KR100549404B1 - 엔도설판의 분해에 유용한 클레브시엘라 옥시토카 ｋｅ-8균주 - Google Patents

엔도설판의 분해에 유용한 클레브시엘라 옥시토카 ｋｅ-8균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 신규한 균주인 클레브시엘라 옥시토카 KE-8(Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 고독성 유기염소계 농약인 엔도설판(endosulfan) 및/또는 엔도설판 설페이트의 분해능을 가진 신규한 미생물 균주인 클레브시엘라 옥시토카 KE-8(Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 및 이의 용도에 관한 것이다.
클레브시엘라 옥시토카 KE-8, 엔도설판, 엔도설판 설페이트, 유기염소계 농약

Description

엔도설판의 분해에 유용한 클레브시엘라 옥시토카 ＫＥ-8 균주 {Novel strain Klebsiella oxytoca KE-8 useful for decomposing endosulfan}
도 1은 본 발명에서 동정된 신규한 균주인 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 (Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP)의 16S rDNA 서열분석 결과이다. 본 발명의 균주의 16S rDNA 서열 (Seq 2)과 비교하기 위한 대조 서열(Seq 1)은, 균주 클레브시엘라 뉴모니아에 KE-1 (Klebsiella pneumoniae KE-1) (ATCC 13883T)의 16S rDNA 서열이다.
도 2는 상이한 pH 조건하에서 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 균주의 성장 및 엔도설판의 분해 효율(%)을 보여주는 그래프도이다.
도 3는 상이한 온도 조건하에서 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 균주의 성장 및 엔도설판 분해 효율(%)을 보여주는 그래프도이다.
도 4는 배양시간(일)에 따른 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 균주의 엔도설판 함유-최소배지에서의 성장 및 pH 변화 특성을 보여주는 그래프도이다.
도 5는 최적의 엔도설판 분해 조건하에서 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 균주에 의한 엔도설판의 분해 및 이로 인해 생성되는 대사산물의 경향을 나타낸 그래프도이다.
본 발명은, 신규한 균주인 클레브시엘라 옥시토카 KE-8(Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 고독성 유기염소계 농약인 엔도설판(endosulfan)의 분해 능력이 우수한 신규한 미생물 균주인 클레브시엘라 옥시토카 KE-8(Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 및 이의 용도에 관한 것이다.
현재 여러 지역의 토양과 수계에는 유기물질 뿐만 아니라, 여러 종류의 농약들이 포함되어 있다. 이러한 여러 종류의 농약들 중에서, 특히 유기염소계 농약은 농작물의 살충제로서 많이 사용되는 물질로서, 인삼밭 및 과수 토양과 인근 하천에서 많이 문제가 되고 있는 유해한 고독성 물질이다. 이러한 유기염소계 농약은, 대부분 환경 호르몬으로서 생체 내에 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 구조적 특징으로 인하여 토양 내에서 긴 잔류기간을 보이고 있으며 자연분해가 어려워 환경오염의 주요 원인물질로 대두되고 있다.
그 동안 국내외에서 미생물을 이용한 생물학적 처리법에 대한 연구가 다양하게 진행되어 왔으며 {참조: Sutherland 등, Appl. Environ. Microbiol., Vol. 66, No. 7: 2000; 및 Tamora 등, J. Pesticide Sci., 20, 145:1995}; 특정한 유기염소계 농약을 분해하는 능력을 지닌 균주를 선별한 후, 이를 이용하여 피씨엔비 (PCNB)를 분해시키는 방법 {참조: Mora Torres 등, Chemosphere 33. 683:1996} 등 과 같이 미생물을 이용하여 유기염소계 농약을 생물학적 방법으로 처리하려는 연구도 진행되어 왔었다.
