WO2023286593A1 - 芳香族ポリエステル分解菌 - Google Patents

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憲二 宮本
祐希 河合
正和 角山
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Definitions

  • the present inventor has conducted extensive research on methods of treating waste liquid containing aromatic polyesters such as polyethylene terephthalate (PET) or decomposition products thereof, such as BHET discharged in the recycling process of PET.
  • PET polyethylene terephthalate
  • the present inventors have found a microorganism capable of rapidly degrading BHET from soil, and have found that the microorganism can efficiently degrade BHET.
  • FIG. 2 shows the results of phylogenetic estimation based on the 16S rDNA nucleotide sequence of strain 2a.
  • FIG. 2 shows the result of 16S rDNA partial base sequence comparison between strain 2a and Delftia lacustris.
  • Fig. 2a shows the result of comparison of the 16S rDNA partial base sequences of the 2a strain and Delftia lacustris (continued from Fig. 2-1). It is a figure which shows the colony image of 2a strain.
  • FIG. 2A is a diagram showing a Gram-stained image of the 2a strain.
  • FIG. 2 shows the results of biochemical properties of the 2a strain (first stage bacterial test).
  • % representing concentration indicates wt%.
  • polyester refers to a polymeric substance having an ester bond in its main chain.
  • aromatic polyester decomposed by microorganisms of the present invention refers to a polyester containing an aromatic component as a repeating unit.
  • the content of the repeating unit is, for example, 50 to 100% by weight, preferably 70 to 100% by weight, more preferably 90 to 100% by weight, still more preferably 95 to 100% by weight, relative to the entire compound.
  • aromatic polyesters include polyethylene terephthalate (PET), and further PET containing 95% by weight or more of ethylene terephthalate repeating units.
  • the microorganism which is the aromatic polyester-degrading bacterium of the present invention, is a decomposition intermediate product when polyethylene terephthalate (PET) is chemically decomposed and chemically recycled, and bis (2-hydroxyethyl) terephthalate is discharged into the waste liquid. (BHET) degrading bacteria.
  • PET polyethylene terephthalate
  • BHET bis (2-hydroxyethyl) terephthalate
  • PET may generate wastewater during its manufacturing and recycling processes, and this contains high-concentration PET decomposition products.
  • the microorganisms of the invention are capable of degrading these PET degradation products.
  • PET is chemically decomposed into BHET, which is a monomer, and then purified and repolymerized to make PET.
  • Methods for chemically decomposing PET include the methanolysis method, the glycolysis method, and the hydrolysis method. In these recycling methods, BHET is discharged into the waste liquid waste.
  • Microorganisms capable of degrading aromatic polyesters such as BHET or degradation products thereof of the present invention include strains 2a, 7a (31076-02-B1) and 8d. These three strains of microorganisms were isolated from soil.
  • 2a strain is Delftia lacustris strain
  • 7a (31076-02-B1) strain is Pseudoarthrobacter belonging to the genus Pseudarthrobacter
  • the Pseudarthrobacter sp. strain 8d was identified as a Pseudomonas sp. strain belonging to the genus Pseudomonas.
  • Strain 2a Delftia lacustris
  • the nucleotide sequence of 16S rDNA is shown in SEQ ID NO:1.
  • the highest homology rate is 99.9% when compared with the base sequence of known 16S rDNA (16S rRNA gene).
  • Figure 1 shows the results of phylogenetic inference based on the 16S rDNA nucleotide sequence.
  • FIG. 7a (31076-02-B1) strain: Pseudarthrobacter sp.
  • the base sequence of 16S rDNA is shown in SEQ ID NO:2.
  • the highest homology rate is 99.4% when compared with the known base sequence of 16S rDNA.
  • Figure 2 shows the results of phylogenetic inference based on the 16S rDNA nucleotide sequence.
  • FIG. 8d Strain Pseudomonas sp.
  • the nucleotide sequence of 16S rDNA is shown in SEQ ID NO:3.
  • the highest homology rate is 99.7% when compared with the known base sequence of 16S rDNA.
  • FIG. 3 shows the result of phylogenetic estimation based on the nucleotide sequence of 16S rDNA.
  • the 8d strain was approved on June 17, 2021 at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depository (NITE Patent Microorganisms Depository) (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). ) under accession number NITE P-03485 (“identification mark” is “31076-03”). After that, it was transferred to an international deposit (Date of request for transfer to international deposit: May 27, 2022, Accession number: NITE BP-03485).
  • the culture period is not limited, for example, 1 day or more, preferably 2 days or more, more preferably 5 days or more, still more preferably 10 days or more, and for example 5 months or less, preferably 2 months or less, more preferably 1 month or less.
  • the present invention includes methods for degrading BHET by using the above microorganisms alone or in combination.
  • BHET degradation when using the above microorganisms for BHET decomposition can be calculated by mixing BHET with the above microorganisms and measuring the OD600 of BHET in the treated solution. It can also be examined by detecting BHET by thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), or the like.
  • TLC thin layer chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Decomposition of the aromatic polyester such as BHET or its decomposition products by the above microorganisms can be carried out by bringing the aromatic polyester such as BHET or its decomposition products into contact with the above microorganisms.
