KR20130119681A - 아시네토박터 칼코아세티쿠스 ｋｊｇ７을 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 염류 장해 토양의 복원 방법 - Google Patents

아시네토박터 칼코아세티쿠스 ｋｊｇ７을 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 염류 장해 토양의 복원 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유용한 토양미생물을 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 염류 장해 토양의 복원 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수탁번호 KCTC 18228P로 기탁된 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주, 이를 포함하는 토양 염류 집적 해소용 조성물, 이를 포함하는 식물 생장 촉진제, 이를 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 단계를 포함하는 염류 집적 해소 방법 및 이를 포함하는 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생육 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명의 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주 또는 상기 균주의 배양액이 염류집적 토양에 대해 우수한 염류 분해 활성을 나타내고 식물 생육촉진 및 수확량에 대해 증수 효과를 나타내기 때문에, 상기 균주 또는 이의 배양액은 토양 염류 장해 극복에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

아시네토박터 칼코아세티쿠스 ＫＪＧ７을 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 염류 장해 토양의 복원 방법{The microbial agent with Acinetobacter calcoaceticus ＫＪＧ７ and a method for remediation of salt stressed soil using the same}
본 발명은 신규 토양 미생물, 이를 이용한 미생물 제제, 및 상기 토양 미생물을 이용한 염류 장해 토양 복원 방법에 관한 것이다.
국민 식생활의 변화로 신선한 채소에 대한 수요가 증가함에 따라 연중 재배할 수 있는 시설재배 단지가 전국적으로 급격히 확대 보급되고 연간 비료 및 추비 시용량이 매 작기마다 늘어남에 따라 시설 재배지에서 염류집적과 양분의 과잉집적에 의해 토양 중 필수양분의 불균형, 작물의 수분흡수 저해, 염류농도 장해 등 심각한 작물의 생육장해를 일으켜 수량을 저하시키므로 이를 극복하기 위한 염류제거 기술이 필요하다. 염류가 집적된 토양에서 관수를 하면 제염효과가 있으나 다량으로 관수를 한 경우에도 15~20cm 정도만 스며들지 않은 상태이기 때문에 일시적으로 관개수와 함께 염류는 밑으로 내려가고 즉시 표층으로 되돌아 온다. 이러한 염류를 효율적으로 제염하기 위해 국내외에서 수행되고 있는 염류 장해 극복 방안 중 하나는 염에 내성을 가진 식물(salt tolerant crops)을 재배하는 경작적 제어법에 의존하고 있다. 그러나 높은 내성을 가진 작물은 목화, 보리 등 몇 종에 국한될 뿐만 아니라, 종자가 발아하기 위해서는 토양의 염류농도가 한계수준 이하의 비교적 낮은 수준에서만 가능하다. 대부분의 식물은 이들보다 염류농도에 더 민감하다. 또한 물리적인 극복방안은 문제가 되는 포장에 토관 배수로(tile drainage)를 설치하여 문제를 해결하고 있는 실정이다. 대단히 광범위한 염류장해토양(시설재배지, 간척지)을 대상으로, 배수로 공사를 할 경우 천문학적인 비용이 소요되므로 경제적인 부담은 이루 헤아릴 수 없는 상황이다. 뿐만 아니라 대다수의 자연 배수로는 토양 염류를 잘 여과할 수 있는 능력이 결여되어 있다.
현재 대다수의 국내 포장 토양과 간척지 토양은 이미 염류 장해가 매우 심각한 상태에 놓여있다. 시설재배는 조기 출하하여 많은 이윤을 얻기 위해 이용되는 작형인데, 작물 입장에서 보면 저온과 일조부족은 생리적 장해를 일으킨다. 이러한 장해를 극복하기위해 비료를 많이 주어 토양에 염류가 집적되는 사례도 많이 일어나고 있다. 우리나라는 인구가 늘고 경지면적이 줄어들고 있어 효율적으로 시설재배지의 염류집적을 제거시켜 농지보전을 하고 농지의 품질과 경쟁력을 높일 수 있다고 사료된다. 효율적인 제염기술 개발이 실용화된다면, 친환경적 제염방법으로 시간을 단축할 수가 있을 뿐만 아니라 양질의 과채류를 확보하여 상품화율을 향상시키고 농가소득을 높일 것으로 여겨진다. 비료사용의 과다로 인한 시설재배지의 염류집적을 친환경적 미생물제제에 의한 염류토양제거를 통해 작물의 생산성을 높일 수 있고 토양의 질산태 질소와 염류가 하천과 호수로 유입되는 것을 막아 생태적으로도 부영양화를 막을 수 있다. 따라서 염류 장해 토양 복원을 위한 환경 친화형 미생물 제제의 개발은 절실하다.
