KR20080054047A - 염류장해토양의 복원을 위한 인산염가용화 균주인아시네토박터 칼코아세티쿠스 씨앤7 - Google Patents

염류장해토양의 복원을 위한 인산염가용화 균주인아시네토박터 칼코아세티쿠스 씨앤7 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인산염가용화균주인 아시네토박터 칼코아세티쿠스 CN7 균주를 이용한 염류장해토양 복원에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 시설하우스 토양의 과잉 축적된 염류를 효과적으로 분해하거나 제거할 수 있는 미생물의 분리와 염류분해효과로 구성되어있다. 이와 같이 염류를 효과적으로 분해 또는 제거하는 미생물을 산업화하여 농가 포장에 접목할 경우 토양개량 및 작물 생산성 및 수량의 증가를 가져올 것이다.
염류장해토양복원, 인산염가용화균주, 아시네토박터 칼코아세티쿠스, 토양개량, 작물 생산성증가

Description

염류장해토양의 복원을 위한 인산염가용화 균주인 아시네토박터 칼코아세티쿠스 씨앤7{Phosphate Solubilizing Bacteria Acinetobacter calcoaceticus CN7 of Bioremediation for the Recovery of Salt Injury Soil}
도1은 본 발명에서 사용한 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) CN7 균주의 트리칼슘포스페이트 아가 배지에서 인산염 분해활성을 나타낸 사진
도2는 균주동정을 위한 지방산조성을 나타내는 기체크로마토그래피의 스펙트럼
도3은 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) CN7 균주의 부분 염기서열
도4는 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) CN7 균주의 16S rDNA 서열에 의한 분류학적 위치를 나타낸 계통수
본 발명은 유용한 토양미생물을 포함하는 미생물 제제 및 그를 이용한 염류장해토양 복원에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) CN7 균주가 불용성 인산염인 트리칼슘포스페이트에 대한 가용화활성을 나타냄을 확인하고 이 균주를 이용하여 토양에 과다 집적된 염류를 효과적으로 분해, 제거하는 토양미생물 제제에 관한 것이다.
염이란 화학적으로는 산과 염기가 결합된 것을 말하고, 비료로 사용되는 황산칼리는 황산(산)과 칼리(염기)가 결합한 염이며, 염기는 전기적으로 양성을 나타내는 칼리, 석회, 마그네슘, 나트륨, 철, 아연, 망간 등의 금속원소이고, 산은 전기적으로 음성을 띠는 질산, 황산 및 염소 이온 등이 있다. 따라서 염은 작물생육에 꼭 필요로 하는 영양소이다. 그러나 이들 염류가 토양 중에 적정 수준 이상으로 존재할 때 우리는 염류집적이라고 말하며, 과다한 염은 식물의 근권을 통해 흡수되어 식물에 치명적인 상해를 입히는 장해를 염류장해라고 한다.
염류장해는 염류성 토양(saline soils) 및 나트륨 토양(sodic soils), 염류-나트륨 토양 (saline-sodic)의 세 가지 형태로 발생한다. 첫 번째 경우는 과다한 용해성 염을 함유한 토양으로 심한 경우 토양표면이 잔류물로 인해 하얗게 되는데, 이는 식물의 수분과 양분 흡수를 어렵게 하고 독성을 가지고 있어 염의 여과와 배수가 필수적이다. 두 번째 경우는 과다한 교환성 나트륨을 함유한 토양인데 그 자체는 직접적으로 식물에 해를 주지 않지만, 토양구성 입자가 고운 토양으로 만들어 토양간극을 좁게 하여 결국에는 수분투과 및 배수를 극히 어렵게 하고 식물의 뿌리 가 성장하는 것을 방해한다. 세 번째 경우는 용해성 염과 교환성 나트륨을 함유한 토양으로서 방치하면 토양구조를 악화시켜 작물의 생육이 불가능한 상태로 되기 때문에 토양개선이 필수적으로 이루어져야 한다.
국내외에서 수행되고 있는 염류장해 극복 방안 중 하나는 염에 내성을 가진 식물(salt tolerant crops)을 재배하는 경작적 제어법에 의존하고 있다. 그러나 높은 내성을 가진 작물은 목화, 보리 등 몇 종에 국한될 뿐만 아니라, 종자가 발아하기 위해서는 토양의 염류농도가 한계수준 이하의 비교적 낮은 수준에서만 가능하다. 대부분의 식물은 이들보다 염류농도에 더 민감하다. 또한 물리적인 극복방안은 문제가 되는 포장에 토관 배수로(tile drainage)를 설치하여 문제를 해결하고 있는 실정이다. 대단히 광범위한 염류장해토양(시설재배지, 간척지)을 대상으로, 배수로 공사를 할 경우 천문학적인 비용이 들므로 경제적인 부담은 이루 헤아릴 수 없는 상황이다. 뿐만 아니라 대다수의 자연 배수로는 토양염류를 잘 여과할 수 있는 능력이 결여되어 있다.
현재 대다수의 국내 포장토양과 간척지토양은 이미 염류장해가 매우 심각한 상태에 놓여있다. 이러한 염류장해는 농작물생육에 큰 피해를 주어 농업 생산성에 가장 커다란 걸림돌이 되는 농업환경문제중 하나이다. 그러나 현재까지 국내외적으로 염류장해토양의 복원에 대한 구체적이고도 성공적인 환경친화형 기술은 전무한 실정이다. 따라서 염류장해토양복원을 위한 환경친화형 미생물제제의 개발은 절실한 과제라 사료된다.
