, Gyeongsangbuk-do, and 1 g of the sample was suspended in 9 ml of physiological saline (0.85% NaCl), and the supernatant was diluted (10 -4 to 10 -6 times) and used as a fungal sample.
  • TSA tryptic soy agar; Merck Co., Germany
  • 100 ⁇ l of the fungal sample dilution solution was applied to each solid medium, and each independent colony formed by incubating at 30 ° C. for 2 days was first separated into a form, color, and gloss, and then cultured in a liquid medium for 2 days, and then through a microscope.
  • Kanimozhi and Panneerselvam (2010, Der Chemica Sinica 1: 138-145) were used to measure the nitrogen fixation capacity. After inoculation into NFB (Nitrogen free broth) medium, the culture medium was incubated for 7 days, and the supernatant was collected by centrifugation. Azotobacter vinelandii and Bacillus velezensis FZB42 strains, which are known to have nitrogen fixing ability, were distributed and cultured, and compared with the Bacillus bellensis KN775 strain of the present invention. Nitrogen fixation ability was confirmed (FIG. 1).
  • the highest viable cell count was determined using 1% glucose as the carbon source and 1% soypeptone as the nitrogen source (Table 1). In addition, 0.2% KH 2 PO 4 was added to confirm the final viable cell number was 1.2 ⁇ 10 9 cfu / ml, which was selected as the final industrial medium.
  • the culture solution was taken at each time zone, heat treated at 70 ° C. for 30 minutes, and then killed the feeder cells. Endocrine spore density increased after 34 hours of culture and was highest after 48 hours. These results confirmed that the endogenous spore induction rate was highest in the feeder cells at 48 hours in culture medium, and the end of the culture was also confirmed as 48 hours. However, after 48 hours of incubation, the total viable cell count and endospores density was reduced (FIG. 2).
  • the Bacillus Velensis KN775 strain isolated from the present invention was prescribed as a liquid formulation, and the test was carried out, and the control strain Bacillus amyloliquefaciens GYL4 strain was used as a root live product sold by Kyung-Nong Co., Ltd. (crop of the present invention)
  • Each activity test is prescribed liquid solution and treated 500 times irrigation).
  • Drug treatment was 500 times irrigation twice a day 7 days after the leaf formation. After 16 days of the final treatment, the weight and green color were measured, and the result of the weight test was 269% higher than the no treatment and 133% higher than the control, and the chrominity test result was 9% higher than the no treatment and 6% higher than the control. Therefore, the Bacillus Velensis KN775 treatment of the present invention increased the live weight and leaf color compared to the control strain ( Bacillus amyloliquefaciens GYL4) and no treatment (Fig. 3).
  • a pot test was conducted using bok choy.
  • the drug treatment was 500 times irrigation once after the main leaf development, 500 times secondary irrigation after 10 days. After 25 days of the final drug treatment, the weight, leaf color, and leaf length were measured. The result of the weight test was 10% higher than no treatment, 6% higher than the no color test, and 17% higher than the no test. Therefore, the Bacillus Velensis KN775 treatment of the present invention increased both the live weight, the leaf color, and the leaf length compared to the untreated (Fig. 4).
  • the experiment was carried out in three repetition of the ingot method using cabbage in a plastic house.
  • Drug treatment was formulated after immersion treatment before formalization and then treated 500 times irrigation after 7 days. After 70 days of treatment, the weight, height and breadth of Chinese cabbage were examined, increasing to 9%, 6% and 3%, respectively.
  • the Bacillus velensis KN775 treatment of the present invention increased the height, width, and weight of the cabbage (Fig. 5).
  • the practice is cultivated in a general manner grown by farmers, which means that the microbial agent is not treated separately as in the present invention.

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Abstract

본 발명은 질소 고정능 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 질소 고정능을 가지는 바실러스 벨레젠시스( Bacillus velezensis) KN775 균주는 고효율의 질소 고정 능력을 가지고 있으며, 공기 중의 질소를 고정하여 작물의 생육 및 생산량을 증가 시키며, 친환경 식물재배 및 안전한 농작물의 재배가 가능한 미생물제제로 제공될 수 있다. 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주는 식물 생장에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있으므로, 효과적인 식물 생장 촉진 박테리아로서 작물 생산에 유익한 박테리아의 범위를 넓힐 수 있다. 또한, 본 발명의 신규한 균주는 미생물 제제로 제형화하여 친환경 유기농업자재로 이용이 가능하며, 작물의 수량 증대 및 품질을 향상시키는데 이용될 수 있다.