하지만, 현재까지 일부 국한된 유기염소계 농약에 대해서만 제한적 분해 능력을 가진 미생물이 동정 및 사용되어 그 범위가 매우 한정적이었으며, 실제 토양 및 수계에서의 분해효율 및 안정성이 미흡하였기 때문에, 실제 토양과 수계에서도 특정 유기염소계 농약의 분해 효능이 효과적으로 발휘될 수 있는 미생물의 개발이 요구되고 있다.
고독성으로 알려져 있는 유기염소계 농약인 엔도설판(endosulfan)은, 미생물에 의해 중간대사산물인 엔도설판 설페이트 (endosulfan sulfate)와 엔도설판 디올(endosulfan diol)로 분해되는 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로는, 엔도설판(endosulfan)은 2가지 반응인 산화반응과 가수분해반응을 통해서 분해가 각각 이루어진다. 우선, 산화반응을 통해서는, 엔도설판 설페이트로 분해가 이루어진다. 하지만, 가수분해반응을 통해서는, 엔도설판 디올로 분해가 이루어진 후, 엔도설판 에테르(endosulfan ether)로 분해되고나서, 최종적으로 엔도설판 락톤(endosulfan lactone)으로 분해된다.
상기한 엔도설판의 미생물 분해와 관련하여, 가수분해반응을 통해 생성되는 중간대사산물 (특히, 엔도설판 디올)은 무독성이지만, 산화반응을 통해 생성되는 엔도설판 설페이트는 엔도설판 만큼 독성이 큰 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여, 페네로채트 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 마이코박테리움(Mycobacterium sp.) 등과 같이 기존에 알려져 있는 엔도설판-분해 미생물{참조: Kullman 등, Appl.Environ.Microbiol.62.593:1996; 및 Sutherland 등, Appl.Environ.Microbiol.93.380:2002}은, 상기한 2가지 반응 모두를 통해서 엔도설판을 분해하였기 때문에 유독한 엔도설판 설페이트를 생성하는 문제점을 야기한다.
따라서, 엔도설판(endosulfan)을 효과적으로 분해하기 위해서는, 엔도설판의 분해뿐만 아니라, 유독한 중간대사산물인 엔도설판 설페이트를 생성하지 않거나, 엔도설판 설페이트가 생성되지만 이를 효과적으로 분해할 수 있는 능력을 가진 미생물이 요구되어 지고 있다.
본 발명의 목적은, 고독성 유기염소계 농약으로 알려진 엔도설판 (endosulfan)에 대한 분해 능력이 우수한 신규의 미생물 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기한 신규 미생물 균주를 이용하여 엔도설판으로 오염된 토양 및 수계를 처리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는, 호기성 조건에서 생육이 양호하고 엔도설판 및/또는 엔도설판 설페이트의 분해능을 가진 신규한 미생물 균주인 클레브시엘라 옥시토카 KE-8(Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호 KCTC 10551BP)이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서는, 질산암모늄 1g, 인산 제2칼륨 1g, 황산망간 0.5g, 탄산칼슘 0.2g을 기본으로 하고 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 엔도설판을 함유하는 최소배지로부터 선별되는 것을 특징으로 하는, 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 (Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 균주의 분리방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 (Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 균주를 이용하는 것을 특징으로 하는, 엔도설판 및/또는 엔도설판 설페이트가 함유된 토양 및 수계의 처리방법이 제공된다.
본 발명에서 제공하는 신규한 균주인 클레브시엘라 옥시토카 KE-8은, 호기성 조건하에서 생육이 양호하고 고독성의 유기염소계 농약인 엔도설판에 대한 분해능이 우수한 균주로서, 엔도설판으로 오염된 토양 및 수계의 생물학적 처리에 유용하게 이용할 수 있으며, 엔도설판과 관련된 환경오염처리를 위한 생물제제의 개발 및 다양한 생물학적 환경정화기술(Bioremediation)에 광범위하게 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
특히, 본 발명에서 제공하는 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 균주는, 엔도설판을 분해할 수 있는 능력을 보유함과 동시에, 엔도설판의 분해시에 생성되는 유독한 중간대사산물인 엔도설판 설페이트도 분해할 수 있는 능력을 함께 보유함으로써, 엔도설판을 효과적으로 처리할 수 있는 신규한 균주이다.
