CN104774784A - 一种解磷菌及其获取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种解磷菌及其获取方法，涉及农业生物技术领域，可以丰富野生解磷菌遗传资源，扩大解磷菌全基因组育种的后备库。所述解磷菌名称为YYF22菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2015043，其菌落特征为：YYF22菌株为球杆菌，菌体长1.2-2.9μm、宽0.4-1.5μm；常成对排列，也可单个存在，有时黏连成丝状或链状，无鞭毛，具荚膜，不能运动，在LB平板上菌落边缘整齐，表面湿润，低凸起，有光泽，乳黄色。

Description

一种解磷菌及其获取方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种解磷菌及其获取方法。
背景技术
磷在植物体中的含量仅次于氮和钾，是植物生长发育的关键营养元素之一。缺磷土壤一般是指土壤有效磷(P)小于10mg/kg的土壤，我国缺磷土壤面积超过耕地总面积的74％，土壤中的磷绝大部分以难溶性磷酸盐形式存在，植物无法直接吸收利用。为满足生产需要，我国绝大部分的耕种田都要大量补充磷化肥，由于长期的累积和富集，造成了土壤板结、营养元素失衡等一系列生产、生态问题。所以，如何改善和提高我国耕作田土壤磷的利用率，仍然是一项战略性课题。
众所周知，微生物在自然界物质循环的合成与分解环节起着关键作用，对磷元素而言也是如此，大量研究文献表明，某些微生物具有很强的解磷能力。在当前乃至今后一直大力提倡循环经济和保护生态环境的生产活动大背景下，通过微生物缓解和解决土壤有效磷缺乏问题仍然是人们需要投入和关注的优先选项。
目前，各类文献报道的解磷菌筛选及鉴定方法基本相同，筛选解磷菌所用的培养基主要有两类：无机磷固体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4 7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 4H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 10g，琼脂粉18-20g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.5。有机磷固体培养基(孟金娜培养基)：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4 7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 4H2O 0.03g，CaCO3 5g，(NH4)3PO4 0.5g，鸡蛋黄10ml，琼脂粉18-20g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.5。菌株解磷能力测定方法最常用的是钼锑抗比色法。
截止目前，文献报道的解磷菌典型资源类群有：芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、肠细菌属(Enterbacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、微球菌属(Micrococcus)、 固氮菌属(Azotobacter)、色杆菌属(Chromobacterium)、多硫杆菌属(Thiobacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)等；解磷放线菌绝大部分为链霉菌属(Streptom)；解磷真菌主要是曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和根霉属(Rhizopus)。随着研究工作的不断积累，将会有更多高活性解磷菌株被发现。
从已有的文献报道来看，解磷菌种类分布的比较广泛，而且解磷能力较强的种类并不十分集中，换句话来说，也就是不同类群的菌种资源都有可能存在解磷活性较高的菌株，从这个角度看，具有解磷能力野生菌株的筛选工作仍然意义重大，十分必要。总体来说，用于工业化生产和开发的野生菌株极为单一，除了解磷巨大芽孢杆菌有一定的开发应用外，其它则远不够系统和深入。就解磷菌的筛选方法上来说，方法过去单一，缺乏对培养基的改良与创新，限制了新颖菌株的发现。
发明内容