Description

질소 고정능 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이의 용도
본 발명은 질소 고정능 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
세계적으로 지난 수십 년간 곡류, 채소, 과수 등 농작물의 수량을 증가시키기 위하여 해마다 많은 양의 화학 비료와 함께 병, 해충 및 잡초 방제를 위한 화학 농약을 사용해 왔다. 이와 같은 계속적인 화학비료 및 농약 사용에 의하여 토양 산성화, 지력 손실, 환경오염과 생태계 파괴, 인축독성, 병해충 및 잡초의 농약에 대한 저항성 유발 등의 문제가 지속적으로 제기되고 있다.
화학 비료 및 농약을 대체하기 위하여 미생물을 이용한 비료 및 생물 농약 개발에 대한 연구가 급격히 증가하고 있다. 이렇게 개발된 미생물제는 대량 배양 후 제제화하여 처리함으로써 병해충을 방제하거나 미생물 비료 등으로 이용되기도 한다.
질소 고정 세균은 식물이 이용할 수 있는 암모니아로 대기 중의 N 2를 전환하는 능력이 있어 C는 충분하지만 N이 부족한 환경에서 식물 생장을 촉진시키는 능력이 있다. 질소 고정 세균은 식물 생장 및 수확량에 유리한 효과를 나타내는 세균 그룹인 식물 생장 촉진 근권 세균 (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR) 하에 위치할 수 있는데, 이는 질소고정 외에 또 다른 기작에 의해 식물 생장을 촉진하기 때문이다. 따라서 질소 고정능이 우수한 미생물제제 개발이 요구되는 실정이다.
한국등록특허 제0755509호에서는 '질소고정력 및 작물생장촉진 효과가 있는 신균주 아조스피릴룸 브라실렌스 CW301, 이를 이용한 생물비료 및 그 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1654793호에서는 '토양 개선 및 환경 정화용 질소 고정력을 갖는 바실러스 서브틸리스 BK418 균주 및 이의 배양 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '질소 고정능 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이의 용도'에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 화학제를 이용하지 않아 화학 농약 및 화학 비료 사용으로 인한 환경 오염의 발생을 줄이고 친환경 식물 재배 및 농작물 재배가 가능한 질소 고정능을 갖는 균주, 이를 포함하는 미생물 제제를 개발하는 것을 목적으로 한다.
이에, 본 발명에서 분리한 바실러스 벨레젠시스( Bacillus velezensis) KN775 균주는 대기 중의 질소를 고정하여 암모늄태 질소로 전환시키는 질소 고정 능력을 가지고 있으며, 질소 고정으로 인한 작물의 생육을 촉진하므로 친환경 미생물제제로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 배추, 청경채 및 애호박인 작물들을 통해 직접 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 질소 고정능 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 벨레젠시스( Bacillus velezensis) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물의 생장을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 질소 고정능을 가지는 바실러스 벨레젠시스( Bacillus velezensis) KN775 균주는 고효율의 질소 고정 능력을 가지고 있으며, 질소 고정으로 인한 작물의 생육 촉진능을 나타냄으로써, 친환경 식물재배 및 안전한 농작물의 재배가 가능한 미생물제제로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주는 식물 생장에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있으므로, 효과적인 식물 생장 촉진 박테리아로서 작물 생산에 유익한 박테리아의 범위를 넓힐 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 균주는 비료의 이용이 제한된 친환경 유기농업에서 화학비료를 대체하여 작물의 수량 증대 및 품질을 향상시키는데 이용될 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 본 발명에서 분리한 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주의 질소 고정능을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주의 산업용배지를 이용한 배양 최적화 및 내생포자 밀도를 생균수로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 배추에 처리하는 포트(pot) 시험 진행 후 생체중 및 엽색(SPAD)을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 분리한 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 청경채에 처리하는 포트(pot) 시험 진행 후 생체중 및 엽색(SPAD)을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명에서 분리한 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 배추에 처리 후 배추 결구의 생체중(구중)을 조사한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 분리한 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 애호박 식물체에 처리 후 애호박 엽장의 생육 상태를 조사한 결과이다. 대조구: 바실러스 발리스모르티스( Bacillus vallismortis)를 유효성분으로 하는 EXTN 처리.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 질소 고정능 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 벨레젠시스( Bacillus velezensis) 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바실러스 벨레젠시스 균주는 기탁번호가 KCTC13396BP인 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주는 경북 경주시의 야산 토양으로부터 분리하였으며, 상기 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2017년 11월 20일자로 기탁번호 KCTC13396BP로 기탁하였다.