  • contacting means mixing an aromatic polyester such as BHET or its decomposition product with a microorganism, allowing the microorganism to act on the aromatic polyester such as BHET or its decomposition product, and It refers to causing a decomposition reaction of a product.
  • the density of the microorganisms to be acted upon during the decomposition reaction can be appropriately set according to the amount of the aromatic polyester such as BHET to be decomposed or its decomposition products.
  • the reaction temperature is 20-40°C, preferably 25-35°C, more preferably 30°C.
  • the pH during the reaction is around pH 7.0, preferably 5.0 to 9.0, more preferably 6.0 to 8.0, particularly preferably 6.5 to 7.5.
  • the reaction time can be appropriately set depending on the amount of the aromatic polyester such as BHET to be decomposed or the decomposition products thereof. Reaction times range from hours to months. For long-term treatment, the above microorganisms may be added periodically.
  • activated sludge is usually used to treat waste.
  • activated sludge is a general term for "living" floating organic sludge containing aerobic microorganisms cultivated and nurtured artificially or by engineering. Widely used in human waste treatment plants, septic tanks, etc.
  • aromatic polyesters such as BHET and their decomposition products cannot be decomposed. group polyester or its decomposition products remain.
  • Bacteria were isolated from the culture medium containing the cultured cells by the plate dilution method. The culture solution was diluted 10 3 to 10 9 times with physiological saline, 0.2% BHET/MS (+) agar medium (Table 2), and 0.2% BHET/MS (+1/ 10) It was plated on an agar medium (Table 3) and plated at 30°C.
  • Fig. 1 shows the results of phylogenetic inference based on the nucleotide sequence of 16S rDNA.
  • the upper left line is the scale bar
  • the number at the branch of the phylogenetic branch is the bootstrap value
  • the T at the end of the strain name is the type strain of that species
  • the BSL is the biosafety level (BSL1*( opportunistic pathogens) above).
  • the nucleotide sequence of 16s rDNA is shown in SEQ ID NO:1.
  • the 2a strain was a motile Gram-negative bacillus, did not oxidize glucose, and was positive for both catalase and oxidase reactions ( Figures 3, 4 and 5). These properties were consistent with those of the genus Delftia.
  • the specimen reduced nitrate, assimilated D-mannitol, potassium gluconate, and n-capric acid, but did not assimilate glucose and maltose (Fig. 6). Further, as a result of additional tests, the specimen grew in 5% NaCl, hydrolyzed casein, and exhibited lipase activity (Tween 80) (Fig. 7).
  • FIG. 7 shows the results of each enzymatic reaction performed using API ZYM. In addition, these properties were found to have many similarities with those of D. lacustris, but some differences were also observed. In particular, it did not assimilate L-arabinose and N-acetyl-D-glucosamine, and did not show ⁇ -glucosidase and ⁇ -glucuronidase activities, unlike D. lacustris.
  • the 16S rDNA partial nucleotide sequence of SIID31076-02-B1 has a homology rate to Pseudarthrobacter equi IMMIB L-1606T (FN673551) 99.4% homology, 99.1% homology to P. defluvii 4C1-aT (AM409361), and 99.0% homology to P. chlorophenolicus A6T (AF102267).
  • the degradation rate of BHET in 2a was slower than that in 7a and 8d, but BHET, MHET and TPA almost disappeared after 72 hours. 7a completely degraded BHET in 24 hours and MHET in 96 hours. 8d completely degraded BHET, MHET and TPA in 24 hours.
  • BHET has a molecular weight of 254, so 1 mM BHET is 254 mg/L BHET or 0.0254% BHET, and 8 mM BHET is 2032 mg/L BHET or 0.2032% BHET.
  • BHET of 8mM or more does not dissolve even at 70°C, filter sterilization cannot be performed.
  • the same preparation method as for BHET/MS(+)FT medium cannot be used. Therefore, although BHET was slightly decomposed into MHET, the medium was prepared by the following method. BHET pellets were added to water to 16mM, 24mM and 32mM and completely dissolved by autoclave sterilization. Before precipitation of BHET in the aqueous solution, an equal amount was mixed with 2 ⁇ MS(+) that had also been autoclave sterilized, stirred, and then immediately dispensed into culture test tubes.
  • Example 2 Decomposition of BHET in waste obtained in a PET recycling process using activated sludge containing BHET-degrading bacteria1. Purpose The objective was to confirm the improvement of BHET decomposition ability when BHET-degrading bacteria isolated at Keio University were added to the activated sludge of the wastewater treatment facility of the Japan Environmental Design Co., Ltd. factory.
  • BHET degradation rate was improved in all BHET-degrading bacteria 2a, 7a, and 8d compared to the activated sludge-only control. Among them, the BHET degradation rate of 8d was fast, and BHET, MHET, and TPA almost disappeared after 5 days.
  • Example 3 Decomposition of BHET in waste obtained in the PET recycling process using a BHET-degrading bacterium immobilizing carrier1. Purpose The purpose of this study was to confirm the BHET-degrading ability of BHET-degrading bacteria isolated at Keio University and immobilized on a commercially available bacteria-fixing carrier.
  • Results A 100 ⁇ l sample was taken immediately after preparation of the culture solution of the bacteria-immobilized carrier to which the BHET-degrading bacteria were immobilized and one day after the start of the culture, and the amount of BHET decomposed was examined by HPLC.
  • microorganisms of the present invention it is possible to efficiently recycle polyethylene terephthalate.

