KR100761339B1 - 엔도설판과 그 독성 대사산물인 엔도설판 설페이트 분해에유용한 슈도모나스 ｋｓ-2ｐ - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 균주인 슈도모나스 KS-2P (Pseudomonas sp. KS-2P) (기탁번호 : KCTC 10874BP) 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 고독성 유기염소계 농약인 엔도설판(Endosulfan)과 그 독성 대사산물인 엔도설판 설페이트의 분해 능력이 우수한 신규한 미생물 슈도모나스 KS-2P(Pseudomonas sp. KS-2P)(기탁번호 : KCTC 10874BP) 및 이의 용도에 관한 것이다.

슈도모나스 KS-2P, 엔도설판, 엔도설판 설페이트, 유기염소계 농약

Description

엔도설판과 그 독성 대사산물인 엔도설판 설페이트 분해에 유용한 슈도모나스 ＫＳ-2Ｐ{Novel strain Pseudomonas sp. KS-2P useful for degradation of endosulfan and toxic endosulfan sulfate}

도 1은 본 발명에 따라 토양으로부터 분리한 엔도설판과 대사산물인 엔도설판 설페이트 분해 미생물, 슈도모나스 KS-2P 동정을 위해 16S rDNA를 서열분석(sequencing)한 결과이다.

도 2는 본 발명에 따라 토양으로부터 분리한 엔도설판과 대사산물인 엔도설판 설페이트 분해 미생물, 슈도모나스 KS-2P의 계통분류학적 위치를 조사한 결과이다.

도 3는 상이한 pH 조건하에서 슈도모나스 KS-2P 균주의 성장 및 엔도설판 설페이트 분해 효율을 보여주는 그래프도이다.

도 4은 상이한 온도조건하에서 슈도모나스 KS-2P 균주의 성장 및 엔도설판 설페이트 분해효율을 보여주는 그래프도이다.

도 5은 배양시간(일)에 따른 슈도모나스 KS-2P 균주의 엔도설판 설페이트 함유-최소배지에서의 성장 및 pH 변화 특성을 보여주는 그래프도이다.

도 6은 최적의 분해조건하에서 슈도모나스 KS-2P 균주에 의한 엔도설판 분해 를 나타낸 그래프도이다.

도 7은 슈도모나스 KS-2P를 엔도설판 오염 토양에 처리하여 토양에서 슈도모나스 KS-2P의 엔도설판 분해 특성의 경향을 보여주는 그래프이다.
도 8a, 도 8b, 도 8c 및 도 8d는, 각각 본 발명의 균주의 세포 지방산 분석(MIDI) 결과도이다.

본 발명은 신규 균주인 슈도모나스 KS-2P(Pseudomonas sp. KS-2P) (기탁번호 : KCTC 10874BP) 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 고독성 유기 염소계 농약인 엔도설판 (Endosulfan)과 그 독성 대사산물인 엔도설판 설페이트(Endosulfan sulfate)의 분해능이 우수한 신규미생물 균주인, 슈도모나스 KS-2P(Pseudomonas sp. KS-2P) (기탁번호 : KCTC 10874BP) 및 이의 용도에 관한 것이다.

현재 농업의 발달로 다양한 유기농약이 사용되고 있는 실정이다. 이러한 다량의 유기농약의 사용으로 현재 여러 지역의 토양과 수계에는 유기물질뿐만 아니라, 여러 종류의 농약이 포함되어 있다. 이러한 여러 종류의 농약들 중에서, 특히 유기염소계 농약은 농작물의 살충제로 많이 사용되고 있는 물질로서, 인삼밭 및 과수토양과 인근 하천 수계에 많은 문제가 되고 있는 유해한 고독성 물질이다. 이러한 여러 종류의 농약은 환경에 존재하고 있다가, 체내로 유입되면 대부분이 환경호르몬으로 작용할 뿐 아니라 체내 독성물질로 나타나며, 구조적 특징으로 인하여 토 양내에서 긴 잔류기간을 보이고 있으며, 자연분해가 어려워 환경오염의 주요 원인물질로 대두되고 있다.