상기 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주는 질소 고정능을 통해 식물체에 양분 공급, 특히 질소의 공급으로 수확량을 증가시켰다. 또한, 배양 최적화를 통한 내생포자 유도 및 제형화를 통하여 배추, 청경채, 애호박 등 미생물제제를 적용함으로써, 화학 비료 등의 사용 없이 친환경적 농법에 의하여 대기 중의 질소를 고정하여 암모니아성 질소를 식물체에 공급 가능하며, 수확물의 양을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미생물 제제에서, 상기 생장을 촉진시키는 식물은 대부분의 식물이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 배추, 청경채 또는 애호박일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물 제제는 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 상기 미생물 제제는 화학비료 대체용 유기농업자재이다. 이들 제제는 통상적인 방법으로 식물생장 촉진용 제제, 즉 통상적인 액상, 입제 등 다양한 형태로 제형화할 수 있으며, 상기 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 대한 적용범위는 식물의 종류, 나이, 기후 조건 등에 따라 변할 수 있다.
본 발명에 따른 식물 생장 촉진용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 미생물제제는 제제화하기에 적합한 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 계면활성제로는 이에 한정되지 않지만 폴리카르복실레이트, 리그노술폰산 나트륨, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 X-100, 트윈 20 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 즉 화학비료 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 유기농업자재 형태인 미생물 제제로 제형화가 가능하다. 또한, 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 이용하여 작물의 생장을 촉진시키는 미생물 제제로서의 이용법을 제공한다. 상기 균주를 배양한 배양액을 액상제로 제형화하여 관주하거나 작물의 종자에 침지 또는 분무하거나 종자에 코팅하여 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주의 배양 방법 및 미생물 제제의 제조 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물의 생장을 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 식물의 생장을 촉진하는 방법으로는 통상 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있다. 그 사용량은, 그 체형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 바람직하게는, 상기 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주를 배양한 배양액 및 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 종자나 식물에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 제제에 담가둘 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 생장을 촉진할 수 있는 식물로는 대부분의 식물이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 배추, 청경채 또는 애호박일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물의 생장 촉진은 바람직하게는 식물의 생체중, 엽색, 엽장 또는 생산량을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 생산량은 바람직하게는, 식물의 열매의 수를 의미하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주 동정
경북 경주시 야산 토양 시료를 채취하여 시료 1g을 생리식염수(0.85% NaCl) 9 ㎖에 현탁한 후 상등액을 희석하여(10 -4 ~ 10 -6 배) 균원 시료로 사용하였다. 균주를 분리하기 위한 배지는 TSA(tryptic soy agar; Merck Co., Germany) 배지를 사용하였다. 각각의 고체배지에 균원 시료 희석 용액을 100㎕씩 도말하고 30℃에서 2일간 배양하여 형성된 각각의 독립 콜로니를 형태, 색깔 및 광택 등으로 1차 분리한 후 액체배지에서 2일간 배양 후 현미경을 통하여 내생포자를 형성하는 바실러스 균주 위주로 2차 분리를 하였다. 분리한 균주들은 동일 평판배지에서 재차 접종하여 30℃에서 2일간 배양하여 순수 분리하였다. 이후 얻어진 16S rRNA 시퀀스(서열번호 1) 분석 결과, 바실러스 벨레젠시스( Bacillus velezensis FZB42, ACCESSION No.: NR_075005)와 98%의 상동성을 가지는 균주로 확인되었다. 분리 동정된 균주를 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주로 명명하고, 이는 형태학적으로 그람 양성 간균에 해당하며, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC13396BP로 기탁하였다.
실시예 2. 대조 균주를 이용한 질소 고정능 비교 평가
질소 고정능력을 확인하기 위하여 Kanimozhi와 Panneerselvam (2010, Der Chemica Sinica 1: 138-145)의 질소 고정능력 측정법을 응용하여 사용하였다. NFB (Nitrogen free broth) 배지에 접종 후 7일간 배양 후 변색된 배양액을 원심분리하여 상등액만 취하여 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 질소 고정능이 있다고 알려진 아조토박터 비네란디( Azotobacter vinelandii)와 바실러스 벨레젠시스( Bacillus velezensis) FZB42 균주를 분양 및 배양하여 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주와 비교 분석한 결과, 대조 균주보다 월등한 질소 고정능을 확인하였다(도 1).
실시예 3. 산업용 배지를 이용한 5L 배양최적화
0.5 % NaCl, 0.25 % K 2HPO 4, 0.03 % MgSO 4·7H 2O를 기본 배지로 이용하여 산업용 배지로 많이 사용되는 탄소원 및 질소원을 각각 1% 농도로 접종하여 24시간 후 생균수 검정을 하였다.