本发明的实施例提供一种解磷菌及其获取方法、应用，可以丰富野生解磷菌遗传资源，扩大解磷菌全基因组育种的后备库。创新了解磷菌的筛选培养基，丰富了筛选技术体系；同时获取具有较强解磷能力的野生菌株活体纯培养物，丰富专利菌株资源。
为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：
一种解磷菌，所述解磷菌名称为YYF22菌株，其菌落特征为：YYF22菌株为球杆菌，菌体长1.2-2.9μm、宽0.4-1.5μm。常成对排列，也可单个存在，有时黏连成丝状或链状。无鞭毛，具荚膜，不能能运动，在LB平板上菌落边缘整齐，表面湿润，低凸起，有光泽，乳黄色；
其生化指标测定结果为：革兰氏染色阴性，发酵实验阴性，明胶反应阴性，柠檬酸盐反应阴性，辛二酸阴性，3-羟基苯甲酸阴性，L-丝氨酸阴性，L-组氨酸阴性，脂肪酶阴性；脲酶反应阳性，苯乙酸阳性，乳酸反应阳性，丙二酸钠阳性，3-羟基丁酸阳性，4-羟基苯甲酸阳性，碱性磷酸酶阳性，酸性磷酸酶阳性；
其生长特性：所述YYF22菌株生长曲线基本呈“S”型；菌株对蔗糖同化能力最强，对乳糖最弱，对氮源的同化能力则表现为酵母膏＞硫酸铵＞蛋白胨＞硝酸钾＞尿素；所述YYF22菌株最适生长温度为26-34℃，最适pH为6.5-7.5。
一种上述的解磷菌的获取方法，包括：
S1、样品采集：采集洛阳市嵩县天池山国家森林公园针阔混交林阳坡土壤样品，采样海拔1300m；
S2、富集培养：按照土壤细菌分离的步骤，对步骤S1的土壤样品于30℃、160r/min条件下摇床富集培养培养48h；
S3、分离培养：在无菌操作条件下，将步骤S2中摇床富集培养后的培养液涂布于固体分离培养基进行细菌分离培养，于30℃恒温培养5d；用接种环挑取生长良好、特征典型、解磷圈大而显著的单菌落，继续在固体分离培养基平板上进行划线纯化，获得目标菌株活体纯培养物，并转接于磷细菌斜面培养基4℃保藏；
其中，所述富集培养液包括：葡萄糖6g，海藻糖0.3g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 9g，KCl 0.3g，MgSO4 7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 4H2O0.03g，CaCO3 5g，(NH4)PO4 0.5g，鸡蛋黄10ml，蒸馏水1000ml，pH7.0；
所述固体分离培养基包括：葡萄糖6g，海藻糖0.3g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4 7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 4H2O 0.03g，Ca3(PO4)28g，吉兰糖胶1.5g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml，pH7.0；
所述磷细菌斜面培养基包括：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl9g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.0；
S4、菌株的鉴定：通过步骤S2和S3的富集培养和平板分离培养，获得四株溶磷圈大而显著的菌株，初步判断具有解磷活性，确定为目标菌株，菌株编号为YYF20、YYF21、FYY22和YYF23；
S5、采用钼锑抗比色法对YYF20、YYF21、YYF22和YYF23进行解磷能力的确定，选择出解磷能力最强的菌株YYF22。
上述技术方案提供了一种新的解磷菌YYF22，通过常规形态学、生理生化特征、16S rDNA同源序列和系统进化树分析，确定YYF22隶属于不动杆菌属Acinetobacter，命名为Acinetobacter brisouii YYF22，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为：CCTCC M 2015043。截止目前，未见关于Acinetobacter brisouii解磷功能的文献报道，所以YYF22菌株的筛出，丰富了野生解磷菌遗传资源，扩大了解磷菌全基因组育种的后备库。
在获取该菌种的方法过程中，本发明创新了解磷菌的筛选培养基，并丰富筛选技术体系。获取具有较强解磷能力的野生菌株活体纯培养 物，丰富了专利菌株资源。
新的解磷菌：YYF22
拉丁文名：Acinetobacter brisouii YYF22 
保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC
