KR102559046B1 - 세데세아 라파제이 cwl-11 균주 및 이를 포함하는 식물 생장 조절용 조성물 - Google Patents

세데세아 라파제이 cwl-11 균주 및 이를 포함하는 식물 생장 조절용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주, 이를 포함하는 식물 생장 조절용 조성물, 및 이를 이용한 식물 생장 조절 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 균주 및 조성물은 식물의 생장을 효과적으로 조절 및 촉진할 수 있어, 다양한 식물의 생장 조절제로 사용될 수 있다.

Description

세데세아 라파제이 CWL-11 균주 및 이를 포함하는 식물 생장 조절용 조성물 {Cedecea lapagei CWL-11 strain and composition for regulating plant growth comprising the same}
본 발명은 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주 및 이를 포함하는 식물 생장 조절용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 식물 생장 조절용 화합물을 생성하여 다양한 식물의 생장을 촉진할 수 있는 균주 및 이를 포함하는 식물 생장 조절용 조성물과 이를 이용한 식물 생장 촉진 방법에 관한 것이다.
농업기술이 발전되기 시작된 이래로 현재 세계 각국 및 각국의 기업들은 유기 화합물을 기본으로 한 농약 및 식물 생장 촉진제를 개발 및 사용하여 왔다. 한편, 기존에 사용되는 화학 비료는 최근에 환경오염 문제와 함께 농작물 오염의 문제가 심각하게 제기되어 왔고, 기존의 화학 비료를 양질의 유기질 비료를 사용하는 농법이 개발되기 시작하였다. 하지만, 화학 비료의 대안으로 사용되던 유기질 비료는 화학 비료와 그 구성성분의 차이만 있을 뿐, 토양 오염, 토양양분 불균형, 병해충 발생 및 연작장해 등의 화학 비료와 비슷한 문제점을 야기시켰다.
이와 같은 배경에서, 최근에는 농업환경 및 생태계 부담을 최소화하면서도 안전한 먹거리를 수급할 수 있는 생물학적 농법이 활발히 연구되고 있다. 그 일환으로, 식물과 완전한 공생관계를 갖지 않으면서도 식물을 생장을 촉진할 수 있는 미생물을 이용한 친환경적 작물 성장 촉진제에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 이러한 친환경적 작물 성장 촉진제에 이용되는 식물 생장 촉진 미생물로는 공중질소를 고정하는 아조스퍼릴럼 (Azospirrilum)속 균, 슈도모나스 (Pseudomonas)속 균, 바실러스 (Bacillus)속의 균 등이 알려져 있고, 이들은 공기 중 질소 고정, 식물 성장 호르몬 생산, 식물의 양분흡수 촉진, 식물 질병 발생 억제 등의 기능을 하는 것으로 알려져 왔다.
하지만, 기존에 친환경 식물 성장 촉진제로 알려진 미생물들은 최근 인산 가용화 능력 또는 식물 생장 촉진 화합물인 인돌-3-아세트산 (indole-3-acetic acid; IAA) 생산능이 충분하지 못하여 식물 성장 효과가 미미하거나, 한국의 토양에서 작물 재배 시험 시 충분한 효과를 나타내지 못하는 문제점이 있는 것으로 발생하는 것으로 보고되고 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명은 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주가 식물 생장 조절용 조성물을 생산할 수 있음을 규명하였고, 본 발명에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물이 식물의 생장을 월등하게 조절 또는 촉진할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 식물 생장 조절능을 가진 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주를 제공하는 것이다.
이에, 본 발명의 다른 목적은 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주, 균주의 배양물, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물 및 균주의 배양 상등액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 식물 생장 조절용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물 생장 조절 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물 생장 조절용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물 생장 조절능을 가진 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주, 이를 포함하는 식물 생장 조절용 조성물, 및 이를 이용한 식물 생장 조절 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 균주 및 조성물은 식물의 생장을 효과적으로 조절 및 촉진할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 식물 생장 조절능을 가진 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주이다.
본 명세서 상의 용어 "세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주"는 전라도 지역 토양에서 최초로 분리·동정한 균주로, TS 고체배지에서 원형의 집락 (Circular colony)을 형성하며 점성이 없고, 옅은 노란색을 띤다 (도 1 참조).
본 발명에 따른 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주는 대한민국의 전라도 지역 토양에서 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주의 16s rRNA 서열은 서열번호 3의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주는 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) 종과 99% 상동성을 가지고 있음이 확인되었으며, 양 균주간의 상이성이 인정되었다.