이에 본 발명자들은 토양으로부터 인산염 가용화 균주를 탐색 및 분리하여 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) KCTC18228P 균주를 분리하고, 상기 균주를 포함하는 미생물 제제가 토양 내 집적된 염류를 분해 또는 제거하고, 식물의 생장을 촉진하는 활성을 갖는다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 토양 내 집적된 염류를 분해 또는 제거하는 활성을 가지는, 기탁번호 KCTC 18228P로 기탁된 아시네토박터 칼코아세트쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 토양 염류 집적 해소용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 토양 내 집적된 염류를 분해 또는 제거하는 활성을 가지는, 기탁번호 KCTC 18228P로 기탁된 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 토양 염류 집적 해소용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주 또는 상기 균주의 배양액이 염류집적 토양에 대해 우수한 염류 분해 활성을 나타내고 식물 생육촉진 및 수확량에 대해 증수 효과를 나타내기 때문에, 상기 균주 또는 이의 배양액은 토양 염류 장해 극복 또는 식물 생육 촉진에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 트리칼슘포스페이트에 대한 가용화 활성을 나타내는 도이다.
도 2는 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)균주를 영양 한천 배지에서 계대배양하여 순수 배양된 균주를 나타내는 도이다.
도 3은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)의 16S rRNA 유전자 계통학적 위치를 나타내는 도이다: 16S rRNA 서열에 기초하여 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주와 관련된 박테리아 분류군의 위치를 나타내는 계통수(Phylogenetic tree)를 작성하였고, 가지에 있는 수는 50 % 이상 지지되는 가지들로만 비롯된, 부트스트랩(bootstrap) 수치이며, 선은 위치당 0.002 치환이고, T는 스트레인 유형이다.
도 4는 균주의 균체 지방산 조성 분석 결과를 나타내는 그래프와 도이다.
도 5는 균주를 포함하는 미생물제제 시비 15일 후 기준량(500배) 및 배량(250배)에서 오이, 배추, 상추, 토마토, 콩에 대한 비해를 조사한 사진이다: A는 시비 15일 후 기준량 시비구(오이); B는 시비 15일 후 배량 시비구(오이); C는 시비 15일 후 무시비구(오이); D는 시비 15일 후 기준량 시비구(배추); E는 시비 15일 후 배량 시비구(배추); F는 시비 15일 후 무시비구(배추); G는 시비 15일 후 기준량 시비구(상추); H는 시비 15일 후 배량 시비구(상추); I는 시비 15일 후 무시비구(상추); J는 시비 15일 후 기준량 시비구(토마토); K는 시비 15일 후 배량 시비구(토마토); L은 시비 15일 후 무시비구(토마토); M은 시비 15일 후 기준량 시비구(콩); N은 시비 15일 후 배량 시비구(콩); O는 시비 15일 후 무시비구(콩)이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC 18228P로 기탁된 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주를 제공한다.