保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学
保藏日期：2015年01月26日
保藏编号：CCTCC M 2015043
附图说明
图1为本发明实施例提供的目标菌株溶磷圈特征图；
图2为本发明实施例提供的YYF22菌株显微观测(×1000)特征图；
图3为本发明实施例提供的YYF22菌株的系统进化树示意图；
图4为本发明实施例提供的YYF22菌株的生长曲线示意图；
图5为YYF22菌株对不同碳源的利用结果示意图；
图6为YYF22菌株对不同氮源的利用结果示意图；
图7为YYF22菌株的最适生长温度测定结果示意图；
图8为YYF22菌株的最适pH测定结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例提供了一种解磷菌的获取方法，所述方法包括以下步骤：
S1、样品采集：采集洛阳市嵩县天池山国家森林公园针阔混交林阳坡土壤样品，采样海拔1300m。
目前关于解磷微生物资源利用方面存在的一个通病是菌株在土壤中的定殖能力差，不能很好的适应土壤环境，解磷活性较高的菌株也往往达不到较好的生产应用效果。鉴于上述原因，本发明实施例中采 用森林土壤作为筛菌的样品来源。
S2、富集培养：按照土壤细菌分离的一般步骤，对步骤S1的土壤样品于30℃、160r/min条件下进行摇床富集培养48h。
S3、分离培养：在无菌操作条件下，将步骤S2中摇床富集培养后的培养液涂布于固体分离培养基进行细菌分离培养，于30℃恒温培养5d；用接种环挑取生长良好、特征典型、解磷圈大而显著的单菌落，继续在固体分离培养基平板上划线纯化，获得目标菌株活体纯培养物，并转接于磷细菌斜面培养基4℃保藏。
富集培养液：葡萄糖6g，海藻糖0.3g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 9g，KCl 0.3g，MgSO4 7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 4H2O 0.03g，CaCO3 5g，(NH4)3PO4 0.5g，鸡蛋黄10ml，蒸馏水1000ml，pH7.0。
固体分离培养基：葡萄糖6g，海藻糖0.3g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，MgSO47H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 4H2O 0.03g，Ca3(PO4)28g，吉兰糖胶1.5g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml，pH7.0。
磷细菌斜面培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 9g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.0。
富集培养液中，特别添加了对维系细胞生理活性和菌体生命力具有良好保护作用的海藻糖，同时将NaCl的用量确定为9g/L，旨在保持与生理盐水相一致的离子浓度，有利于弱势菌株的存活与培养；鸡蛋黄含有丰富的营养和生长因子，对维系目标菌株的多样性也有很大帮助。固体分离培养基中，也添加了海藻糖，同时还加入一定量的吉兰糖胶，吉兰糖胶对维系和提高生物细胞新陈代谢活性具有刺激作用，二者的配合有利于弱势菌株的生长。
S4、菌株的鉴定：通过步骤S2和S3的富集和平板分离培养，获得四株溶磷圈大而显著的菌株(如图1所示)，初步判断具有解磷活性，确定为目标菌株，菌株编号为YYF20、YYF21、FYY22和YYF23。
S5、采用钼锑抗比色法对YYF20、YYF21、YYF22和YYF23进行解磷能力的确定，选择出解磷能力最强的菌株YYF22。
采用钼锑抗比色法对YYF20、YYF21、YYF22和YYF23进行解磷能力的确定。结果表明，相同条件下，YYF20、YYF21、YYF22和YYF23经过4发酵后，培养基上清液中游离态磷含量分别为167μg/ml、58μg/ml、 217.9μg/ml和156μg/ml，说明YYF22具有较强的解磷能力，将其作为鉴定菌株。
通过改良培养基富集和平板分离培养，筛出一株活性较高的解磷菌株YYF22，并获得其活体纯培养物。采用钼锑抗比色法，测得YYF22经过7d发酵后，培养基上清液中游离态磷含量的峰值出现在第4d，为217.9μg/ml，说明YYF22具有较强的解磷能力。
