KR101281104B1 - 유용한 토양미생물을 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 염류 장해 토양의 복원 방법 - Google Patents

유용한 토양미생물을 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 염류 장해 토양의 복원 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유용한 토양미생물을 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 염류 장해 토양의 복원 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수탁번호 KCTC 11893BP로 기탁된 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) 균주, 이를 포함하는 토양 염류 집적 해소용 조성물, 이를 포함하는 식물 생장 촉진제, 이를 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 단계를 포함하는 염류 집적 해소 방법 및 이를 포함하는 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생육 촉진 방법에 관한 것이다.
본 발명의 판토에아 속(Pantoea sp.) J11 균주 또는 상기 균주의 배양액이 염류집적 토양에 대해 우수한 염류 분해 활성을 나타내고 식물 생육촉진 및 수확량에 대해 증수 효과를 나타내기 때문에, 상기 균주 또는 이의 배양액은 토양 염류 장해 극복에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

유용한 토양미생물을 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 염류 장해 토양의 복원 방법{The microbial agent with useful soil bacteria and a method for remediation of salt stressed soil using this agent}
본 발명은 신규 토양 미생물, 이를 이용한 미생물 제제, 및 상기 토양 미생물을 이용한 염류 장해 토양 복원 방법에 관한 것이다.
염이란 화학적으로는 산과 염기가 결합된 것을 말하고, 비료로 사용되는 황산칼리는 황산(산)과 칼리(염기)가 결합한 염이며, 염기는 전기적으로 양성을 나타내는 칼리, 석회, 마그네슘, 나트륨, 철, 아연, 망간 등의 금속원소이고, 산은 전기적으로 음성을 띠는 질산, 황산 및 염소 이온 등이 있다. 따라서 염은 작물 생육에 꼭 필요로 하는 영양소이다. 그러나 이들 염류가 토양 중에 적정 수준 이상으로 존재할 때 우리는 염류 집적이라고 말하며, 과다한 염은 식물의 근권을 통해 흡수되어 식물에 치명적인 상해를 입히는 장해를 염류 장해라고 한다.
염류 장해는 염류성 토양(saline soils) 및 나트륨 토양(sodic soils), 염류-나트륨 토양(saline-sodic)의 세 가지 형태로 발생한다. 염류성 토양(saline soils)은 과다한 용해성 염을 함유한 토양으로 심한 경우 토양표면이 잔류물로 인해 하얗게 되는데, 이는 식물의 수분과 양분 흡수를 어렵게 하고 독성을 가지고 있어 염의 여과와 배수가 필수적이다. 나트륨 토양(sodic soils)은 과다한 교환성 나트륨을 함유한 토양인데 그 자체는 직접적으로 식물에 해를 주지 않지만, 토양 구성 입자가 고운 토양으로 만들어 토양 간극을 좁게 하여 결국에는 수분투과 및 배수를 극히 어렵게 하고 식물의 뿌리가 성장하는 것을 방해한다. 염류-나트륨 토양(saline-sodic)은 용해성 염과 교환성 나트륨을 함유한 토양으로서 방치하면 토양 구조를 악화시켜 작물의 생육이 불가능한 상태로 되기 때문에 토양 개선이 필수적으로 이루어져야 한다.
국내외에서 수행되고 있는 염류 장해 극복 방안 중 하나는 염에 내성을 가진 식물(salt tolerant crops)을 재배하는 경작적 제어법에 의존하고 있다. 그러나 높은 내성을 가진 작물은 목화, 보리 등 몇 종에 국한될 뿐만 아니라, 종자가 발아하기 위해서는 토양의 염류농도가 한계수준 이하의 비교적 낮은 수준에서만 가능하다. 대부분의 식물은 이들보다 염류농도에 더 민감하다. 또한 물리적인 극복방안은 문제가 되는 포장에 토관 배수로(tile drainage)를 설치하여 문제를 해결하고 있는 실정이다. 대단히 광범위한 염류장해토양(시설재배지, 간척지)을 대상으로, 배수로 공사를 할 경우 천문학적인 비용이 소요되므로 경제적인 부담은 이루 헤아릴 수 없는 상황이다. 뿐만 아니라 대다수의 자연 배수로는 토양 염류를 잘 여과할 수 있는 능력이 결여되어 있다.