상기 균주는 토양 내 집적된 염류를 분해 또는 제거하는 활성을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 토양은 염류 장해 토양인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 균주는 시설 재배지 또는 간척지의 토양에 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 토양으로부터 인산 가용화 능력이 있는 균을 분리하기 위해서 전국 각지로부터 많은 토양시료를 수집하였다. 채취한 토양 시료 1 g을 멸균 증류수에 현탁한 후, 트리칼슘포스페이트(Ca3(PO4)2)의 최종 농도가 0.5 % 되도록 조제한 고형 배지에 평판희석법을 이용하여 페트리 디쉬에 도말, 접종하였다. 접종된 배지를 30℃ 항온기에서 2 내지 3일 배양하여 생육이 빠르고 투명환이 큰 균주를 인산 가용화능이 있는 균주로 선별하였다(도 1).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 균주의 게놈은 벤질 클로라이드(Benzyl chloride)법을 변형한 방법을 이용하여 상기 균주의 게놈 DNA를 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출된 게놈 DNA에서 상기 균주의 16S rRNA 유전자는 서열번호: 1 및 2로 기재되는 프라이머(primer) 쌍을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여(서열번호: 3), DDBJ/NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project (RDP )의 데이터베이스에서 상동성 검색을 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 분자계통학적 분석결과에서 보는 바와 같이 선별된 균주는 아시네토박터 칼코아세티쿠스로 판명되었다. 특히 상기 선발된 균주는 표준균주인 아시네토박터 칼코아세티쿠스 DSM30006T(Acinetobacter calcoaceticus DSM30006T)와 100 %의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되어 상기 선별된 균주를 '아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)'로 명명하고 상기 균주를 2012년 3월 28일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호; KCTC 18228P).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주의 지방산 조성을 분석하여 주요 지방산으로 C18 :1 w9c(24.00%), C16 :0(21.17%)를 나타내었으며, C12 :0, C12 :02OH, C12 :03OH 그리고 Summed feautre 3과 같은 다양한 지방산을 함유하는 특징을 나타내었다. 또한 상기 균주는 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 표준균주와도 주요 균체 지방산 조성과도 유사한 균체 지방산 조성을 갖는 것으로 확인되었다(표 1 및 도 3).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)은 영양배지(Nutrient broth)에서 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 통상의 세균이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 모두 배양이 가능하다. 상기 배양은 호기적 조건에서 진탕 배양하는 것이 바람직하고, 배양온도, 배양 pH 및 배양 시간은 28 내지 35℃ , pH 6.0 내지 7.0에서 2 내지 5일간 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 토양 염류 집적 해소용 조성물을 제공한다.
상기 토양은 염류 장해 토양인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 시설 재배지 또는 간척지의 토양에 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/ml가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 이를 미생물 제제 원액으로 사용하고, 상기 미생물 제제 원액을 500ml에 균수가 107~108 CFU/ml가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토양 염류 집적 해소용 조성물은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명에 따른 유효성분은 전체 조성물에 대하여 상기 균체 또는 배양액을 0.0625 ~ 90 중량%를 사용하는 것이 바람직하며, 0.125 ~ 50 중량%를 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 미생물 제제에 염류장해의 척도인 전기전도도(electrical conductivity, EC)의 수치가 약 20 내지 30 %이상 경감되었고, 또한 치환성 양이온인 칼륨(K), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg)도 30 내지 40 % 이상 경감시켰다(표 2).
또한, 본 발명은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물 생장 촉진제를 제공한다.
상기 식물 생장 촉진제는 미생물 농약, 종자 코팅제, 미생물 영양제, 토양 개량제, 퇴비 부숙제 및 엽면 살포제로 구성된 군으로부터 선택되는 것으로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 식물 생장 촉진제는 농약 제제로서 사용가능한 담체를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 담체는 통상적으로 사용되는 농약 제형으로 허용 가능한 담체이면 모두 사용할 수 있다. 특히 동결보존제 스킴밀크(skim milk), 효모 추출물(yeast extract), PG와 전착제 SOF70, 계면활성제 TD20A, AS65D 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/ml가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 이를 미생물 제제 원액으로 사용하고, 상기 미생물 제제 원액을 500ml에 균수가 107~108 CFU/ml가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토양 염류 집적 해소용 조성물은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명에 따른 유효성분은 전체 조성물에 대하여 상기 균체 또는 배양액을 0.0625 ~ 90 중량%를 사용하는 것이 바람직하며, 0.125 ~ 50 중량%를 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 미생물 제제가 작물의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 작물은 상추인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상추 비닐하우스에 대조구(무처리), 반량처리 (1000배 희석), 적량 처리(500배 희석), 배양처리(250배 희석)로 관주 처리하였다. 정식 후 8주 후 생육 및 수량 조사를 실시하여 평균값으로 계산하였다(표3). 상추 초장은 일반관행에 비해 미생물제제 시용구에서 다소 길었고, 엽수는 사용량이 증가함으로서 비례적으로 많았는데 대조구에 비해 적량처리 시용구가 평균 23배(5이상의 엽장)가 더 많은 경향을 나타내었다. 엽폭은 처리구간 유의적인 차이가 없었고 생체중은 적량처리 이상 사용함으로 증가하였다. 뿌리길이는 시용량이 증가할 수록 길었으며 측근 및 세균은 적량 처리이상 시용구에서 잘 발달하였다. 엽록체의 발달은 관행재배에 비해 미생물제제 시용량에 따라 엽록체 함량이 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 미생물제제는 오이, 배추, 상추, 토마토, 콩에 대하여 기준량 및 배량에서 비해를 관찰한 결과, 비해가 나타나지 않아 친환경유기농자재 공시에 적합한 제품으로 판단되었다.