以下为YYF22菌株的鉴定：
A.YYF22菌株的菌落特征
YYF22菌株为球杆菌，菌体长1.2-2.9μm、宽0.4-1.5μm。常成对排列，也可单个存在，有时黏连成丝状或链状。无鞭毛，具荚膜，不能运动，在LB平板上菌落边缘整齐，表面湿润，低凸起，有光泽，乳黄色(图2)。
B.YYF22菌株的生化指标
生化指标的测定方法参考刘国生主编的《微生物学实验技术》和潘春梅、张晓静主编的《微生物技术》，鉴定参考《伯杰细菌鉴定手册(第九版)》。测定结果显示，YYF22菌株为革兰氏染色阴性，发酵实验阴性，明胶反应阴性，柠檬酸盐反应阴性，辛二酸阴性，3-羟基苯甲酸阴性，L-丝氨酸阴性，L-组氨酸阴性，脂肪酶阴性；脲酶反应阳性，苯乙酸阳性，乳酸反应阳性，丙二酸钠阳性，3-羟基丁酸阳性，4-羟基苯甲酸阳性，碱性磷酸酶阳性，酸性磷酸酶阳性。初步鉴定为不动杆菌属Acinetobacter。
C.YYF22菌株的16S rDNA分析
16S rDNA PCR扩增引物为：
正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物1492R：5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′
通过PCR扩增目标菌株的16S rDNA，PCR产物经电泳、胶回收、连接质粒载体、转化、培养、蓝白斑筛选等步骤，最后对阳性克隆进行测序，获得YYF22菌株的16S rDNA基因序列。获得的YYF22菌株16S rDNA序列长度为1501bp，其DNA序列详见序列表。
通过NCBI的blast在线分析功能对YYF22菌株的16S rDNA基因序列进行同源性搜索，并用MEGA6.06软件中的Neighbor-Joining方 法构建系统发育进化树。结果表明(图3)，YYF22与Acinetobacter brisouii聚为一支，且二者基因序列的相似度达到99％。综合培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，确定YYF22与Acinetobacter brisouii属于同一种群，命名为Acinetobacter brisouii YYF22。
通过常规形态学、生理生化特征、16S rDNA同源序列和系统进化树分析，确定YYF22隶属于不动杆菌属Acinetobacter，命名为Acinetobacter brisouii YYF22。未见关于Acinetobacter brisouii解磷功能的文献报道，所以YYF22菌株的筛出，丰富了野生解磷菌遗传资源，扩大解磷菌全基因组育种的后备库。
D、鉴定菌株的生长特性
将解磷菌株YYF22接种到装有100ml磷细菌液体培养基三角瓶中，30℃、160r/min摇床培养，每隔2h测定OD600光密度值，以培养时间为横坐标，OD600光密度值为纵坐标绘制生长曲线。YYF22菌株的生长曲线如图4所示。
碳源利用测定：分别以甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉为碳源，加入磷细菌基础培养基，接入解磷菌株，30℃培养3d，用分光光度计测定600nm波长的菌体OD值。所述YYF22菌株对不同碳源的利用结果如图5所示。
所述磷细菌基础培养基包括：(NH4)2SO4 0.2g，NaCl 5g，MgSO4 7H2O0.3g，蒸馏水1000ml，pH7.0
氮源利用：分别以蛋白胨、酵母膏、硝酸钾、硫酸铵和尿素为氮源，加入磷细菌基础培养基，接入解磷菌朱，30℃培养3d，用分光光度计测定600nm波长的菌体OD值。所述YYF22菌株对不同氮源的利用结果如图6所示。
最适生长温度测定：将解磷菌株接入磷细菌液体培养基中，分别置于20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃和44℃培养3d，用分光光度计测定600nm波长的菌体OD值。所述YYF22菌株的最适生长温度测定结果如图7所示。
所述磷细菌液体培养基包括：葡萄糖6g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，MgSO4 7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 4H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 8g，蒸馏水1000ml，pH7.0。