본 발명에 따른 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주의 상동성은 기존 공시 균주와의 상동성은 유전자 은행 데이터베이스의 Blast 검색을 통해 확인되었다.
본 발명자들은 수득한 균주를 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2022년 10월 28일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC15159BP를 부여받았다.
본 명세서 상의 용어 "식물 생장"은 식물의 씨앗이 발아하여 뿌리· 줄기· 잎을 내거나 또는 그 후 점차 크기와 무게를 더해가는 과정을 의미한다. 본 발명에서 "식물 생장 조절"은 식물의 씨앗의 발아 또는 발아된 식물의 크기와 무게의 증가를 조절 또는 촉진하는 것을 의미하며, 따라서, 본 명세서에서 용어 "식물 생장 조절"은 식물 생장 촉진과 상호 교차되어 사용될 수 있다. 본 발명의 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주는 인돌-3-아세트산 (indole-3-acetic acid; IAA) 생산 능력을 가져 식물생장 촉진 효과를 가지므로, 일반 토양 및 간척지 등의 다양한 토양 환경에서 식물 생장 촉진에 매우 유용하게 사용될 수 있다
본 발명의 구체적인 일 실시예에서 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주는 446.67 ± 8.06 mg/L 이상의 인돌-3-아세트산 (indole-3-acetic acid; IAA)를 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태는, 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주, 균주의 배양물, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물 및 균주의 배양 상등액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 생장 조절용 조성물이다.
본 발명의 일 구현예에서, 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주의 16s rRNA 서열은 서열번호 3의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명자들은 수득한 균주를 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2022년 10월 28일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC15159BP를 부여받았다.
본 명세서 상의 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 포함한다. 본 발명에서 "발효"를 포함하는 개념으로서 용어 "배양물"은 "발효물"을 포함하는 의미이고, 배지에서 배양한 배양액 자체(즉, 균을 포함하고 있는 배양액 자체), 또는 배양액에 열처리를 가한 가공물 등 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 유효성분인 균주, 이의 배양물, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물 및/또는 균주의 배양 상등액 외에 균체를 포함하는 배양물, 균체의 추출물, 이들의 농축액, 농축물, 건조물, 또한 필요에 따라서 희석액, 희석물 등을 포함할 수 있으며, 배양액, 배양물을 처리하여 얻어지는 모든 상태의 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 균주의 배양법, 추출법, 분리법, 농축법, 건조법, 희석법 등은 특별히 한정되지 않는다.
균주를 배양하기 위한 배지에는 통상적으로 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 효모 엑기스 등이 포함될 수 있다. 배양 방법으로는 일반적인 각종 호기적 또는 혐기적인 방법을 적당히 사용될 수 있고, 균주를 배양한 후에는 필요에 따라 배양물이나 그 상층액을 농축, 건조, 희석할 수도 있다.
또한, 원심분리법이나 막분리법을 사용하여 배양물의 상층액과 균체를 분리하여 균체를 농축한 상태로 회수할 수도 있다. 그리고 균체에 초음파 처리나 효소 처리 등을 행하여 균체 내의 성분을 추출하거나, 배양물이나 그 상층액, 균체나 그 추출물 등을 건조할 수도 있다. 이들은 본 발명의 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현에에서, 조성물은 화학식 1의 화합물을 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
본 발명에 따른 조성물은 인돌-3-아세트산의 생성 능력이 현저하게 우수하여, 다양한 식물체의 생장을 조절 또는 촉진할 수 있다.
본 발명에 따른 식물 생장 촉진용 조성물을 일반적인 식물 생장 조절제의 산포 방법과 동일한 방법을 사용하여 산포될 수 있다. 본 발명의 조성물을 산포하는 시기는, 종자, 씨감자 또는 구근 등의 경우에는 식재 전일 수 있으며, 토양에 처리하는 경우에는 실생 식재 후에 생육 기간 동안에 임의의 시기일 수 있고, 향상된 효능을 위해서는 파종, 육묘 또는 실생 식재일 때일 수 있으며, 경엽 산포 또는 분주의 경우에는 농장에서의 육묘 기간 동안 및 생육 기간 동안이라면 어느 때라도 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 식물 생장 촉진용 조성물은 미생물 제제일 수 있고, 미생물 제제는 통상적인 방법으로 제형화할 수 있으며, 건조분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있으나, 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
본 명세서상의 용어 "미생물 제제"는 미생물 자체를 직접 이용하거나 미생물을 포함한 제제를 이용하여 각종 식물의 생장을 효과적으로 촉진하는데 쓰이는 생물 제제이다.