또한, 본 발명은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 단계를 포함하는 염류 집적 해소 방법을 제공한다.
상기 토양은 염류 장해 토양인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 시설 재배지 또는 간척지의 토양에 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토양 염류 집적 해소 방법은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 본 발명에 따른 토양에 처리하는 용량은 0.0625 ~ 90 중량%인 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 것이 바람직하며, 조성물을 500배 희석하여 관주하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/ml가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 이를 미생물 제제 원액으로 사용하고, 상기 미생물 제제 원액을 500ml에 균수가 107~108 CFU/ml가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하여 사용하는 방법으로 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생육 촉진 방법을 제공한다.
상기 처리는 식물의 종자에 도포하는 처리, 식물의 종자를 침지시키는 처리, 식물의 재배 토양에 관주(灌注)하는 처리, 식물의 재배 토양 표면에 분무하는 처리, 식물의 경엽에 살포하는 처리, 및 식물의 부상부(付傷剖)에 접촉시키는 처리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식물 생육 촉진 방법은 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 조성물을 식물에 처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 식물에 처리하는 용량은 0.0625 ~ 90 중량%인 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 조성물을 식물에 처리하는 것이 바람직하며, 조성물을 800배 희석하여 관주하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/ml가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 이를 미생물 제제 원액으로 사용하고, 상기 미생물 제제 원액을 500ml에 균수가 107~108 CFU/ml가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이하 실시예 및 실험예를 통해 본 발명의 내용을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 인산염 가용화 균주의 탐색 및 분리
인산 가용화 능력이 있는 균을 분리하기 위해서 전국 각지로부터 토양 시료를 수집하였다. 채취한 토양 시료 1 g을 멸균 증류수에 현탁한 후, 트리칼슘포스페이트(Ca3(PO4)2)의 최종 농도가 0.5 % 되도록 조제한 고형 배지에 평판희석법을 이용하여 페트리 디쉬에 도말, 접종하였다. 접종된 배지를 30℃ 항온기에서 2 내지 3일 배양하여 생육이 빠르고 투명환이 큰 균주를 인산 가용화능이 있는 균주로 선별하였다(도 1).
< 실시예 2> 유전학적 특성 및 지방산 조성을 통한 선별된 미생물 균주의 동정
본 발명자들은 선별된 균주의 종 분석을 위해, 목원대학교 미생물생태자원연구소에 의뢰하여 16S rRNA 유전자 전염기서열 해석 및 세포 지방산 분석을 실시하였다.
<2-1> 16S rRNA 유전자의 상동성 분석을 통한 선별된 미생물 균주의 동정
<실시예 1>에서 선별된 균주를 영양 한천 배지(Nutrient agar, Difco, USA)에 접종하고 28℃에서 3일간 배양한 후 단일 균주임을 확인하였다. 상기 균주를 영양 배지(Nutrient broth, Difco, USA)에 접종한 후 28℃에서 2일간 진탕 배양한 후 벤질 클로라이드(Benzyl chloride)법을 변형한 방법을 이용하여 상기 균주의 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA에서 상기 균주의 16S rRNA 유전자를 서열번호: 1 및 2로 기재되는 프라이머(primer) 쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법으로 증폭하였다.
