KR101756682B1 - 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이 균주, 이를 포함하는 미생물 제제및 이를 포함하는 생물 비료 - Google Patents

질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이 균주, 이를 포함하는 미생물 제제및 이를 포함하는 생물 비료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 이를 포함하는 생물 비료에 관한 것으로, 높은 효율의 질소 고정능을 나타내는 신규한 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 생물 비료에 관한 것이다.

Description

질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이 균주, 이를 포함하는 미생물 제제및 이를 포함하는 생물 비료{CEDECEA LAPAGEI STRAIN HAVING NITROGEN FIXATION ACTIVITY, MICROBIAL AGENT CONTAINING THE SAME AND BIOFERTILIZER CONTAINING THE SAME}
본 발명은 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 상기 미생물 제제를 포함하는 생물 비료에 관한 것이다.
세계적으로 지난 수십 년간 곡류, 채소, 과수 등 농작물의 수량을 증가시키기 위하여 해마다 많은 양의 화학 비료와 함께 병, 해충 및 잡초 방제를 위한 화학 농약을 사용해 왔다. 이와 같은 계속적인 화학 비료 및 농약 사용에 의하여 토양 산성화, 지력 손실, 환경오염과 생태계 파괴, 인축독성, 병해충 및 잡초의 농약에 대한 저항성 유발 등의 문제가 지속적으로 제기되고 있다.
국내외에서는 이러한 문제들을 해결하기 위하여 화학 비료 및 농약의 사용량을 감축하고자 노력하고 있으며, 특히 우리나라에서는 1999년 친환경농업 육성법을 제정하여 2013년까지 약 40% 정도의 화학 비료 및 농약 사용량 감축 노력을 계속해오고 있다. 이와 동시에 사회적으로는 생활수준 향상으로 인한 안전 식품에 대한 국민의 요구가 증가되고 있고, 농업 생산 환경 및 자연 생태계의 보존을 지향하는 유기농업이나 자연농법 등의 친환경농업이 급속히 확대되고 있어, 화학 비료 및 농약을 대체할 수 있는　미생물을 이용한 비료 및 생물 농약 개발에 대한 연구가 급격히 증가되고 있다. 이렇게 개발된　미생물제는 대량 배양 후 제제화하여 엽면 살포 또는 입제로 토양 처리함으로써 병해충을 방제하거나　미생물　비료로 이용되기도 한다.
한편, 중요한 식물 영양분인　질소(N)는 화학 비료의 시용에 의해 대부분 유지되며,　질소의 결핍 시 식물 생장에 어려움을 초래한다. 수확량을 높이기 위해 화학 비료를 과잉 이용하는 것은 저투입으로 높은 생산성을 추구하는 지속가능한 농업의 원리에 반하며, 환경적으로도 문제가 될 수 있다(Shantharam, S. and A.K. Mattoo. 1997.　Plant Soil 　194, 205-216). 화학 비료의 단점이 인식되었음에도 불구하고, 최대 작물 수확에 대한 충분한 유전적 잠재력은 거의 인식되지 않고 있다(Kennedy　et al. 2004.　Soil Biol . Biochem .　36, 1229-1244).　질소 고정세균　및 고등식물 사이의 복잡한 상호작용 중의 하나인 대기 중　질소를　고정하여 이용하는 생물학적　질소　고정(Biological Nitrogen Fixation, BNF)은 양분공급, 특히　질소의 공급으로 수확량이 최적으로 유지되는 것을 도울 수 있다.
질소 고정 세균은 식물이 이용할 수 있는 암모니아로 대기 중의 N2를 전환하는 능력이 있어 C는 충분하지만 N이 부족한 환경에서 식물 생장을 촉진시키는 능력이 있다.　질소 고정 세균은 식물 생장 및 수확량에 유리한 효과를 나타내는　세균　그룹인 식물 생장 촉진 근권 세균(Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR) 하에 위치할 수 있는데, 이는　질소　고정　외에 또 다른 기작에 의해 식물 생장을 촉진하기 때문이다.　질소　비료의 사용을 줄이는 것 외에 식물과　질소 고정 세균의 상호작용을 이용하는 것은 사용된 비료의 효율을 증가시킬 수 있다(Okon, Y. and C.A. Labandera-Gonzolez. 1994.　Soil Biol . Biochem .　26, 1591-1601).