본 발명에 있어서 미생물 제제는 균주 또는 이의 배양물에 첨가제, 증량제, 영양제등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 첨가제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
증량제 및 영양제로는 skim milk (배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트 (bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상이 사용될 수 있다.
붕해제로는 벤토나이트 (bentonite), 탈크 (talc), 다이아라이트 (dialite), 카올린 (kaolin) 및 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에서 조성물에 함유된 미생물의 유효량은 경작지 면적(㎡) 당 1 내지 1 X 10100의 미생물 수로 포함될 수 있다. 조성물이 살포에 의해 처리되는 경우, 조성물에는 균주가 ml 당 1 내지 1X10100의 미생물 농도로 포함될 수 있으며, 침지에 의해 처리되는 경우, 조성물에 함유된 미생물의 유효량은 ml당 1 내지 1 X 10100의 미생물 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 식물 생장 조절 및/또는 촉진 방법이다:
세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주, 균주의 배양물, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물 및 균주의 배양 상등액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 식물체에 접촉시키는 접촉 단계.
본 명세서 상의 용어 "식물체"는 완전한 식물체 또는 완전한 식물체로부터 분리된 일부를 의미한다.
본 명세서에서 "식물"로 지칭되는 경우, 달리 언급하지 않는 한, 식물세포, 식물조직, 종자 또는 식물체를 모두 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "식물"은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 부추, 청경채, 시금치, 아스파라거스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수 박, 오이, 양배추, 꽃양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 가지를 포함하는 채소 작물류; 황금, 황기, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 도라지, 연근을 포함하는 근채류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나 나를 포함하는 과수류; 패랭이꽃, 안개꽃, 과꽃, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "접촉"은 본 발명에 따른 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주, 균주의 배양물, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물 및 균주의 배양 상등액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 식물체에 노출시키는 것을 의미한다. 접촉은 미생물제제를 살포하거나 도포함으로써 이뤄질 수 있고, 살포 또는 도포 방법은 당업계에 알려진 방법이라면 제한되지 않고 사용될 수 있고, 구체적으로는 인간, 동물 등의 주변 또는 식물체, 식물체의 주변에 식물 생장 조절용 미생물제제를 위치시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 다음 단계를 포함하는 식물 생장 조절용 조성물을 제조하는 제조 방법이다:
세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주를 배지에서 배양하는 배양 단계; 및
배지에서 배양물을 분리하는 분리 단계.
본 명세서 상의 용어 "배양"은 본 발명의 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어, "배지"는 본 발명에 따른 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급하기 위한 물질을 의미한다. 구체적으로, 본 출원의 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주는 질소원, 인원, 무기화합물, 전구물질 (precursor) 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있고, 예를 들어, 옥수수 녹말 (corn starch)을 사용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있고, 예를 들어, 트립톤을 포함할 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 배지는 L-트립토판을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 배지에 질소원으로 5 g/L 트립톤, 탄소원으로 10 g/L 옥수수 녹말 및 전구물질로 0.5 부피 %의 L-트립토판이 포함된 경우에 무처리 배지에 비해 IAA의 생성량이 약 10배 이상 증가한 것을 확인하였다 (표 9 및 도 8 참조).
본 발명의 일 구현예에서, 배지는 1 내지 10, 2 내지 8, 3 내지 7, 4 내지 6 또는 5 g/L의 질소원을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배지는 1 내지 10, 2 내지 8, 3 내지 7, 4 내지 6 또는 5 g/L의 트립톤을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배지는 1 내지 20, 5 내지 15, 6 내지 14, 7 내지 13, 8 내지 12, 9 내지 11 또는 10 g/L의 탄소원을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배지는 1 내지 20, 5 내지 15, 6 내지 14, 7 내지 13, 8 내지 12, 9 내지 11 또는 10 g/L의 옥수수 녹말 (Corn starch)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배지는 0.1 내지 2, 0.3 내지 1.7, 0.5 내지 1.5, 0.7 내지 1.3, 0.9 내지 1.1 또는 1 부피% (w/v)의 전구물질 (Precursor)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배지는 0.1 내지 2, 0.2 내지 1.7, 0.3 내지 1.5, 0.3 내지 1.3, 0.3 내지 1.1, 0.3 내지 0.8, 0.4 내지 0.6 또는 0.5 부피% (w/v)의 L-트립토판 (L-Tryptophan)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배지는 TS 배지일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배양 단계는 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주는 생존 및 발육에 적합한 온도 조건에서 배양될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 배양 단계는 20 내지 40 ℃에서 수행될 수 있고, 예를 들어, 22 내지 38 ℃, 24 내지 36 ℃, 26 내지 34 ℃, 28 내지 32 ℃ 또는 30 ℃에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 식물 생장 조절용 조성물은 하기 화학식 1의 화합물인 것일 수 있고, 예를 들어, 인돌-3-아세트산 (indole-3-acetic acid; IAA)인 것일 수 있다.