그 동안 국내외에서 미생물을 이용한 생물학적 처리법에 대한 연구가 다양하게 진행되어 온 바 있다 참조: Sutherland 등, Appl. Environ. Microbiol., Vol. 66, No. 7: 2000; Tamora 등, J. Pesticide Sci., 20, 145: 1995 및 Kwon 등, Appl Microbiol Biotechnol. 2005 Jun; 67(6): 845-50. 특정한 유기염소계 농약 및 엔도설판을 분해하는 능력을 지닌 균주를 선발한 후, 당해 균주를 이용하여 유기염소계 농약을 생물학적 방법으로 처리하는 연구도 진행되어 왔었다.

하지만, 현재까지 일부 국한된 유기염소계 농약에 대해서만 제한적 분해 능력을 가진 미생물이 동정 및 사용되어 그 범위가 매우 한정적이었으며, 실제 토양 및 수계에서의 분해효율 및 안정성이 미흡하였기 때문에, 실제 토양과 수계에서도 특정 염소계 농약의 분해 효능이 효과적으로 발휘될 수 있는 미생물의 개발이 요구되고 있다.

고독성으로 알려져있는 유기염소계 농약인 엔도설판(endosulfan)은, 미생물에 의해 중간 대사산물인 엔도설판 설페이트(endosulfan sulfate)와 엔도설판 디올(endosulfan diol)로 분해되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 중간 대사산물 중에서 엔도설판 디올은 무독하지만, 엔도설판 설페이트는 엔도설판(endosulfan)만큼 독성이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 엔도설판을 효과적으로 분해하기 위해서는 엔도설판을 엔도설판 디올로만 분해하는 미생물 또는 엔도설판과 엔도설판 설페이트를 동시에 분해할 수 있는 미생물이 요구되어 지고 있다.

상기한 엔도설판의 미생물 분해에 관련하여, 페널채트 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 마이코박테리움(Mycobacterium sp.)와 클레브시엘라(Klebsielle sp.)를 이용하여 엔도설판을 분해하는 방법[참조: Kullman 등. Appl. Envion. Microbiol, 62. 593:1996 ; Sutherland 등. 93. 380: 2002; Kwon 등. Appl Microbiol Biotechnol. 2005 Jun; 67(6): 845-50] 등과 같이 미생물을 이용하여 실제 현장에 응용하려는 연구가 많이 진행되고 있다. 하지만, 이러한 대사과정을 진행하는 미생물의 종류는 한정적이고 그 대사효율이 매우 낮으므로 토양과 수계에 함유되어 있는 엔도설판과 엔도설판 설페이트와 같은 고독성 유기염소계 농약을 효과적으로 분해하지 못하고 있다.

따라서, 엔도설판을 효과적으로 분해하기 위해서는, 엔도설판의 분해 뿐만 아니라, 유독한 중간 대사산물인 엔도설판 설페이트를 생성하지 않거나, 이를 효과적으로 분해할 수 있는 미생물이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은, 고독성 유기염소계 농약인 엔도설판과 그 독성 대사산물인, 엔도설판 설페이트에 대해 분해능이 우수한 신규의 미생물 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기한 신규 미생물 균주를 이용하여 엔도설판과 엔도설판 설페이트와 같은 유기염소계 농약이 포함된 각종 토양과 수계에 처리방법을 제공하여 오염지를 생물학적으로 복원하는 것이다.

본 발명에서는, 호기성 조건에서 생육이 양호하고 엔도설판과 그 독성 대사산물인, 엔도설판 설페이트의 분해능을 가지는 신규 미생물 균주인, 슈도모나스 KS-2P(Pseudomonas sp. KS-2P) (기탁번호 KCTC 10874BP)가 제공된다.

본 발명에 따라 질산암모늄, 인산 제 2 칼륨, 황산망간, 탄산칼슘을 기본으로 하고 유일한 탄소원으로서 엔도설판 또는 엔도설판 설페이트가 함유된 최소배지로부터 선별함을 특징으로 하는, 슈도모나스 KS-2P(Pseudomonas sp. KS-2P) (기탁번호 KCTC 10874BP) 균주의 분리 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 슈도모나스 KS-2P(Pseudomonas sp. KS-2P) (기탁번호 KCTC 10874BP) 균주를 이용하는 것을 특징으로 하는, 엔도설판 및 엔도설판 설페이트가 함유된 토양 및 수계의 처리방법이 제공된다.