아래의 실시예에서는, 본 발명에 따른 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 균주의 동정, 및 이의 엔도설판 분해능력에 대한 실험결과를 구체적으로 보여준다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 균주의 동정 및 특성
엔도설판의 분해 능력과 생육이 우수한 미생물을 분리하고자 경상북도 풍기군과 고령군 일대의 인삼밭 및 사과밭 토양 2g을 엔도설판을 유일한 탄소원으로 첨가한 최소배지에 넣고 일정기간 순응시켰다. 순응된 미생물을 멸균 식염수에 현탁한 후, 엔도설판이 첨가된 최소배지(질산암모늄 1g, 인산 제2칼륨 1g, 황산망간 0.5g, 탄산칼슘 0.2g)를 증류수 1리터에 녹여 만든 평판 배지에 도말하였다. 도말된 페트리디쉬(petri-dish)를 30℃의 인큐베이터에서 7일간 배양한 후, 평판배지 상에서 우수한 성장을 보이는 10여종의 단일군락의 미생물들을 1차 분리하였다.
분리한 미생물들에 대한 엔도설판 분해 능력을 측정하기 위하여, 엔도설판-함유 최소배지(엔도설판 300mg 내지 100mg, 질산암모늄 1g, 인산 제2칼륨 1g, 황산망간 0.5g, 탄산칼슘 0.2g를 1리터에 녹여 만든 액체배지)에 각각 한 백금이씩 접종한 후 7일간 배양한 후, 우수한 성장과 엔도설판 분해효율이 가장 높은 미생물을 최종 선택하였다.
상기의 최종 선별된 미생물을 상기 조성의 엔도설판-함유 최소배지 10㎖씩 함유한 배양 시험관에 한 백금이씩 접종한 후, 진탕회전 배양기에서 30℃로 7일간 배양하고 그 배양액을 원심 분리기에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 미생물 중 일부는 다음의 계속적인 실험에 사용하였으며 일부는 글리세롤 스톡(glycerol stock)에 보관하였다.
본 발명자들에 의해 최초로 분리된 상기 균주는, 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 (Klebsiella oxytoca KE-8)로 명명하고, 2003년 11월 17일자로 한국생명공학연구 원 소재의 유전자은행에 기탁되어 기탁번호 KCTC 10551BP로 보관되어 있다.
한편, 클레브시엘라 옥시토카 KE-8은 그람 염색(Gram staining)한 결과 음성반응을 보인 간균이며, 16S rDNA 서열분석을 통해서 부분 염기서열을 분석한 결과는 도 1에 기재되어 있다.
도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 균주의 16S rDNA 서열 (Seq 2)과 균주 클레브시엘라 뉴모니아에 KE-1 (Klebsiella pneumoniae KE-1) (ATCC 13883T)의 16S rDNA 서열(Seq 1)의 비교 결과, 서열 상동성은 약 98.5%로 나타났다. 참고로, 상기한 균주 클레브시엘라 뉴모니아에 KE-1 (Klebsiella pneumoniae KE-1) (ATCC 13883T)는, 엔도설판을 분해하지만 엔도설판 설페이트는 생성하지 않는 미생물 균주이다 {참조: Kwon 등, "Klebsiella pneumoniae KE-1 degrades endosulfan without formation of the toxic metabolite, endosulfan sulfate", FEMS Microbiol. Lett. 215, 255-259, 2002}.