[화학식 1]
본 발명은 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주, 이를 포함하는 식물 생장 조절용 조성물, 및 이를 이용한 식물 생장 조절 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 균주 및 조성물은 식물의 생장을 효과적으로 조절 및 촉진할 수 있어, 다양한 식물의 생장 조절제로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주의 균총 (Colony)을 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 식물 생장 조절용 화합물인 인돌-3-아세트산 (indole-3-acetic acid)의 LC-MS/MS 분석을 위해 확립된 전구체이온의 이온값을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 토양으로부터 분리한 미생물 6종의 식물 생장 조절용 화합물인 인돌-3-아세트산의 생성량을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주 계통수 분석 결과를 나타낸다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주의 질소원에 따른 인돌-3-아세트산의 생성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주의 탄소원에 따른 인돌-3-아세트산의 생성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주의 전구 물질에 따른 인돌-3-아세트산의 생성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세데세아 라파제이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주의 전구물질 L-트립토판 (L-Tryptophan)의 함량에 따른 인돌-3-아세트산의 생성 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예1: 식물 생장 조절 물질 생산능을 가진 미생물의 분리
대한민국 전라도 지역에서 확보한 토양 시료 1 g을 멸균수 100 mL에 현탁한 후, 25°C에서 180 rpm으로 하루 동안 교반하였다. 이후, 교반 상등액을 Pancreatic Digest of Casein 17.0 g, Papaic Digest of Soybean 3.0 g, Dextrose 2.5 g, Sodium Chloride 5.0 g, Dipotassium phosphate 2.5, Agar 15.0 g/L를 포함하는 TS 고체배지에 200μl 적하하여 도말하였고, 37°C에서 3일 동안 배양하였다. 얻어진 다수의 균총을 분리하여 TS 액체배지 5 mL에 접종하고 30°C에서 180 rpm으로 하루 동안 배양하였다. 이후, 80 부피%(v/v) 글리세롤 200 μL에 배양액 800 μL를 첨가하여 -80 ℃에 보관하여 사용하였다.
실시예 2: 분리된 미생물의 식물 생장 조절 물질 생성능 확인
실시예 1에서 선별된 미생물 6 종을 TS 액체배지 5 mL에 접종 후, 37℃ 180 rpm 조건에서 1일간 종균 배양하였다. 상기 배양액 1 mL를 동일배지 100 mL에 접종하였고 37℃ 180 rpm 조건에서 2일간 배양하였다. 식물 생장 조절 물질 확인에는 배양액을 15,000 rpm 조건으로 10분간 원심분리를 시행하여 균체가 제거된 배양상등액이 사용되었다.
배양상등액 10 mL에 1 부피%(v/v) 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid)을 포함하는 아세토니트릴 (Acetonitrile) 10 mL를 첨가하고 염화나트륨 (NaCl) 1 g과 황산마그네슘 (MgSO4) 4 g을 첨가하여 3분간 균질화한 뒤, 4,000 rpm 조건에서 5분간 원심분리하여 상등액을 획득했다. 상기 상등액에 Sorbent (C18, Agilent, USA) 0.4 g과 황산마그네슘 1.2 g을 첨가하여 1분간 다시 균질화한 뒤, 4,000 rpm 조건에서 5분간 원심분리 하여 얻은 상등액을 0.05 부피%(v/v) 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid)이 포함된 증류수로 2배 희석하여 0.22 μm Spin-X로 filter한 후 식물 생장 조절 물질 여부를 확인하였다
실시예 3: 식물 생장 조절 물질 분석
실시예 2에서 추출한 물질이 식물 생장 조절 물질인지 여부를 확인하기 위해 LC-MS/MS 이용해 표준 물질의 정량분석을 시행하였다. 분석에 사용된 표준물질은 Abscisic acid (ABA), Gibberellic acid (GA), Indole-3-acetic acid (IAA), Jasmonic acid (JA) 및 Kinetin (KIN)이며, 상기 표준물질은 모두 Sigma-Aldrich에서 구매하여 사용하였다.