본 발명에서 제공하는 신규한 균주인 슈도모나스 KS-2P는, 호기성 조건하에서 생육이 양호하고 고독성의 유기염소계 농약인 엔도설판과 그 대사산물인, 엔도설판 설페이트에 대한 분해능이 우수한 균주로서, 엔도설판으로 오염된 토양 및 수계의 생물학적 처리에 유용하게 이용할 수 있으며, 엔도설판 및 엔도설판 설페이트와 관련된 환경오염의 처리를 위한 생물제제의 개발 및 다양한 생물학적 환경정화기술(Bioremedation)에 광범위하게 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

특히 본 발명에서 제공하는 슈도모나스 KS-2P 균주는. 엔도설판을 분해할 수 있는 능력을 보유함과 동시에, 엔도설판 분해시 생성되는 유독한 중간 대사산물인, 엔도설판 설페이트도 분해할 수 있는 능력을 함께 보유함으로써, 엔도설판을 효과적으로 처리할 수 있는 신규한 균주이다.

아래의 실시예에서는, 본 발명에 따른 슈도모나스 KS-2P 균주의 동정 및 이의 엔도설판과 유독한 중간 대사산물인 엔도설판 설페이트 분해 능력에 대한 실험결과를 구체적으로 보여준다.

실시예 1: 본 발명의 균주의 분리 및 최종선별

엔도설판의 분해 능력과 생육이 우수한 미생물을 분리하고자 경상북도 풍기군 일대 인삼밭, 및 사과밭 토양 2g을, 엔도설판을 유일한 탄소원으로 첨가한 최소배지에 넣고 일정기간 순응시켰다. 순응된 미생물을 멸균 식염수에 현탁하여 엔도설판이 첨가된 최소배지(질산암모늄 1g, 인산 제1 칼륨 1.7g, 인산 제 2 칼륨 4.3g, 황산철 0.01g, 황산마그네슘 0.2g, 황산망간 0.05g, 탄산칼슘 0.02g)를 증류수 1리터에 녹여 만든 평판 배지에 도말하였다. 도말된 페트리디쉬를 30℃의 인큐베이터에서 7일간 배양하여 평판배지상에서 우수한 성장을 보이는 10여종의 단일군락의 미생물들을 1차 분리하였다.

분리한 미생물들에 대한 엔도설판 분해 능력을 측정하기 위하여, 엔도설판 함유 최소배지(엔도설판 300mg 내지 100mg, 질산암모늄 1g, 인산 제1 칼륨 1.7g, 인산 제 2 칼륨 4.3g, 황산철 0.01g, 황산마그네슘 0.2g, 황산망간 0.05g, 탄산칼슘 0.02g을 1리터에 녹여 만든 액체배지)에 각각 한 백금이씩 접종하고 7일간 배양한 후, 우수한 성장과 엔도설판 분해효율이 가장 높은 종의 미생물을 최종 선택하 였다. 또한 독성 대사산물인, 엔도설판 설페이트에 대해서도 분해 능력을 측정하기 위해서 동일한 방법을 이용하였다.

한편 상기의 최종선별된 미생물을, 각기 조성의 엔도설판 함유 최소배지 10ml씩을 함유한 배양시험관에 한 백금이씩 접종한 후 진탕회전 배양기에서 30℃로 7일간 배양하고 그 배양액을 원심분리기에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 미생물을 일부는 다음의 계속적인 실험에 사용하였으며 일부는 글리세롤 스탁(glycerol stock) 및 동결건조하여 보관하였다.

본 발명자들에 의해 최초로 분리된 상기 균주는, 슈도모나스 KS-2P (Pseudomonas sp. KS-2P)로 명명하고, 2005년 11월 25일자로 한국생명공학연구원 소재의 유전자 은행에 기탁되어 기탁번호 KCTC 10874BP로 보관되어 있다

한편 슈도모나스 KS-2P는 그람염색(Gram staining)한 결과 양성을 보인 간균이며, 16s rDNA 서열분석을 통해서 부분 염기서열을 분석한 결과는 도 1에 기재되어 있다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 균주의 16S rDNA 서열 (서열 2)과 균주 슈도모나스 몬테일(Pseudomonas monteilii)(AF 064458)의 16S rDNA의 서열 (서열 1)을 비교한 결과, 서열상동성이 100%로 나타났다.
이와 관련하여, 도 8a, 도 8b, 도 8c 및 도 8d에서는, 가스 크로마토그래피로 본 발명의 균주의 세포 지방산을 분리한 후, MIDI 시스템으로 지방산 분석을 수행한 결과를 보여준다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 균주는 슈도모나스 몬테일에 계통분류학적으로 위치하는 것으로 조사되어 슈도모나스 KS-2P으로 명명하였다.