본 발명의 일 측면은, 화학제를 이용하지 않아 화학 농약 및 화학 비료 사용으로 인한 환경 오염의 발생을 줄이고, 친환경 식물 재배 및 농작물 재배가 가능한 질소 고정능을 갖는 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 이를 포함하는 생물 비료를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 구현예는, 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주를 제공한다.
상기 균주는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예는, 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
상기 균주는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)인 것이 바람직하다.
상기 미생물 제제는 생물 비료용 미생물 제제인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예는, 상기 미생물 제제를 포함하는 생물 비료를 제공한다.
상기 미생물 제제는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주는 고효율의 질소 고정능을 나타냄으로써, 화학 비료 등을 대신하여 생물 비료로 활용이 가능하며, 따라서 친환경 식물 재배 및 농작물의 재배가 가능한 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제를 제공할 수 있다.
도 1은 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)로부터 NifH 유전자 확인 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
본 발명의 일 구현예는, 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주를 제공한다.
이때, 상기 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC 81003BP로 기탁된, 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)인 것이 바람직하며, 또한, 상기 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주는, 환경미생물은행(Korea Environmental Microorganisms Bank)에 수탁번호 KEMB 1501-001로 기탁된 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주(KEMB 1501-001)인 것이 바람직하다.
상기 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주, 특히 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)는 질소 고정을 통해 식물체에 양분 공급, 특히 질소의 공급으로 수확량이 최적으로 유지되는 것을 도울 수 있다. 상기 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주는, 질소 고정능을 통해 대기 중의 질소(N2)를 암모니아로 전환할 수 있어 탄소원(C)은 충분하지만 질소원(N)이 부족한 환경에서도 식물의 생장을 촉진시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)는, 질소 고정능을 나타내는 유전자로 NifH 유전자를 포함하는 것이 바람직하고, 이로부터 질소 고정이 가능한 균주인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예는, 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) 균주 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
이때, 상기 균주는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)인 것이 바람직하다.
또한, 상기 미생물 제제는, 화학 비료를 대체하기 위한 생물 비료 등에 적용 가능한 것으로, 생물 비료용 미생물 제제인 것이 바람직하고, 상기 미생물 제제는 통상적인 방법으로 제형화할 수 있으며, 예를 들어 건조분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 수 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
상기 액상비료 형태의 경우, 토양에 뿌려서 토양과 혼합하여 사용가능하고, 건조분말 형태의 경우 비료 형태로, 토양에 뿌려 사용이 가능하다. 또한 상기 미생물 제제는 담체, 부식토 등을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 상기 미생물 제제는 다양한 식물에 적용되어, 생물 비료로 활용 가능하며, 이때 상기 식물은 예를 들어 옥수수, 당근, 양배추, 감자 등으로, 상기 미생물 제제를 적용함으로써, 화학 비료 등의 사용 없이 친환경적 농법에 의하여 대기 중의 질소를 고정하여 암모니아성 질소를 식물체에 공급가능하며, 수확물의 양을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는, 상기 미생물 제제를 포함하는 생물 비료를 제공한다. 이때, 상기 미생물 제제는, 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)의 질소 고정능에 의하여 대기 중의 질소를 고정하여 암모니아성 질소를 식물체에 공급할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하는 바, 본 발명이 다음 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 및 비교예 >
1. 토양 및 배지 조성
말산(malic acid) 배지와 토양 추출물 0.1%를 섞어 배지를 조성하였다. 구체적으로 상기 말산(malic acid) 배지는 Malic acid 3.2 g, KH2PO4 3.0 g, MgSO4 0.1 g, CaCl2 5 mg, 글루탐산 모노 나트륨(mono sodium glutamate) 0.1 g, 미량 원소(trace element)(1X) 1 ml, 비타민 용액(vitamin solution) 1 ml를 혼합하고, 최종 pH 6.3으로 고압 멸균 후 사용하였다.
이때, 상기 미량원소는 1차 증류수와 에탄올을 이용하여 토양으로부터 3일간 진탕배양(30℃, 120rpm)을 통해 추출하였으며, 상기 토양 추출물은 멤브레인 필터(membrane filter, 기공 직경 0.22㎛)를 이용하여 진공 필터 후 적용하였다.