현재 대다수의 국내 포장 토양과 간척지 토양은 이미 염류 장해가 매우 심각한 상태에 놓여있다. 이러한 염류 장해는 농작물 생육에 큰 피해를 주어 농업 생산성에 가장 커다란 걸림돌이 되는 농업 환경 문제 중 하나이다. 그러나 현재까지 국내외적으로 염류 장해 토양의 복원에 대한 구체적이고도 성공적인 환경 친화형 기술은 전무한 실정이다. 따라서 염류 장해 토양 복원을 위한 환경 친화형 미생물 제제의 개발은 절실하다.
이에 본 발명자들은 토양으로부터 인산염 가용화 균주를 탐색 및 분리하여 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균주를 분리하고, 상기 균주를 포함하는 미생물 제제가 토양내 집적된 염류를 분해 또는 제거하고, 식물의 생장을 촉진하는 활성을 갖는다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 토양으로부터 유래된 신규한 인산염 가용화 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 토양 염류 집적 해소용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 식물 생장 촉진제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 단계를 포함하는 염류 집적 해소 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생육 촉진 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC 11893BP로 기탁된 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 토양 염류 집적 해소용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물 생장 촉진제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 단계를 포함하는 염류 집적 해소 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생육 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 판토에아 속(Pantoea sp.) J11 균주 또는 상기 균주의 배양액이 염류집적 토양에 대해 우수한 염류 분해 활성을 나타내고 식물 생육촉진 및 수확량에 대해 증수 효과를 나타내기 때문에, 상기 균주 또는 이의 배양액은 토양 염류 장해 극복 또는 식물 생육 촉진에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 트리칼슘포스페이트에 대한 가용화 활성을 나타내는 그림이다.
도 2는 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11)균주를 영양 한천 배지에서 계대배양하여 순수 배양된 균주를 나타내는 그림이다.
도 3은 판토에아 속 J11 균주의 16S rRNA 유전자 계통학적 위치를 나타내는 그림이다.
16S rRNA 서열에 기초하여 판토에아 속 J11 균주와 관련된 박테리아 분류군의 위치를 나타내는 계통수(Phylogenetic tree)를 작성하였다. 가지에 있는 수는 50 % 이상 지지되는 가지들로만 비롯된, 부트스트랩(bootstrap) 수치이다.
선은 위치당 0.002 치환이다.
T: 스트레인 유형
도 4는 J11 균주의 균체 지방산 조성 분석 결과를 나타내는 그래프와 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC 11893BP로 기탁된 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) 균주를 제공한다.
상기 균주는 토양 내 집적된 염류를 분해 또는 제거하는 활성을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 토양은 염류 장해 토양인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 균주는 시설 재배지 또는 간척지의 토양에 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 토양으로부터 인산 가용화 능력이 있는 균을 분리하기 위해서 전국 각지로부터 많은 토양시료를 수집하였다. 채취한 토양 시료 1 g을 멸균 증류수에 현탁한 후, 트리칼슘포스페이트(Ca3(PO4)2)의 최종 농도가 0.5 % 되도록 조제한 고형 배지에 평판희석법을 이용하여 페트리 디쉬에 도말, 접종하였다. 접종된 배지를 30 ℃ 항온기에서 2 내지 3일 배양하여 생육이 빠르고 투명환이 큰 균주를 인산 가용화능이 있는 균주로 선별하였다(도 1).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 균주의 게놈은 벤질 클로라이드(Benzyl chloride)법을 변형한 방법을 이용하여 상기 균주의 게놈 DNA를 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출된 게놈 DNA에서 상기 균주의 16S rRNA 유전자는 서열번호: 1 및 2로 기재되는 프라이머(primer) 쌍을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여(서열번호: 3), DDBJ/NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project Ⅱ(RDP Ⅱ)의 데이터베이스에서 상동성 검색을 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 분자계통학적 분석결과에서 보는 바와 같이 선별된 균주는 판토에아 속(Pantoea sp.)에 속하는 종으로 판명되었다. 