Figure PCTKR2019004697-appb-img-000001
탄소원으로 1% 글루코스, 질소원으로 1% 소이펩톤을 배지로 이용시 가장 높은 생균수로 확인되었다(표 1). 그 외 0.2% KH 2PO 4를 첨가하여 최종 생균수가 1.2 X 10 9 cfu/㎖로 확인되어 최종 산업용 배지로 선발하였다.
5L 배양 최적화를 통한 내생포자 밀도를 확인하기 위해서 시간대별 배양액을 채취한 후 70℃에서 30분간 열처리 후 영양세포를 사멸시킨 다음 내생포자를 측정하였다. 배양 34시간 이후 내생포자 밀도가 증가하였으며 48시간 이후 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 산업용 배지에서는 배양 48시간 시점에 영양세포에서 내생포자 유도율이 가장 높은 것을 확인하였으며, 배양종료 시점 또한 48시간으로 확정할 수 있었다. 하지만 배양 48시간 이후부터는 총 생균수 및 내생포자 밀도가 감소하는 것으로 나타났다(도 2).
실시예 4. 배추 활성검정_포트
배추를 이용한 포트(pot) 시험을 진행하였다. 본 발명에서 분리한 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주는 액상제로 처방하여 시험을 진행하였으며, 대조 균주인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 GYL4 균주는 ㈜경농에서 판매되는 있는 루트라이브 제품을 이용하였다(본 발명의 작물별 활성검정은 모두 액상제 처방하여 500배 관주 처리 함). 약제처리는 본엽 발생 후 7일 간격 2회 500배 관주처리 하였다. 최종 약제처리 16일 후 생체중 및 엽색을 측정한 결과 생체중 시험 결과 무처리 대비 269%, 대조구 대비 133% 증가하였고, 엽색도 시험 결과 무처리 대비 9%, 대조구 대비 6% 증가하였다. 따라서, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KN775 처리는 대조균주( Bacillus amyloliquefaciens GYL4) 및 무처리 대비 생체중 및 엽색이 증가하였다(도 3).
실시예 5. 청경채 활성검정_포트
청경채를 이용한 포트(pot) 시험을 진행하였다. 약제처리는 본엽 발생 후 1회 500배 관주, 10일 후 500배 2차 관주 처리하였다. 최종 약제처리 25일 후 생체중, 엽색 및 엽장을 측정한 결과, 생체중 시험 결과 무처리 대비 10%, 엽색도 시험 결과 무처리 대비 6%, 엽장 시험 결과 무처리 대비 17% 증가하였다. 따라서, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KN775 처리는 무처리 대비 생체중, 엽색 및 엽장이 모두 증가하였다(도 4).
실시예 6. 배추 활성검정_포장
비닐하우스에서 배추를 이용한 난괴법 3반복으로 실험을 실시하였다. 약제처리는 정식 전 침지처리 후 정식한 다음 7일 후 500배 관주 처리하였다. 약제처리 70일 후 배추의 구중, 구고 및 구폭을 조사한 결과, 관행 대비 각각 9%, 6% 및 3%로 증가하였다. 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KN775 처리는 배추에 대한 구고, 구폭, 구중 모두 증가하였다(도 5). 참고로, 관행은 농민들이 재배하는 일반적인 방법으로 재배한 것으로, 본 발명과 같이 미생물제제를 별도로 처리하지 않은 것을 의미한다.
실시예 7. 애호박 활성검정_포장
비닐하우스에서 애호박을 이용한 생산량을 조사하였다. 약제처리는 정식 시 500배 관주 1회, 7일 후 500배 1회 관주처리 하였다. 바실러스 벨레젠시스 KN775는 대조구 및 관행 대비 생육 및 수확량이 증가하였다(도 6 및 표 2). 참고로, 대조구는 (주)팜한농에서 제조 판매하는 것으로, 바실러스 발리스모르티스( Bacillus vallismortis)를 유효성분으로 하는 EXTN을 처리한 것이다. EXTN을 물에 부피비로 1000배 희석, 혼합하여 대조구로 준비하였으며, 관행은 농민들이 재배하는 일반적인 방법으로 재배한 것으로, 본 발명과 같이 미생물 제제를 별도로 처리하지 않은 것을 의미한다.
Figure PCTKR2019004697-appb-img-000002
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13396BP
수탁일자 : 20171120
Figure PCTKR2019004697-appb-img-000003

Claims (6)

  1. 질소 고정능 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 벨레젠시스( Bacillus velezensis) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바실러스 벨레젠시스 균주는 기탁번호가 KCTC13396BP인 바실러스 벨레젠시스 KN775 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항 또는 제2항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 미생물 제제.
  4. 제1항 또는 제2항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항의 균주를 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물의 생장을 촉진하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물의 생장 촉진은 식물의 생체중, 엽색, 엽장 또는 생산량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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