最适pH测定：分别将磷细菌液体培养基pH调为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，接入解磷菌株，30℃培养3d，用分光光度计测定600nm波长的菌体OD值。所述YYF22菌株的最适pH测定结果如图8所示。
由图4可见，YYF22菌株的停滞周期约6h，对数期约14h，至22h达到生长稳定期，34h以后明显衰亡，“S”型生长特征比较明显；由图5可见YYF22菌株对不同碳源的同化能力表现为蔗糖＞葡萄糖＞甘露醇＞淀粉＞乳糖，由图6可见对不同氮源的同化能力表现为酵母膏＞硫酸铵＞蛋白胨＞硝酸钾＞尿素；由图7可以发现，YYF22菌株在26-34℃之间，菌体OD值变化达到最高值，且变化幅度最小，说明26-34℃使其最适生长温度；由图8可以发现，YYF22菌株对pH的变化也比较敏感，pH小于6.5或大于7.5，菌体OD均呈现剧烈变化，说明其最适pH为6.5-7.5。
菌株生长特的测定，为解磷菌株YYF22的后续的菌肥菌拮抗试验、菌肥基质选择、菌肥的应用范围等相关研究提供了基本参考。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种解磷菌，其特征在于，所述解磷菌名称为YYF22菌株，其菌落特征为：YYF22菌株为球杆菌，菌体长1.2-2.9μm、宽0.4-1.5μm；常成对排列，也可单个存在，有时黏连成丝状或链状；无鞭毛，具荚膜，不能运动，在LB平板上菌落边缘整齐，表面湿润，低凸起，有光泽，乳黄色；
其生化指标测定结果为：革兰氏染色阴性，发酵实验阴性，明胶反应阴性，柠檬酸盐反应阴性，辛二酸阴性，3-羟基苯甲酸阴性，L-丝氨酸阴性，L-组氨酸阴性，脂肪酶阴性；脲酶反应阳性，苯乙酸阳性，乳酸反应阳性，丙二酸钠阳性，3-羟基丁酸阳性，4-羟基苯甲酸阳性，碱性磷酸酶阳性，酸性磷酸酶阳性；
其生长特性：所述YYF22菌株生长曲线基本呈“S”型；菌株对蔗糖同化能力最强，对乳糖最弱，对氮源的同化能力则表现为酵母膏＞硫酸铵＞蛋白胨＞硝酸钾＞尿素；所述YYF22菌株最适生长温度为26-34℃，最适pH为6.5-7.5。
2.一种权利要求1所述的解磷菌的获取方法，其特征在于，包括：
S1、样品采集：采集洛阳市嵩县天池山国家森林公园针阔混交林阳坡土壤样品，采样海拔1300m；
S2、富集培养：按照土壤细菌分离的步骤，对步骤S1的土壤样品于30℃、160r/min条件下摇床富集培养培养48h；
S3、分离培养：在无菌操作条件下，将步骤S2中摇床富集培养后的培养液涂布于固体分离培养基进行细菌分离培养，于30℃恒温培养5d；用接种环挑取生长良好、特征典型、解磷圈大而显著的单菌落，继续在固体分离培养基平板上划线纯化，获得目标菌株活体纯培养物，并转接于磷细菌斜面培养基4℃保藏；
其中，所述富集培养液包括：葡萄糖6g，海藻糖0.3g，(NH4)SO40.5g，NaCl 9g，KCl 0.3g，MgSO4 7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 4H2O0.03g，CaCO3 5g，(NH4)PO4 0.5g，鸡蛋黄10ml，蒸馏水1000ml，pH7.0；
所述固体分离培养基包括：葡萄糖6g，海藻糖0.3g，(NH4)SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4 7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4 4H2O 0.03g，Ca3(PO4)28g，吉兰糖胶1.5g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml，pH7.0；
所述磷细菌斜面培养基包括：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl9g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.0；
S4、菌株的鉴定：通过步骤S2和S3的富集培养和平板分离培养，获得四株溶磷圈大而显著的菌株，初步判断具有解磷活性，确定为目标菌株，菌株编号为YYF20、YYF21、FYY22和YYF23；
S5、采用钼锑抗比色法对YYF20、YYF21、YYF22和YYF23进行解磷能力的确定，选择出解磷能力最强的菌株YYF22。
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