특히 상기 선발된 균주는 판토에아 속 CRLS069b(FJ593734)와 100 %, 그리고 표준 균주인 펙토박테리움 시프리페디(Pectobacterium cypripedii) DSM3873(AJ233413)의 염기서열과 98.3%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되어 상기 선별된 균주를 '판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11)'로 명명하고 상기 균주를 2011년 3월 14일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호; KCTC 11893BP).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균주의 지방산 조성을 분석하여 주요 지방산으로 C16 :1 iso(36.99 %)를 나타내었으며, C12 :0, C14 :0, C16 :0 그리고 그것의 썸드피쳐 3(Summed feature 3)와 같은 다양한 지방산을 함유하는 특징을 나타내었다. 또한 상기 균주는 판토에아 속의 표준 균주들과도 주요 균체 지방산 조성과도 유사한 균체 지방산 조성을 갖는 것으로 확인되었다(표 1 및 도 3).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 판토에아(Pantoea sp.) J11은 영양배지(Nutrient broth)에서 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 통상의 세균이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 모두 배양이 가능하다. 상기 배양은 호기적 조건에서 진탕 배양하는 것이 바람직하고, 배양온도, 배양 pH 및 배양 시간은 28 ℃ 내지 35 ℃, pH 6.0 내지 7.0에서 2 내지 5일간 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 토양 염류 집적 해소용 조성물을 제공한다.
상기 토양은 염류 장해 토양인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 시설 재배지 또는 간척지의 토양에 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/㎖가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 이를 미생물 제제 원액으로 사용하고, 상기 미생물 제제 원액을 500 ㎖에 균수가 107~108 CFU/㎖가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토양 염류 집적 해소용 조성물은 판토에아(Pantoea sp.) J11의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명에 따른 유효성분은 전체 조성물에 대하여 상기 균체 또는 배양액을 0.0625 ~ 90 중량%를 사용하는 것이 바람직하며, 0.125 ~ 50 중량%를 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 미생물 제제에 염류장해의 척도인 전기전도도(electrical conductivity, EC)의 수치가 약 20 내지 30 %이상 경감되었고, 또한 치환성 양이온인 칼륨(K), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg)도 30 내지 40 % 이상 경감시켰다(표 2).
또한, 본 발명은 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물 생장 촉진제를 제공한다.
상기 식물 생장 촉진제는 미생물 농약, 종자 코팅제, 미생물 영양제, 토양 개량제, 퇴비 부숙제 및 엽면 살포제로 구성된 군으로부터 선택되는 것으로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 식물 생장 촉진제는 농약 제제로서 사용가능한 담체를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 담체는 통상적으로 사용되는 농약 제형으로 허용 가능한 담체이면 모두 사용할 수 있다. 특히 동결보존제 스킴밀크(skim milk), 효모 추출물(yeast extract), PG와 전착제 SOF70, 계면활성제 TD20A, AS65D 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/㎖가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 이를 미생물 제제 원액으로 사용하고, 상기 미생물 제제 원액을 500 ㎖에 균수가 107~108 CFU/㎖가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토양 염류 집적 해소용 조성물은 판토에아(Pantoea sp.) J11의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명에 따른 유효성분은 전체 조성물에 대하여 상기 균체 또는 배양액을 0.0625 ~ 90 중량%를 사용하는 것이 바람직하며, 0.125 ~ 50 중량%를 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 미생물 제제가 작물의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 작물은 상추인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상추 비닐하우스에 대조구(관행), 반량 처리(1600배 희석), 적량 처리(800배 희석), 배양 처리(400배 희석)로 관주 처리하였다. 정식 후 8주 후 생육 및 수량 조사를 실시하여 평균값으로 계산하였다(표 3). 상추 초장은 일반관행에 비해 미생물 제제 시용구에서 다소 길었고, 엽수는 시용량이 증가함으로서 비례적으로 많았는데 대조구에 비해 적량처리 시용구가 평균 2 ~ 3 배(5 ㎝ 이상의 엽장)가 더 많은 경향을 나타내었다. 엽폭은 처리 구간 유의적인 차이가 없었고 생체중은 적량처리 이상 시용함으로 증가하였다. 뿌리길이는 시용량이 증가할수록 길었으며 측근 및 세근은 적량처리이상 시용구에서 잘 발달하였다.