실시예 2: 본 발명의 균주의 상이한 pH 및 온도 조건하에서의 성장 및 엔도 설판 설페이트 분해 효율

본 발명자들에 의해 분리된 상기 균주, 슈도모나스 KS-2P(Pseudomonas sp. KS-2P)를 멸균 증류수에 현탁한 후, 각각 pH를 5.0 내지 9.0으로 달리한 최소배지에 엔도설판 설페이트를 25ppm정도 첨가하고 각 미생물을 2%(v/v)씩 접종하여 30℃의 진탕회전 배양기에서 균주의 성장과 엔도설판 분해효율을 비교하였고, 조사되어진 최적의 분해 pH의 최소배지에서 진탕회전 배양기의 배양온도를 20 내지 40℃로 변화를 주어 균주의 성장과 엔도설판 설페이트의 분해효율을 조사하였다. 그 결과는, 상이한 각각의 pH 조건하에서 본 발명의 균주가 모두 성장하였고 엔도설판 설페이트를 분해하였으나, pH7 에서 균주의 성장 및 엔도설판 설페이트의 분해효율이 가장 높았다(참조: 도 3).

상기 조사되어진 최적의 분해 pH (즉, pH7)의 최소배지에서 진탕회전 배양기의 배양온도를 20℃부터 40℃로 변화를 주어 균주의 성장과 엔도설판 설페이트의 분해효율을 조사하였다. 그 결과, 상이한 온도 조건하에서 본 발명의 균주는 모두 성장하였고, 엔도설판 설페이트를 분해하였으나, 30℃에서 성장 및 엔도설판 설페이트의 분해효율이 가장 좋았다(참조: 도 4).

엔도설판 분해 균주, 슈도모나스 KS-2P는 각각의 온도와 pH 조건하에서 모두 엔도설판 설페이트를 분해하였고, 미생물의 성장이 일어났지만, 최적의 분해 pH 및 온도는 pH 7.0 및 30℃임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 본 발명의 균주의 성장 및 엔도설판 설페이트의 분해특성

본 발명은 슈도모나스 KS-2P에 의한 엔도설판의 분해경향을 조사하기 위하여, 본 발명의 균주를 엔도설판 분해 최적조건인 액체배지 pH 7.0 및 배양기 온도 30℃의 조건하에서 배양하면서 7일간 본 발명의 균주의 성장을 조사하였으며, 배양액을 추출 및 농축하여 엔도설판 설페이트 및 중간 대사산물의 양을 HPLC 및 TLC로 분석하였다.

대조구로 사용할 죽은 미생물은, 본 발명의 슈도모나스 KS-2P를 오토크레이브(Autoclave)에 넣은 후 121℃에서 20분 동안 감압 멸균하여 수득하였다.

그 결과는 도 5에 나타나 있는 바와 같이, 엔도설판을 유일한 탄소원으로 액체최소배지에 첨가하였을 때, 시간이 지남에 따라 본 발명의 균주 성장이 빠르게 일어났으며, 이와 동시에, 초기의 pH에 비해서 배양을 하면서 pH의 변화를 볼 때, 슈도모나스 KS-2P는 엔도설판 설페이트를 탄소원 및 에너지원으로 이용한다는 것을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타나 있듯이, 죽은 미생물을 첨가한 대조구에 비해서 비교구인 활성을 유지하고 있는 슈도모나스 KS-2P 미생물을 첨가하였을 때, 엔도설판 설페이트가 분해되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 지금까지 엔도설판 분해시 문제시되었던 유독한 중간 대사산물인, 엔도설판 설페이트도 분해가 되는 것으로 조사되었다. 따라서, 본 발명에 의해 발견된 슈도모나스 KS-2P는 엔도설판 설페이트를 효과적으로 분해하여 무독화 한다는 것을 확인하였다.

실시예 4: 본 발명의 균주의 성장 및 엔도설판의 분해특성 확인

본 발명은 슈도모나스 KS-2P에 의한 엔도설판의 분해경향을 조사하기 위하여, 본 발명의 균주를 엔도설판 설페이트 분해 최적조건인 액체배지 pH 7.0 및 배양기 온도 30℃의 조건하에서 배양하면서 7일간 본 발명의 균주의 성장을 조사하였으며, 배양액을 추출 및 농축하여 엔도설판의 양을 HPLC 및 TLC로 분석하였다.