표준 물질의 분석에는 고성능액체크로마토그래피 (Agilent 1100 series, USA) 장비를 사용하였으며, 고정상 컬럼은 X-bridge C18 (2.1 X 100 mm, 3.5 μm, Waters)이 사용되었고, 이동상 용매로는 0.05 부피% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA)이 함유된 물과 아세토니트릴을 사용하였다. 아세토니트릴 농도는 5 내지 95 부피% (v/v)까지 분당 0.2 mL씩 10분간 농도 구배를 주어 흘려주었다. 분석 물질은 0.05 부피%(v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA)이 함유된 물과 아세토니트릴을 50 부피% (v/v)로 섞은 용매에 녹여 5 μl를 주입하여 분석을 수행하였다. 질량분석기는 AB Sciex사 API3200 Q TRAP을 이용하였고, 분석조건은 하기 표 1에 나타내었다.
Analyte Precursor ion (Q1) Product ion (Q3) Molecular ion DP EP CEP CXP
ABA 265.2 247.1 [M+H]+ 16.0 10.0 16.0 4.0
GA 347.3 239.3 [M+H]+ 16.0 5.0 22.0 4.0
IAA 176.3 130.1 [M+H]+ 31.0 10.0 12.0 4.0
JA 211.2 109.1 [M+H]+ 26.0 10.0 14.0 4.0
KIN 216.1 81.0 [M+H]+ 36.0 11.0 14.0 4.0
(DP: Declustering potential; EP: Entrance potential; CEP: Collision cell entrance potential; CXP: Collision cell exit potential.)
확립된 분석 조건을 이용하여 표준물질들의 농도에 따른 피크 면적으로 검정 곡선 (Calibaration curve)을 작성하였다. 검정 곡선, 검출한계 (Limit of detection)와 정량한계 (Limit of Quantitation)를 표 2에 나타냈었다. 검정 곡선의 신뢰성은 0.99 이상의 직선성 보이는 상관계수 (R2)의 값으로 확인되었다.
Analyte Calibration equation Correlation factor (R2) LOD
(μg/mL)		 LOQ
(μg/mL)
ABA y = 135215x - 461.79 0.9996 0.01 0.04
GA y = 3577.8x - 77.713 0.9997 0.05 0.13
IAA y = 166533x + 508 0.9976 0.001 0.01
JA y = 17189x + 1051.8 0.9977 0.02 0.1
KIN y = 276828x + 190.21 0.9998 0.001 0.004
분리한 6종의 균주의 추출물을 분석한 결과, 6종 모두 도 2에 나타나듯이 precursor ion (Q1) 176.3 m/z과 product ion (Q3) 130.1 m/z을 가지는 IAA의 생산능이 확인되었다. IAA의 화학 구조식은 하기 화학식 1에 나타내었다.
[화학식 1]
IAA는 식물호르몬인 옥신의 일종으로 식물세포와 조직의 분열, 증식, 분화와 밀접히 관련되어 있어 식물 생장 조절제의 원료로 이용된다. 6종의 균주중 CWL-11 균주가 상대적으로 과량의 IAA를 생성하는것을 확인하였다.
Strain Calculated concentration of IAA ± Standard deviation
(mg/L), (n=2)
CWL-05 0.47 ± 0.016
CWL-06 0.28 ± 0.007
CWL-07 0.53 ± 0.006
CWL-08 0.43 ± 0.007
CWL-09 0.38 ± 0.009
CWL-11 101.60 ± 1.30
실시예 4: 식물 생장 조절 물질 생성 균주의 동정
실시예 3에서 CWL-11번 균주가 식물 생장 조절 물질인 IAA를 특이적으로 생산하는것을 확인했고, 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열분석을 통해 분자계통분류학적인 방법을 이용해 동정하였다. 표 4의 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 증폭시킨 후, 정제하여 염기서열을 분석하였고, CWL-11 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 표 5에 나타내었다.