엽록체의 발달은 관행재배에 비해 미생물 제제 시용량에 따라 엽록체 함량이 증가하는 경향을 나타내었다.
또한, 본 발명은 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 단계를 포함하는 염류 집적 해소 방법을 제공한다.
상기 토양은 염류 장해 토양인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 시설 재배지 또는 간척지의 토양에 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토양 염류 집적 해소 방법은 판토에아(Pantoea sp.) J11의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명에 따른 토양에 처리하는 용량은 0.0625 ~ 90 중량%인 판토에아(Pantoea sp.) J11의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 조성물을 토양에 처리하는 것이 바람직하며, 조성물을 800배 희석하여 관주하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/㎖가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 이를 미생물 제제 원액으로 사용하고, 상기 미생물 제제 원액을 500 ㎖에 균수가 107~108 CFU/㎖가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하여 사용하는 방법으로 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생육 촉진 방법을 제공한다.
상기 처리는 식물의 종자에 도포하는 처리, 식물의 종자를 침지시키는 처리, 식물의 재배 토양에 관주(灌注)하는 처리, 식물의 재배 토양 표면에 분무하는 처리, 식물의 경엽에 살포하는 처리, 및 식물의 부상부(付傷剖)에 접촉시키는 처리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식물 생육 촉진 방법은 판토에아(Pantoea sp.) J11의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 조성물을 식물에 처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명에 따른 식물에 처리하는 용량은 0.0625 ~ 90 중량%인 판토에아(Pantoea sp.) J11의 균체, 이의 배양액, 이의 배양액 추출물 또는 배양 여액을 포함하는 조성물을 식물에 처리하는 것이 바람직하며, 조성물을 800배 희석하여 관주하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/㎖가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 이를 미생물 제제 원액으로 사용하고, 상기 미생물 제제 원액을 500 ㎖에 균수가 107~108 CFU/㎖가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이하 실시예를 통해 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
인산염 가용화 균주의 탐색 및 분리
인산 가용화 능력이 있는 균을 분리하기 위해서 전국 각지로부터 토양 시료를 수집하였다. 채취한 토양 시료 1 g을 멸균 증류수에 현탁한 후, 트리칼슘포스페이트(Ca3(PO4)2)의 최종 농도가 0.5 % 되도록 조제한 고형 배지에 평판희석법을 이용하여 페트리 디쉬에 도말, 접종하였다. 접종된 배지를 30 ℃ 항온기에서 2 내지 3일 배양하여 생육이 빠르고 투명환이 큰 균주를 인산 가용화능이 있는 균주로 선별하였다(도 1).
유전학적 특성 및 지방산 조성을 통한 선별된 미생물 균주의 동정
본 발명자들은 선별된 균주의 종 분석을 위해, 목원대학교 미생물생태자원연구소에 의뢰하여 16S rRNA 유전자 전염기서열 해석 및 세포 지방산 분석을 실시하였다.
<2-1> 16S rRNA 유전자의 상동성 분석을 통한 선별된 미생물 균주의 동정
<실시예 1>에서 선별된 균주를 영양 한천 배지(Nutrient agar, Difco, USA)에 접종하고 28 ℃에서 3일간 배양한 후 단일 균주임을 확인하였다. 상기 균주를 영양 배지(Nutrient broth, Difco, USA)에 접종한 후 28 ℃에서 2일간 진탕 배양한 후 벤질 클로라이드(Benzyl chloride)법을 변형한 방법을 이용하여 상기 균주의 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA에서 상기 균주의 16S rRNA 유전자를 서열번호: 1 및 2로 기재되는 프라이머(primer) 쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법으로 증폭하였다.
프라이머 27F : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(서열번호: 1),
프라이머 1492R : 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (서열번호: 2)
여기서 PCR 조건은 하기와 같다.
95 ℃ 2분,
94 ℃ 30초, ┐
58 ℃ 30초, │ 30 사이클
72 ℃ 45초, ┘
72 ℃ 5분, 및
4 ℃ 보관
16S rRNA 유전자 PCR 증폭 산물은 PCR Product Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였고, Genetic analyzer 310A(Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석하여 하기의 16 rRNA cDNA 1,333bp의 염기서열을 결정하였다.