2. 질소 고정 미생물 분리
경상남도 문경과 충청북도 연천에서 채취한 토양으로부터 질소 고정 미생물을 분리하였다. 이때, 연속 희석 방법과 평판 도말 방법을 이용하여 균주를 분리하였고, 구체적으로 토양 1g을 1차 증류수 9ml에 넣고 1시간 동안 볼텍스(vortex)후, 10-7까지 희석하였다. 10-5, 10-6, 10-7로 희석된 시료를 질소원이 없는 배지에 평판 도말 방법을 이용하여 도말하였으며, 28℃에서 3일 동안 배양 후 순수 분리하였다.
3. 질소 고정능 측정
질소 고정능을 측정하기 위하여 아세틸렌 환원법(Acetylene Reduction Assay, ARA)을 이용하였다. 상기 아세틸렌 환원법은 질소 고정 미생물이 공통적으로 가지고 있고, N2 가스 또는 아세틸렌과 같은 3중 결합을 가진 물질을 환원시킬 수 있는 효소인 질소 고정효소(nitrogenase)의 활성을 간접적으로 측정하는 방법으로 질소 고정효소에 의해 아세틸렌이 에틸렌으로 환원되었을 때 생성되는 에틸렌의 양을 측정함으로써 질소 고정능을 측정할 수 있다.
상기 아세틸렌 및 에틸렌의 변화량은 GC-TCD(Gas Chromatography-Thermal Conductivity Detector)로 측정하였으며, 이때 상기 GC-TCD의 조건은 하기 표 1과 같다.
오븐(oven) 주입구(inlet) 검출기(Detector) 운반가스(Carrier gas)
60℃, 4분, 유지(Holding) 250℃ 250℃ 헬륨(He)
200℃, 1분, 유지(Holding)(60℃/min) 분할비율(Split ratio)
50:1
4. 통성 혐기 조건에서 질소 고정능 측정
대표적인 질소 고정균인 리조비움 속(Rhizobium sp.) 단일 균주를 이용하여, 아세틸렌 환원법으로 질소 고정능을 측정한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 비교예 1 내지 11의 균주의 경우, 5일 배양 후 아세틸렌의 양은 감소하였으나, 제거율은 2.11 내지 16.63%로 매우 낮게 측정되었으며, 에틸렌의 생성은 확인되지 않았다.
구분 균주 아세틸렌(ml) 에틸렌 생성량(ml)
0일
평균(표준)		 5일
평균(표준)		 제거율(%)
비교예 1 Rhizobium soli R001-001 4.99 (0.56) 4.16 (0.15) 16.63 0
비교예 2 Rhizobium monogolense R001-002 5.00 (0.24) 4.90 (0.53) 1.90 0
비교예 3 Rhizobium gallicum R001-003 5.44 (0.27) 4.76 (0.17) 12.50 0
비교예 4 Rhizobium loessense R001-004 5.24 (0.24) 5.00 (0.40) 4.58 0
비교예 5 Rhizobium mesosinicom R001-005 5.72 (0.70) 4.88 (0.40) 14.69 0
비교예 6 Rhizobium fabea R001-006 5.21 (0.31) 5.10 (0.56) 2.11 0
비교예 7 Rhizobium etli R001-007 4.83 (0.00) 4.44 (0.00) 8.00 0
비교예 8 Rhizobium sullae R001-008 5.29 (0.46) 4.93 (0.31) 6.81 0
비교예 9 Rhizobium pisi R001-009 5.22 (0.57) 5.02 (0.53) 3.74 0
비교예 10 Rhizobium alamii R001-010 5.26 (0.52) 5.04 (0.38) 4.09 0
비교예 11 Rhizobium yanglingense R001-011 5.22 (0.74) 4.83 (0.49) 7.48 0
한편, 토양에서 분리한 균주를 이용하여, 아세틸렌 환원법을 이용하여 에틸렌의 생성 여부를 확인하였으며, 그 결과 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 실시예 1의 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)에서 에틸렌의 생성을 확인할 수 있었다.
구분 균주 아세틸렌(ml) 에틸렌 생성량(ml)
0일 5일 제거율(%)
비교예 12 Paenibacillus sonchi MK5 6.37 5.34 16.11 0
실시예 1 Cedecea lapagei MK7 (KACC 81003BP) 6.22 2.63 57.73 1.08
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)는, 아세틸렌 환원법에 의할 때, 아세틸렌의 제거율은 57.73%로 높게 제거되었음을 알 수 있으며, 특히 에틸렌이 1.08ml 생성되어, 우수한 질소 고정능을 갖는 균주임을 확인할 수 있다.