프라이머 27F : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(서열번호: 1),
프라이머 1492R : 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (서열번호: 2)
여기서 PCR 조건은 하기와 같다:
95℃ 2분,
94℃ 30초,
58℃ 30초, 30 사이클
72℃ 45초,
72℃ 5분, 및
4℃ 보관.
16S rRNA 유전자 PCR 증폭 산물은 PCR Product Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였고, Genetic analyzer 310A(Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석하여 하기의 16 rRNA cDNA 1,333bp의 염기서열을 결정하였다.
CTTTTCCTTATTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGC-3'(서열번호: 3)
상기 균주의 16S rRNA 염기서열은 DDBJ/NCBI/Genebank와 Ribosomal Database ProjectⅡ(RDPⅡ)의 데이터베이스에서 상동성 검색을 수행하였다. 분자계통학적 분석결과에서 보는 바와 같이 선별된 균주는 아시네토박터(Acinetobacter)에 속하는 종으로 판명되었다(도 3). 특히 상기 선발된 균주는 표준 균주인 아시네토박터 칼코아세티쿠스 DSM30006T(Acinetobacter calcoaceticus DSM30006T(X81661))의 염기서열과 100 %의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되어 상기 선별된 균주를 '아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)'로 명명하였다. 상기 균주를 2012년 3월 28일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호; KCTC 18228P).
<2-2> 지방산 조성을 통한 선별된 미생물 균주의 동정
고등생물의 경우 균체지방산 조성이 단순하고 동일한 성분을 갖기 때문에 분류지표로 활용하기 어렵지만, 세균의 경우 균체지방산 조성이 다양하여 화학분류학적 측면에서 유용한 정보로 사용되고 있다. 따라서 표준균주와의 분류학적 차이를 알아보기 위해 상기 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주의 지방산 조성을 알아보았다. 상기 균주를 TSA(Trypticase Soy Broth Agar, Difco, USA) 배지에 접종 후, 28℃에서 3일간 배양한 후 균체 50mg(건조 중량)을 Ikemoto & Miyagawa의 방법에 의하여 균체 지방산 메틸 에스터(methyl ester)화 및 추출을 수행하였다. 지방산 조성은 미생물 동정 시스템(Microbial Identification System)(MIDI; Microbial ID, Inc., Newark, Del., USA)을 이용하여 6890N 기체크로마토그래피(Gas Chromatograph)(Agilent Technologies)로 분석하였다.
주요 지방산으로 C18 :1 w9c(24.00%), C16 :0(21.17%)를 나타내었으며, C12 :0, C12:02OH, C12 :03OH 그리고 썸드 피쳐(Summed feautre) 3과 같은 다양한 지방산을 함유하는 특징을 나타내었다. 또한 상기 균주는 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 표준 균주와도 주요 균체 지방산 조성과도 유사한 균체 지방산 조성을 갖는 것으로 확인되었다(표 1 및 도 3).
아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7 ( Acinetobacter calcoaceticus KJG7 )의 균체 지방산 특성
지방산
(Fatty acid)(%)		 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7
(Acinetobacter calcoaceticus KJG7)		 아시네토박터 칼코아세티쿠스 DSM30006T
(Acinetobacter calcoaceticus DSM30006T(X81661))
포화지방산
(Saturated acids)
C12:0 14.16 8.4
C16:0 21.17 16.4
하이드록시산
(Hydroxy acid)
C12:0 2OH 3.52 2.8
C12:0 3OH 7.14 3.0
불포화산
(Unsaturated acids)
C18:1 w9c 24.00 17.0
썸드피쳐 3
(Summed feature 3)		 19.88 35.5
< 실시예 3> 액상형 미생물 제제의 제조
액상형 미생물 제제의 제조를 위해, 상기 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주의 배양은 영양 배지(Nutrient broth, Difco, USA)를 기본으로 사용하였다. 균주는 영양 한천 배지(Nutrient agar, Difco, USA)에서 1 내지 2일간 배양한 후 영양 배지 100ml 를 함유하는 250ml 삼각플라스크에 접종하여 48시간 동안 종균 배양을 하였다. 본 배양을 위해서 액체 배지 1.5 L를 함유하는 3 L 삼각플라스크에 상기 종균 배양액을 접종하여 배양하였다. 배양조건은 30℃ 에서 150 rpm으로 48시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 균은 원심분리기를 이용하여 배양액을 제거하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/ml가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 4℃에서 보관하고 이를 미생물 제제 원액으로 사용하였다.