5'-GCTCCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACACCATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGAAGTTAATAACTTCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATCCACGGAATTTGGCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGA-3'(서열번호: 3)
상기 균주의 16S rRNA 염기서열은 DDBJ/NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project Ⅱ(RDP Ⅱ)의 데이터베이스에서 상동성 검색을 수행하였다. 분자계통학적 분석결과에서 보는 바와 같이 선별된 균주는 판토에아 속(Pantoea sp.)에 속하는 종으로 판명되었다(도 3). 특히 상기 선발된 균주는 판토에아 속 CRLS069b(FJ593734)와 100 %, 그리고 표준 균주인 펙토박테리움 시프리페디(Pectobacterium cypripedii) DSM3873(AJ233413)의 염기서열과 98.3 %의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되어 상기 선별된 균주를 '판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11)'로 명명하였다. 상기 균주를 2011년 3월 14일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호; KCTC 11893BP).
<2-2> 지방산 조성을 통한 선별된 미생물 균주의 동정
상기 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균주의 지방산 조성을 알아보기 위하여, 상기 균주를 TSA(Trypticase Soy Broth Agar, Difco, USA) 배지에 접종 후, 28 ℃에서 3일간 배양한 후 균체 50 ㎎(건조 중량)을 Ikemoto & Miyagawa의 방법에 의하여 균체 지방산 메틸 에스터(methyl ester)화 및 추출을 수행하였다. 지상산 조성은 Microbial Identification System (MIDI; Microbial ID, Inc., Newark, Del., USA)을 이용하여 6890N Gas Chromatograph(Agilent Technologies)로 분석하였다.
그 결과 주요 지방산으로 C16 :1 iso(36.99 %)를 나타내었으며, C12 :0, C14 :0, C16:0 그리고 썸드피쳐 3(Summed feature 3)과 같은 다양한 지방산을 함유하는 특징을 나타내었다. 또한 상기 균주는 판토에아 속의 표준 균주들과도 주요 균체 지방산 조성과도 유사한 균체 지방산 조성을 갖는 것으로 확인되었다(표 1 및 도 3).
판토에아 속(Pantoea sp.) J11의 균체 지방산 특성
지방산(%) 판토에아 속 J11 판토에아 디스펄사
(Pantoea
dispersa)LMG2603T 		판토에아 아미로보라(Pantoea amylovora)LMG2024T
포화 지방산
(Saturated acids)		 C12 :0 20.64 4.2 5.1
C14 :0 11.35 3.0 4.9
C16 :0 9.72 30.8 34.0
분지사슬 지방산
(Branched-chain acids)		 C16 :1 iso
36.96
10.6
24.5

썸드피쳐 3
(Summed feature 3)
7.50
9.0
9.1
액상형 미생물 제제의 제조
상기 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) KCTC 11893BP 균주의 배양은 영양 배지(Nutrient broth, Difco, USA)를 기본으로 사용하였다. 균주는 영양 한천 배지(Nutrient agar, Difco, USA)에서 1 내지 2일간 배양한 후 영양 배지 100 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 삼각플라스크에 접종하여 48시간 동안 종균 배양을 하였다. 본 배양을 위해서 액체 배지 1.5 L를 함유하는 3 L 삼각플라스크에 상기 종균 배양액을 접종하여 배양하였다. 배양조건은 30 ℃에서 150 rpm으로 48시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 균은 원심분리기를 이용하여 배양액을 제거하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 미생물 수가 109~1010 CFU(colony forming unit)/㎖가 되도록 멸균 증류수로 현탁하여 4 ℃에서 보관하고 이를 미생물 제제 원액으로 사용하였다.
상기 미생물 제제 원액을 500 ㎖에 균수가 107~108 CFU/㎖가 되도록 희석하여 미생물 제제를 제조하였다.
제조된 미생물 제제의 활성 시험
상기 <실시예 3>에서 얻은 미생물 제제를 시설하우스 토양 300평에 800배 희석하여 관주 처리하고 8주 후 그 결과를 관찰하였다.