이에 본 발명자들은 국내 토착미생물을 이용하여 토양 집적 염류를 생물학적인 방법으로 분해하는 방법을 연구 개발하던 중 인산염 가용화능력이 탁월한 세균을 분리하였고 이 균주를 이용하여 토양염류분해 미생물제제로서의 개발 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 인산염을 가용화하는 효과를 나타내는 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) CN7 균주를 이용하여 염류집적토양의 복원을 위한 환경친화형 미생물제제원을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인산염 가용화능력이 우수한 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) CN7 균주를 토양으로부터 분리하였으며, 이 균주를 이용하여 토양에 집적된 염류를 효과적으로 분해하고 식물생육에 도움을 줌으로써 염류집적 토양의 개량을 위한 미생물제제로서의 이용가능성을 포함한다.
이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예에 준하여 더욱 상세하게 설명하겠으나, 본 발명이 다음 실시예에 한정된 것은 아니다.
실시예 1: 인산염 가용화균주의 탐색 및 분리
인산가용화능력이 있는 균을 분리하기 위해서 전국각지로부터 많은 토양시료를 수집하고, 수집한 토양시료를 트리칼슘포스페이트의 최종농도가 0.5% 되도록 조제한 고형배지에 채취한 토양시료 1g을 멸균증류수에 현탁한 후 평판희석법을 이용하 여 페트리디쉬에 도말, 접종한 다음 30℃ 항온기에서 2~3일 배양하여 생육이 빠르고 투명환이 큰 균주를 인산가용화능이 있는 균주로 선발하였다 [ 도1 ].
실시예 2: 균주의 동정
토양으로부터 분리한 불용성 인산염 가용화능이 우수한 균주의 생리적, 생화학적인 검사를 수행하였다(BERGEY´s Manual of Systemic Bacteriology). 그 결과, 뉴트리언트 아가 배지상에서 우유빛의 콜로니를 가지며 형태학적 특성으로는 호기성 간균이었다. 다른 생리생화학적 특성은 표 1에 요약하였다.
표1. 분리균주의 생리생화학적 특성
조사항목 특성
형태(Cell type) 간균
운동성(Motility) 양성
그람염색(Gram stain) 음성
에스큐린가수분해(Esculin hydrolysis) 음성
카탈라제 (Catalase) 음성
시트레이트 이용력(Citrate utilization) 양성
젤라틴 액화력(Gelatin liquefaction) 음성
인돌 생산(Indole production) 양성
멜틸레드 시험(Methyl-red test) 양성
보제스-프론카울(Voges-proskauer)시험 음성
산화효소(Oxydase) 양성
전분가수분해(Starch hydrolysis) 양성
트립토판 가수분해 (Tryptophan hydrolysis) 양성
페닐알라닌(Phenlyalanine) 양성
락토스 분해(Lactose) 양성
또한 미생물 동정 시스템(MIDI)의 표준실험법에 의하여 지방산을 메틸에스테르화하고 기체크로마토그라프로 분석한 다음, 지방산의 분포양상을 분석하였다. 그 결과, 아시네토박터 칼코아세티커스(Acinetobacter calcoaceticus)에 대하여 0.174, 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii)에는 0.170의 근연성을 나타내는 것으로 확인되어 이 균주를 아시네토박터속(Acinetobacter sp.) 균주로 나타났다. [도2], [표2]
표2. 분리균주의 지방산 조성 및 근연성
지방산 균주내 함유량(%)
12:0 10.46
12:0 2OH 3.53
12:0 3OH 3.75
15:0 1.25
Sum In Feature 2 3.06
Sum In Feature 3 17.70
16:0 24.53
17:1 w8c 2.35
17:0 1.13
18:1 w9c 27.37
구분 근연지수 균주명
TSBA40 0.174 Acinetobacter
0.174 A. calcoaceticus
0.170 A. baumannii
0.110 A. radioresistens
CLIN40 0.155 Acinetobacter
0.155 A. calcoaceticus
0.125 A. baumannii
다른한편으로, 더욱 정확한 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 서열에 의한 균주의 계통학적 분류를 위하여 CN7 균주를 대상으로 뉴트리언트 액체배지에서 72시간동안 진탕배양한 후 이들 균체로부터 DNA를 추출하였으며, 이를 PCR (primers: 27F, 5'-GAGTTTGATCCTG- GCTCAG-3' 및 1492R, 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'/ 30 cycles: 95℃ 2 min, 94℃ 30 sec, 55℃ 30 sec, 72℃ 42 min, 72℃ 5 min, then 16℃ ∞)로 증폭시켜 정제하고 Genetic Analyzer 310A (Applied Biosystems)을 사용하여 염기서열을 분석하였으며, 염기서열은 CLUSTAL X (Thomson et al., 1994) 및 PHYLIP (Felsenstein, 1993) 프로그램으로 계통학적 위치를 확인하였다. 그 결과 CN7 균주의 16S rDNA 서열에 의한 염기서열은 도면3과 같이 나타났으며, 16S rDNA 서열에 의한 유효세균과 그 관련세균의 분류학적 위치를 나타내는 계통수(philogenetic tree)는 도면4와 같이 나타났다. 계통학적 분류방법에 따르면 Acinetobacter calcoaceticus 균주와 100%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되어 CN7균주는 Acinetobacter calcoaceticus로 동정되었다.