상기 미생물 제제 원액을 500ml에 균수가 107~108 CFU/ml가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하였다.
< 실험예 1> 제조된 미생물 제제의 활성 시험
상기 <실시예 3>에서 얻은 미생물 제제를 시설하우스에 희석하여 관주 처리하고 8주 후 그 결과를 관찰하였다.
<1-1> 제조된 미생물 제제의 토양 염류 집적 해소 활성 시험
미생물 제제를 토양에 처리한 결과, 염류장해의 척도인 전기전도도(electrical conductivity, EC)의 수치가 약 20 내지 30 %이상 경감되었고, 또한 치환성 양이온인 칼륨(K), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg)도 30 내지 40 %이상 경감되었다(표 2).
미생물 제제 처리에 따른 토양 분석
구분 pH EC 유효인산
(ppm)		 치환성 양이온(me/100g) 유기물
(%)
칼륨 칼슘 마그네슘
처리 1 전 7.3 4.13 481 3.92 22.8 5.1 4.8
후 7.0 2.01 598 1.97 8.7 4.0 4.0
처리 2 전 6.8 5.24 627 5.21 25.7 6.6 4.7
후 6.4 2.34 745 3.32 10.1 4.1 3.8
<1-2> 제조된 미생물 제제의 식물 생장 촉진 활성 시험
미생물제제가 작물의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 상추 비닐하우스에 대조구(무처리), 반량 처리(1000배 희석), 적량 처리(500배 희석), 배량 처리(250배 희석)로 관주 처리하였다. 정식 후 8주 후 생육 및 수량 조사를 실시하여 평균값으로 계산하였다(표 3).
미생물 제제가 상추의 생육에 미치는 효과
처리 초 장
(cm)		 엽수
(매)		 엽폭
(cm)		 근장
(cm)		 생체중(g) 건물중(g) 엽록체
(mg/m2)
엽중 근중 엽중 근중
대조구
(관행)		 26.32b 9.62c 15.32a 13.02c 105.2c 4.02c 5.29c 0.41c 21.1b
반량
처리수		 28.42a 10.78c 16.01a 15.77b 115.3c 4.93b 5.41c 0.55bc 21.6b
적량
처리구		 29.63a 13.06b 16.23a 17.52a 152.8b 5.52b 7.81b 0.68b 25.0a
배량
처리구		 30.71a 13.79a 17.71a 16.23ab 172.1a 6.71a 9.88a 0.78a 25.9a
z) 각 열의 평균 분리는 5% 수준에서 DMRT로 하였다.
그 결과 상기 표 3에서 알 수 있듯이, 상추 초장은 무처리에 비해 일반미생물제제 시용구에서 다소 길었고, 엽수는 시용량이 증가함으로서 비례적으로 많았는데 대조구에 비해 적량처리 시용구가 평균 23배(5이상의 엽장)가 더 많은 경향을 나타내었다. 엽폭은 처리구간 유의적인 차이가 없었고 생체중은 적량처리 이상 시용함으로 증가하였다. 뿌리길이는 시용량이 증가할 수록 길었으며 측근 및 세근은 적량처리이상 시용구에서 잘 발달하였다.
<1-3> 제조된 미생물 제제의 식물 생장 촉진 활성 시험
미생물제제가 5종(오이, 배추, 상추, 토마토, 콩)의 유식물에 미치는 비해를 친환경유기농자재 공시 및 품질인증 등에 관한 세부실시요령(고시 제2011-28호)에 따라 (주)한국식물환경연구소에 의뢰하여 기준량과 배량 시비구에서 외관상 비해 유무를 비해정도(0~4)로 조사하여 검정하였다. 시험의 재배 조건은 약 330 ㎡의 단동으로 설치되었으며, 2012년 2월 24일 파종과 3월 2일 정식 후 3중 비닐과 수막 시설을 이용하여 온도를 평균 10 내지 20℃ 이상으로 유지하여 농가의 관행조건하에서 본 시험을 수행하였다. 미생물제제는 오이, 배추, 상추, 토마토, 콩에 대하여 기준량(500배)과 배량(250배) 시비구에서 비해가 없었다(도 5).