<4-1> 제조된 미생물 제제의 토양 염류 집적 해소 활성 시험
미생물 제제를 토양에 처리한 결과, 염류장해의 척도인 전기전도도(electrical conductivity, EC)의 수치가 약 20 내지 30 %이상 경감되었고, 또한 치환성 양이온인 칼륨(K), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg)도 30 내지 40 %이상 경감되었다(표 2).
미생물 제제 처리에 따른 토양 분석

구분
pH		 전기
전도도
(EC)
유효인산
(ppm)
치환성 양이온(me/100g)
유기물
(%)
칼륨 칼슘 마그네슘

처리
1
전
7.2
3.85
385
4.92
20.1
4.9
4.1

후
7.4
2.96
617
2.14
9.35
3.6
4.2

처리
2
전
6.7
4.57
423
5.85
17.6
6.2
4.0

후
6.5
3.65
507
3.04
6.85
3.9
3.8
<4-2> 제조된 미생물 제제의 식물 생장 촉진 활성 시험
또한 미생물제제가 작물의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 상추 비닐하우스에 대조구(관행), 반량 처리(1600배 희석), 적량 처리(800배 희석), 배량 처리(400배 희석)로 관주 처리하였다. 정식 후 8주 후 생육 및 수량 조사를 실시하여 평균값으로 계산하였다(표 3). 처리간 평균 비교는 5 % 수준에서 DMRT에 의해 분석하였다.
미생물 제제가 상추의 생육에 미치는 효과

처 리
초 장
(㎝)
엽 수
(매)
엽 폭
(cm)
근 장
(㎝)
생체중(g)
건물중(g)
엽록체
(㎎/㎡)

엽중
근중
엽중
근중
대조구
(관행)
27.48b
9.74c
16.33a
13.65c
106.0c
4.06c
5.31c
0.42c
20.4b
반량
처리수
28.89a
10.89c
15.95a
15.72b
117.2c
4.90b
5.45c
0.54bc
21.3b
적량
처리구
29.53a
12.40b
16.78a
17.60a
151.9b
5.46b
7.78b
0.60b
24.6a
배량
처리구
30.40a
13.46a
18.03a
16.37ab
177.1a
6.70a
9.74a
0.77a
25.3a
상추 초장은 일반 관행에 비해 미생물 제제 시용구에서 다소 길었고, 엽수는 시용량이 증가함으로써 비례적으로 많았는데 대조구에 비해 적량 처리 시용구가 평균 2 ~ 3배(5 ㎝이상의 엽장)가 더 많은 경향을 나타내었다. 엽폭은 처리 구간 유의적인 차이가 없었고 생체중은 적량처리 이상 시용함으로 증가하였다. 뿌리 길이는 시용량이 증가할수록 길었으며 측근 및 세근은 적량 처리 이상 시용구에서 잘 발달하였다.
한국생명공학연구원 KCTC11893BP 20110314
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Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 수탁번호 KCTC 11893BP로 기탁된 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 염류 장해 토양의 염류 집적 해소용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서, 상기 조성물은 시설 재배지 또는 간척지의 토양에 사용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 수탁번호 KCTC 11893BP로 기탁된 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물 생장 촉진제.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 식물 생장 촉진제는 미생물 농약, 종자 코팅제, 미생물 영양제, 토양 개량제, 퇴비 부숙제 및 엽면 살포제로 구성된 군으로부터 선택되는 것으로 사용되는 것을 특징으로 하는 식물 생장 촉진제.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 식물 생장 촉진제는 농약 제제로서 사용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 생장 촉진제.
  11. 수탁번호 KCTC 11893BP로 기탁된 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 염류 장해 토양에 처리하는 단계를 포함하는 염류 집적 해소 방법.
  12. 삭제
  13. 제 11항에 있어서, 상기 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 시설 재배지 또는 간척지의 토양에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 수탁번호 KCTC 11893BP로 기탁된 판토에아 속 J11(Pantoea sp. J11) 균주, 이의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생육 촉진 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 처리는 식물의 종자에 도포하는 처리, 식물의 종자를 침지시키는 처리, 식물의 재배 토양에 관주(灌注)하는 처리, 식물의 재배 토양 표면에 분무하는 처리, 식물의 경엽에 살포하는 처리, 및 식물의 부상부(付傷剖)에 접촉시키는 처리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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