실시예 3: 액상형 미생물제제의 제조
상기의 분리동정된 균주의 배양은 뉴트리언트 액체배지를 기본으로 사용하였다. 균주는 뉴트리언트 액체배지에서 1~2일간 배양한 후 액체배지 100ml를 함유하는 250ml 삼각플라스크에 접종하여 48시간 종균배양을 하였다. 본 배양을 위해서는 액체배지 1.5L를 함유하는 3L 삼각플라스크에 상기에서 얻은 종균 배양액을 접종하여 배양하였다. 배양조건은 30℃에서 150rpm으로 48시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 균은 원심분리기를 이용하여 배양액을 제거한 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 미생물수가 109~1010CFU/ml가 되도록 멸균증류수로 현탁하여 4℃에서 보관하며 이를 미생물제제원액으로 사용하였다.
이 미생물제제원액을 500ml에 균수가 107~108CFU/ml가 되도록 희석하고 여기에 영양제, 미량요소, 그리고 기타 첨가제를 혼합하여 미생물제제를 제조하였다.
실시예 4: 제조된 미생물제제의 활성시험
상기 실시예 3에서 얻은 미생물제제를 전라남도 나주시에 소재한 2곳의 시설하우스 토양에 300평에 800배 희석하여 관주 처리하여 4주 후 그 결과를 관찰하였다. 그 결과 염류장해의 척도인 전기전도도(EC)의 수치가 약 20~30%이상 경감되었으며, 또한 치환성 양이온인 칼륨(K), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg)도 30~40%이상 경감시켰다.(표3)
표3. 미생물제제 처리에 따른 토양분석
구분 pH 유기물 (%) 유효인산 (ppm) 치환성 양이온(me/100g) 전기전도도
칼륨 칼슘 마그네슘
처리1 처리전 7.1 4.3 383 5.00 19.4 5.8 3.72
처리후 7.3 4.3 624 2.12 9.70 3.3 2.90
처리2 처리전 6.8 4.0 443 5.14 18.5 6.0 4.77
처리후 6.6 3.7 514 2.92 7.30 4.1 3.50
또한 미생물제제가 작물의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 상추비닐하우스에 관행구, 대조구(멸균후 800배희석), 반량처리(1600배희석), 적량처리(800배희석), 배량처리(400배희석)로 엽면 및 관주처리하고 정식 후 4, 5, 7주후 3회 동안 생육 및 수량조사를 실시하여 평균값으로 계산하였다.(표4, 표5)
표4. 미생물제제가 상추의 생육에 미치는 효과
처리구 엽장 엽폭 Chlorophyll 함량
cm 지수 cm 지수 mg/100cm2 지수
관행구 16.1 99 10.7 99 2.11 99
대조구 16.2 100 10.9 100 2.12 100
반량처리구 16.6 102 11.1 103 2.18 103
적량처리구 17.0 105 11.5 106 2.21 104
배량처리구 17.3 107 11.7 107 2.25 106
재배기간 동안 생육조사에서 엽장의 경우 대조구에 비해 반량처리, 적량처리 및 배량처리구에서 2~7%의 증가 효과를 보였고, 엽폭도 3~8%가 증가되는 경향을 나타냈다. 그리고 엽록소의 조사결과에서도 반량 및 적량, 배량처리구에서 대조구에 비해 3~6%정도 높게 나타났다.
표5 .미생물제제 처리 후 상추의 수확량에 대한 효과
처리구 수확량 개체중량
kg/100주 지수 g/10EA 지수
관행구 2.38 99 52.3 99
대조구 2.40 100 52.9 100
반량처리구 2.51 105 55.1 104
적량처리구 2.66 111 59.4 112
배량처리구 2.76 115 62.0 117
상추의 수확량과 개체중량에서 미생물제제의 반량 및 적량, 배량처리구가 대조구에 비해 5~15%, 4~17%의 증수효과를 보였다.
본 발명은 토양으로부터 분리한 미생물을 이용하여 제조한 토양 미생물제제로써 토양내 집적된 염류를 효과적으로 분해 또는 제거함으로써 토양개량 및 작물 생산성 및 수량 증가의 효과를 얻을 수 있다.

Claims (2)

  1. 토양으로부터 분리한 인산염 가용화 능력을 가지고 있는 미생물 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) CN7 균주
  2. 제1항의 미생물을 이용한 미생물 농약, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제의 유효성분으로 이용되는 것을 특징으로 하는 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) CN7 균주
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