서열번호 명명 서열목록 (5'-> 3') 비고
1 Primer_27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
2 Primer_ 1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT
서열번호 명명 서열목록 (5'-> 3') 비고
3 CWL-11_16S rRNA TTTTTTTTTTTTTACTCAGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACGGGGAGCTTGCTCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGCATTAAGGTTAATAACCTTAGTGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAAGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAAAAAAGGTAACCAAAGGGGGGCCCCCAGGGTATGTCACCGGTCAGCGTCTTTTTTTTGCACCGGGGGGGCCATCTCCTCCGCCGGTCTTCCCCCATAATATCTCCGCATTTTCGCCGCCCGCGCGGTTATTTCTCCCCTCCTCAAAAGAAACTCAGGGGTGCCTTTTTACAGAGGGTATTCCGGTGGAAGGCGCCGGGGTTTTTACAATAACTAGTTAAACGCCGCGACAGGTGGTCTATTCGCGCCCAATTATTAACAAAGACGCGGCGCCACCCCCATTAAATAACAGGGGGGGGGGGAGAGAGATTAATATAGCGAGATTGTTTTGCGGCCAAAAAAAAAACGACTAAAGACAGAGGAGAAAATAAAGACCCGCCCCC
유전자은행의 Blast 프로그램을 이용하여 상동성을 분석한 결과 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) 종과 99% 상동성을 나타내었으며, 분자계통학적 위치를 나타내는 계통 발생적 분지도 (Phylogenetic tree)를 도 4에 나타내었다. 그리고, CWL-11 균주를 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11로 명명하하고, 한국생명공학연구원에 기탁하여 수탁번호 KCTC15159BP를 부여받았다.
실시예 5: 식물 생장 조절 물질 최대 생산 배지 조건 확립
실시예 4에서 동정된 세데세아 라파게이 CWL-11 균주의 식물 생장 조절 물질 생산 효율을 높이기 위해 다음과 같은 실험을 수행하여 배지 조건을 확립하였다.
-80 ℃에 보관된 세데세아 라파게이 CWL-11 균주를 TS 고체배지에 도말하여 30 ℃에서 1일간 배양한 뒤, 생성된 균총을 TS 액체배지 5 mL에 접종하여 30 ℃ 180 rpm 조건에서 1일간 배양하였다. 이를 100 mL 다양한 조성의 액체배지에 접종하고 30 ℃ 150 rpm 조건에서 48시간 배양 후 IAA 생성량을 비교하였다.
질소원 (Nitrogen source)
기본 배지 Sucrose 10 g, Sodium chloride 1.5 g, Dipotassium phospahate 2.5 g, Sodium carbonate 0.5 g, Magnesium sulfate 1 g/L에 표 6의 질소원이 각 5 g/L 첨가된 액체배지가 사용되었다. 각 실험군에서 얻은 배양액 40 mL를 실시예 2와 3에서 나타낸 추출과 분석 방법을 이용해 질소원을 트립톤 (Tryptone)을 사용했을때 IAA 생성량이 최대가 되는 것을 확인하였고, 이를 표 6과 도 5에 도시하였다.
Nitrogen source Calculated concentration of IAA ± Standard deviation (mg/L), (n=3)
Soybean flour 0.42 ± 0.007
Yeast extract 6.73 ± 0.62
Soytone 3.32 ± 0.27
Peptone 1.71 ± 0.04
Tryptone 25.40 ± 0.71
상기 표 6 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 질소원을 트립톤 (Tryptone)으로 사용하였을 때, IAA의 생성량이 최대 (25.40 ± 0.71 mg/L)가 됨을 확인할 수 있었다.
탄소원 (Carbon source)
질소원 비교 실험의 결과를 기반으로 질소원을 Tryptone을 사용한 배지 성분에 표 6의 탄소원이 각 10 g/L 첨가된 배지에서 CWL-11 균주의 IAA 생성량을 비교하였다. 각 실험군에서 얻은 배양액 40 mL를 실시예 2과 3에서 나타낸 추출과 분석 방법을 이용해 탄소원이 옥수수 녹말 (Corn starch)을 사용했을 때 IAA 생성량이 최대가 되는 것을 확인하였고, 이를 표 7와 도 6에 도시하였다.