실시예 2: 본 발명의 균주의 상이한 pH 및 온도 조건하에서의 성장 및 엔도설판 분해효율
본 발명자들에 의해 분리된 상기 균주 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 (Klebsiella oxytoca KE-8)를 멸균 증류수에 현탁한 후, pH를 5.0 내지 9.0으로 달리한 각각의 최소배지에 엔도설판을 약 100ppm씩 첨가하고 본 발명의 미생물 균주를 2%(v/v)씩 접종하였다. 그리고나서, 30℃의 진탕회전 배양기에서 균주의 성장 과 엔도설판 분해효율을 조사하였다. 그 결과, 상이한 각각의 pH 조건하에서 본 발명의 균주는 모두 성장하였고 엔도설판을 분해하였으나, pH 7에서 균주의 성장 및 엔도설판 분해효율이 가장 높았다 {참조: 도 2}.
상기 조사되어진 최적의 분해 pH (즉, pH 7) 최소배지에 진탕회전 배양기의 배양온도를 20℃ 내지 40℃로 변화를 주어 균주의 성장과 엔도설판의 분해효율을 조사하였다. 그 결과, 상이한 각각의 온도 조건하에서 본 발명의 균주는 모두 성장하였고 엔도설판을 분해하였으나, 30℃에서 성장 및 엔도설판 분해효율이 가장 높았다 {참조: 도 3}.
실시예 3: 본 발명의 균주의 성장 및 엔도설판 분해 특성
본 발명의 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 균주에 의한 엔도설판 분해경향을 조사하기 위하여, 본 발명의 균주를 엔도설판 분해최적조건인 액체배지 pH 7.0 및 배양기 온도 30℃의 조건하에서 배양하면서 6일간 본 발명의 균주의 성장을 조사하였으며, 배양액을 추출 및 농축하여 엔도설판 및 엔도설판 중간대사산물의 양을 GC-ECD로 분석하였다.
대조구로 사용할 죽은 미생물은, 본 발명의 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 균주를 오토클레이브(Autoclave)에 넣은 후 121℃에서 20분 동안 감압 멸균하여 수득하였다.
그 결과, 도 4에 나타나 있는 바와 같이, 엔도설판을 유일한 탄소원으로 하는 액체 최소배지에 첨가하였을 때, 시간이 지남에 따라 본 발명의 균주의 성장이 빠르게 일어났다. 이와 동시에, 초기의 pH에 비해서 배양을 하면서 pH가 급격히 감소하는 것을 확인하였는 데, 이는 본 발명의 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 균주가 엔도설판을 탄소원 및 에너지원으로 이용한다는 것을 알 수 있다.
또한, 도 5에 나타나 있는 바와 같이, 죽은 미생물을 첨가한 대조구(도시되지 않음)에 비해서 비교구인 활성을 유지하고 있는 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 미생물을 첨가하였을 때, 엔도설판 (-◆-)의 분해속도가 빨라짐을 확인하였으며, 유독한 중간대사산물인 엔도설판 설페이트 (-×-) 및 무독한 중간대사산물인 엔도설판 디올 (-■-) 모두가 검출되었다. 하지만, 유독한 엔도설판 설페이트의 경우, 배양시간이 2일을 경과함에 따라 빠르게 분해되어 배양 6일째가 되면 모두 분해됨을 알 수 있다.따라서, 본 발명에 따른 클레브시에라 옥시토카 KE-8 균주는, 엔도설판 뿐만 아니라 유독한 중간대사산물인 엔도설판 설페이트까지 효과적으로 분해한다는 것을 확인하였다.

Claims (3)

  1. 엔도설판, 엔도설판 설페이트, 또는 엔도설판 및 엔도설판 설페이트의 분해능을 가진 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 (Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 균주.
  2. 질산암모늄 1g, 인산 제2칼륨 1g, 황산망간 0.5g, 탄산칼슘 0.2g을 기본으로 하고 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 엔도설판을 함유하는 최소배지로부터 선별되는 것을 특징으로 하는,
    클레브시엘라 옥시토카 KE-8 (Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 균주의 분리방법.
  3. 클레브시엘라 옥시토카 KE-8 (Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 균주를 이용하는 것을 특징으로 하는,
    엔도설판, 엔도설판 설페이트, 또는 엔도설판 및 엔도설판 설페이트가 함유된 토양 및 수계의 처리방법.
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