5. 16S rRNA 염기서열에 의한 질소 고정 미생물의 동정
한편, 상기 표 3에서 확인된 질소 고정능을 갖는 균주로, 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7을 동정하기 위해 16S rRNA 유전자의 염기 서열을 분석하기 위하여 분리된 단일 균주를 염기서열 분석회사인 Macrogen에 의뢰하였으며, 통용적으로 사용되는 프라이머 785F와 907R를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석을 통해 얻은 염기서열은 EZbiotexon을 이용하여 근연종을 확인하였으며, 그 결과 상기 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7은 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) GTC 346T와 98.36%의 유사도를 나타내었다.
또한, 질소 고정 유전자 (Nitrogen fixing gene, Nif gene)의 확인을 위하여 중합효소 연쇄반응 (PCR, Polymerase chain reaction)을 수행하였다. 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP) 에서 DNA를 추출한 후, 프라이머 NifH (F-5' CGTTTT ACGGCAAGGGCGGTATCGGCA-3', R-5' TCCTCCAGCTCCTCCATGGTGATCGG-3')를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. 95℃에서 5분동안 전-변성(Pre-denaturation) 후, 95℃에서 30초동안 변성(denaturation), 56℃에서 40초동안 풀림(annealing), 72℃에서 30초동안 신장 (extension)과정을 30회 반복 후, 72℃에서 7분동안 후-신장 (post-extensiong)후 4℃에서 보관하였다.
중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 부산물은 1% 아가로즈 겔 (1% agarose gel)과 1X TAE buffer에서 20분간 전기영동(electrophoresis)하여 크기를 확인하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 약 230bp에 목적 유전자 (target gene) NifH (화살표)를 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP)가 가지고 있음을 확인하였다(M은 1kb 플러스 마커(1kb plus marker)이고, MK7은 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP) 에서 DNA를 추출한 후, 프라이머 NifH 를 이용하여 PCR 후 부산물을 전기영동한 것임).
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC81003BP 20150629
<110> KYONGGI UNIVERSITY INDUSTRY & ACADEMIA COOPERATION FOUNDATION <120> CEDECEA LAPAGEI STRAIN HAVING NITROGEN FIXATION ACTIVITY, MICROBIAL AGENT CONTAINING THE SAME AND BIOFERTILIZER CONTAINING THE SAME <130> DPP-2015-1310-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1471 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Cedecea lapagei <400> 1 tttacactgt gggcacacgt atcacacgca catctagcgc tatcgcacaa gaagctggtt 60 tttgggtgac gagcggcgga cgggtgagta atgtctggga aactgcctga tggaggggga 120 taactactgg aaacggtagc taataccgca taacgtcgca agaccaaaga gggggacctt 180 cgggcctctt gccatcagat gtgcccagat gggattagct agtaggtggg gtaacggctc 240 acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca 300 cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga 360 tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt cagcgaggag 420 gaaggcattg tggttaataa ccgcagtgat tgacgttact cgcagaagaa gcaccggcta 480 actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc 540 gtaaagcgca cgcaggcggt ctgtcaagtc ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga 600 actgcattcg aaactggcag gctagagtct tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc 660 ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacaaaga 720 ctgacgctca ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780 ccgtaaacga tgtcgacttg gaggttgttc ccttgaggag tggcttccgg agctaacgcg 840 ttaagtcgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg 900 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctact 960 cttgacatcc acggaattta gcagagatgc tttagtgcct tcgggaaccg tgagacaggt 1020 gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080 aacccttatc ctttgttgcc agcggttcgg ccgggaactc aaaggagact gccagtgata 1140 aactggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacgagta gggctacaca 1200 cgtgctacaa tggcgcatac aaagagaagc gacctcgcga gagcaagcgg acctcataaa 1260 gtgcgtcgta gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta 1320 atcgtagatc agaatgctac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380 accatgggag tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc ttcgggaggg cgcttaccac 1440 tttgtgattc atgactgggg tgaagtcgta a 1471

Claims (7)

  1. 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP).
  2. 삭제
  3. 질소 고정능을 갖는 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) MK7 균주(KACC 81003BP) 또는 이의 배양물을 유효 성분으로 포함하는 미생물 제제.
  4. 삭제
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 미생물 제제는 생물 비료용 미생물 제제인 미생물 제제.
  6. 청구항 3의 미생물 제제를 포함하는 생물 비료.
  7. 삭제
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