그 결과 도 5에 나타났듯이, 미생물제제는 오이, 배추, 상추, 토마토, 콩에 대하여 기준량 및 배량에서 비해를 관찰한 결과, 비해가 나타나지 않아 친환경유기농자재 공시에 적합한 제품으로 판단되었다.
한국생명공학연구원 KCTC18228P 20120328
<110> KOREA BIO CHEMICAL CO., LTD. <120> The microbial agent with Acinetobacter calcoaceticus KJG7 and a method for remediation of salt stressed soil using the same <130> 12p-04-18 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 27f <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1492R <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1298 <212> DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus KJG7 <400> 3 ccgatcttag cggcggacgg gtgagtaatg cttaggaatc tgcctattag tgggggacaa 60 catttcgaaa ggaatgctaa taccgcatac gtcctacggg agaaagcagg ggatcttcgg 120 accttgcgct aatagatgag cctaagtcgg attagctagt tggtggggta aaggcctacc 180 aaggcgacga tctgtagcgg gtctgagagg atgatccgcc acactgggac tgagacacgg 240 cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgca agcctgatcc 300 agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggcctta tggttgtaaa gcactttaag cgaggaggag 360 gctactttag ataataccta gagatagtgg acgttactcg cagaataagc accggctaac 420 tctgtgccag cagccgcggt aatacagagg gtgcaagcgt taatcggatt tactgggcgt 480 aaagcgcgcg taggcggcta attaagtcaa atgtgaaatc cccgagctta acttgggaat 540 tgcattcgat actggttagc tagagtgtgg gagaggatgg tagaattcca ggtgtagcgg 600 tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg atggcgaagg cagccatctg gcctaacact 660 gacgctgagg tgcgaaagca tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccatgcc 720 gtaaacgatg tctactagcc gttggggcct ttgaggcttt agtggcgcag ctaacgcgat 780 aagtagaccg cctggggagt acggtcgcaa gactaaaact caaatgaatt gacgggggcc 840 cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctggcct 900 tgacatagta agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaacttac atacaggtgc 960 tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020 cccttttcct tatttgccag cgagtaatgt cgggaacttt aaggatactg ccagtgacaa 1080 actggaggaa ggcggggacg acgtcaagtc atcatggccc ttacggccag ggctacacac 1140 gtgctacaat ggtcggtaca aagggttgct acctagcgat aggatgctaa tctcaaaaag 1200 ccgatcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa 1260 tcgcggatca gaatgccgcg gtgaatacgt tcccgggc 1298

Claims (5)

  1. 토양 내 집적된 염류를 분해 또는 제거하는 활성을 가지는, 기탁번호 KCTC 18228P로 기탁된 아시네토박터 칼코아세티쿠스 KJG7(Acinetobacter calcoaceticus KJG7) 균주.
  2. 제 1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 토양 염류 집적 해소용 조성물.
  3. 제 1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물 생장 촉진용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 식물 생장 촉진용 조성물은 미생물 농약, 종자 코팅제, 미생물 영양제, 토양 개량제, 퇴비 부숙제 또는 엽면 살포제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식물 생장 촉진용 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 식물 생장 촉진용 조성물은 농약 제제로서 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 생장 촉진용 조성물.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101972069B1 (ko) * 2017-11-10 2019-04-24 대한민국 식물 생육 촉진 효과 및 환경 장해에 대한 식물 내성 유도 효과를 갖는 배리오보랙스 보로니쿠물란스 pmc12 균주 및 이의 용도
KR101972067B1 (ko) * 2017-11-10 2019-04-24 대한민국 식물 생육 촉진 효과 및 환경 장해에 대한 식물 내성 유도 효과를 갖는 페도박터 진셍지솔라이 t01r-27 균주 및 이의 용도
KR101972068B1 (ko) * 2017-11-10 2019-04-24 대한민국 식물 생육 촉진 효과, 환경 장해에 대한 식물 내성 유도 효과, 및 식물병 억제 효과를 갖는 로다노박터 그리시니스 t01e-68 균주 및 이의 용도

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