Carbon source Calculated concentration of IAA ± Standard deviation (mg/L), (n=3)
Glucose 21.27 ± 0.50
Sucrose 25.00 ± 0.75
Maltose 18.81 ± 0.84
Fructose 18.97 ± 0.62
Corn starch 37.30 ± 1.50
상기 표 7 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, 탄소원을 옥수수 녹말 (Corn starch)로 사용하였을 때, IAA의 생성량이 최대 (37.30 ± 1.50 mg/L)가 됨을 확인할 수 있었다.
전구물질 (Precursor)
상기 실험 결과를 바탕으로 배지 성분이 Tryptone 5 g, Corn starch 10 g, Sodium chloride 1.5 g, Dipotassium phospahate 2.5 g, Sodium carbonate 0.5 g, Magnesium sulfate 1 g/L으로 고정된 액체 배지에 IAA 전구체인 소듐 피루베이트 (Sodium pyruvate)와 L-트립토판 (L-Tryptophan)을 0.03 부피% (v/v) 첨가하여 30 ℃ 180 rpm 조건에서 세데세아 라파게이 CWL-11 균주를 48시간 동안 배양하였다. 각 실험군에서 얻은 배양액 40 mL를 실시예 2과 3에서 나타낸 추출과 분석 방법을 이용해 분석했고 전구체를 L-트립토판을 이용했을 때 IAA 생성량이 증가하는 것을 확인하였고, 이를 표 8과 도 7에 도시하였다.
Precursor Calculated concentration of IAA ± Standard deviation (mg/L), (n=3)
Sodium pyruvate 29.47 ± 3.12
L-Tryptophan 108.20 ± 5.16
추가적으로 L-트립토판 농도 별 IAA 생성량을 확인하기 위해서 위 배지 성분에 L-트립토판 (L-Tryptophan)을 0, 0.05, 0.3, 0.5 부피% (v/v) 첨가하여 30 ℃ 180 rpm 조건에서 세데세아 라파게이 CWL-11 균주를 48시간 동안 배양하였다. 각 실험군에서 얻은 배양액 40 mL를 실시예 2과 3에서 나타낸 추출과 분석 방법을 이용해 분석했고 배지 내 L-트립토판의 함량이 증가함에 따라 IAA 생성량이 증가하는
경향을 보였다. L-트립토판을 0.5 부피% (v/v) 첨가한 경우 L-트립토판을 처리하지 않은 배지에 비해 IAA 생성량이 약 10배 증가하는 것이 확인되었고, 이를 표 9와 도 8에 도시하였다.
L-Trytophan
부피 %(v/v)		 Calculated concentration of IAA ± Standard deviation (mg/L), (n=3)
0 44.30 ± 3.50
0.05 138.20 ± 13.00
0.3 365.00 ± 41.00
0.5 446.67 ± 8.06
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15159BP 20221028

Claims (15)

  1. 식물 생장 촉진능을 가지고, 수탁번호 KCTC15159BP로 기탁된 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주의 16s rRNA 서열은 서열번호 3의 염기 서열을 포함하는 것인, 균주.
  3. 삭제
  4. 수탁번호 KCTC15159BP로 기탁된 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 상기 균주의 배양 상등액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 생장 촉진용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 균주의 16s rRNA 서열은 서열번호 3의 염기 서열을 포함하는 것인, 식물 생장 촉진용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 것인, 식물 생장 촉진용 조성물.
    [화학식 1]
  8. 다음 단계를 포함하는 식물 생장 촉진 방법:
    제1항에 따른 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 상기 균주의 배양 상등액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 식물체에 접촉시키는 접촉 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 균주의 16s rRNA 서열은 서열번호 3의 염기 서열을 포함하는 것인, 식물 생장 촉진 방법.
  10. 삭제
  11. 다음 단계를 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물의 제조 방법:
    제1항에 따른 세데세아 라파게이 (Cedecea lapagei) CWL-11 균주를 배지에서 배양하는 배양 단계; 및
    배지에서 배양물을 분리하는 분리 단계.
  12. 제11항에 있어서, 배지는 트립톤을 포함하는 것인, 식물 생장 촉진용 조성물의 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서, 배지는 옥수수 녹말 (Corn starch)을 포함하는 것인, 식물 생장 촉진용 조성물의 제조 방법.
  14. 제11항에 있어서, 배지는 L-트립토판 (L-Tryptophan)를 포함하는 것인, 식물 생장 촉진용 조성물의 제조 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 식물 생장 촉진용 조성물은 하기 화학식 1의 화합물인 것인, 식물 생장 촉진용 조성물의 제조 방법.
    [화학식 1]

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