그 결과는 도 6에 나타나 있는 바와 같이, 엔도설판을 유일한 탄소원으로 액체최소배지에 첨가하였을 때, 슈도모나스 KS-2P는 엔도설판을 탄소원 및 에너지원으로 이용한다는 것을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타나 있듯이, 대조구 경우 죽은 KS-2P를 첨가한 경우인데, 실험구에 비해 분해율이 낮은 것으로 조사되었다. 죽은 미생물을 첨가한 대조구에 비해서 비교구인 활성을 유지하고 있는 슈도모나스 KS-2P 미생물을 첨가하였을 때, 엔도설판이 분해되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 지금까지 엔도설판 분해시 문제시되었던 유독한 중간 대사산물인 엔도설판 설페이트가 분해되는 것으로 조사되었다. 따라서, 본 발명에 의해 발견된 슈도모나스 KS-2P는 엔도설판과 엔도설판 설페이트를 효과적으로 분해하여 무독화 한다는 것을 확인하였다.

실시예 4: 본 발명의 균주의 오염지 토양에서 엔도설판의 분해특성 확인

본 발명은 슈도모나스 KS-2P에 의한 토양내에서 엔도설판 분해경향을 조사하기 위하여, 본 발명의 균주를 엔도설판 분해 최적조건인 액체배지 pH 7.0 및 배양기 온도 30℃의 조건하에서 엔도설판 오염지 토양에 배양하면서 본 발명의 균주에 의한 엔도설판 분해특성을 조사하였으며, 토양을 추출 및 농축하여 엔도설판 및 중 간 대사산물의 양을 HPLC 및 TLC로 분석하였다. 대조구는 KS-2P를 접종하지 않은 경우이다.

그 결과는 도 7에 나타나 있는 바와 같이, 오염지 토양의 엔도설판이 시간이 지남에 따라 토양내에서 엔도설판의 분해가 일어나는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 독성대사산물인 엔도설판 설페이트가 다량 생성되었다. 하지만, 슈도모나스 KS-2P를 첨가한 토양에서는 엔도설판과 엔도설판 설페이트의 양이 감소되어 토양내에서 탄소원 및 에너지원으로 이용한다는 것을 확인하였다.

또한, 도 7에 나타나 있듯이, 대조구인 KS-2P를 접종한 토양에 비해서 비교구인 활성을 유지하고 있는 슈도모나스 KS-2P 미생물을 첨가하였을 때, 엔도설판과 함께 엔도설판 설페이트가 분해되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 지금까지 엔도설판 분해시 문제시되었던 유독한 중간 대사산물인 엔도설판 설페이트에 대해 분해가 되는 것으로 조사되었다. 따라서, 본 발명에 의한 발견된 슈도모나스 KS-2P는 토양내에서도 엔도설판과 엔도설판 설페이트를 효과적으로 분해하여 무독화 한다는 것을 확인하였다.

인삼밭, 채소밭 및 사과밭에서 분리/선별된, 엔도설판의 분해가 우수한 본 발명의 슈도모나스 KS-2P 미생물은 실제 오염된 토양 및 수계에 이용이 가능하며, 환경처리제의 개발 및 다양한 생물학적 환경정화기술(Bioremediation)에 광범위하게 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

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Claims (4)

1. 호기성 조건에서 생육이 양호하고 엔도설판과 그 독성 대사산물인 엔도설판 설페이트의 분해능이 개선된 미생물 슈도모나스 KS-2P(Pseudomonas sp. KS-2P) (기탁번호 KCTC 10874BP).
2. 인산 제1 칼륨 1.7g, 인산 제2 칼륨 4.3g, 질산암모늄 1g, 황산마그네슘 0.2g, 황산망간 0.05g, 황산철 0.01g, 탄산칼슘 0.02g을 기본으로 하고 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 엔도설판과 엔도설판 설페이트를 함유하는 최소배지로부터 선별함을 특징으로 하는, 제1항에 따른 미생물 슈도모나스 KS-2P (Pseudomonas sp. KS-2P)의 분리 방법.
3. 삭제
4. 제1항에 따른 미생물을 사용하여 엔도설판이 100ppm까지 함유된 토양 및 수계를 처리하는 것을 특징으로 하는, 엔도설판과 엔도설판 설페이트가 함유된 토양 및 수계의 처리방법.

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