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Abstract

芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解し得る微生物および該微生物を用いた芳香族ポリエステルまたはその分解産物の分解法の提供。　芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する以下の3株の微生物のいずれかの微生物： No.2a株（受託番号NITE　BP-03483）、 No.7a株（受託番号NITE　BP-03484）、又は No.8d株（受託番号NITE　BP-03485）。

Description

芳香族ポリエステル分解菌
　本発明は、ポリエチレンテレフタレート（PET）等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物含有廃液を微生物を用いて迅速に分解する技術に関するものである。
　環境問題への意識が高まるなか、世界中で工場廃水に関する基準が厳しくなりつつある。新たな工場建設においては廃水処理が基準値をクリアできることのエビデンスを提示しなければならないなど、今や製造プロセスの一部としても重要な技術の１つとして位置づけられる。飲料ボトルやポリエステル繊維に使われるポリエチレンテレフタレート（PET）は、その製造工程やリサイクルの工程において廃水が発生することがあり、ここに高濃度のPET分解産物が含まれることにより、既存の活性汚泥では十分な分解が困難であった。今回見出した芳香族ポリエステル結合化合物分解微生物と活性汚泥を組み合わせることで、この課題を解消することが可能となる。
　例えば、PETのケミカルリサイクル工程において排出されるBHET含有廃液は、既存の活性汚泥では分解することが困難であった。このような場合、廃水を費用を払って外部に処理委託したり、操業を調整するなど、工場運営コストに与える影響が非常に大きくなる。
　BHETを分解する微生物としてEnterobacter sp.を単離したことが報告されていたが、2000 mg/L(約8 mM)のBHETを120時間でも30％程度しか分解できなかった（非特許文献１）。
Lequan Qiu et al., J Basic Microbiol. 2020;60:699-711
　本発明は、BHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解し得る微生物および該微生物を用いたBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物の分解法の提供を目的とする。
　本発明者は、ポリエチレンテレフタレート（PET）等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物含有、例えば、PETのリサイクル工程で排出されるBHET廃液の処理方法について鋭意検討を行った。本発明者は、土壌よりBHETを迅速に分解可能な微生物を見いだし、該微生物が効率的にBHETを分解することができることを見出した。これらの微生物を単体で、又はこれらの微生物と活性汚泥を組み合わせることで、従来は分解処理が困難であったBHET廃液の迅速な処理が可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する以下の3株の微生物のいずれかの微生物：
(i)　デルフチア・ラクストリス（Delftia lacustris）株、
(ii)　シュードアルスロバクター（Pseudarthrobacter）属に属するシュードアルスロバクター・エスピー（Pseudarthrobacter sp.）株、又は
(iii)　シュードモナス（Pseudomonas）属に属するシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）株。
[２]　芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する以下の3株の微生物のいずれかの微生物である[１]の微生物：
(i)　デルフチア・ラクストリス（Delftia lacustris）株であるNo.2a株（受託番号NITE　BP-03483）、
(ii)　シュードアルスロバクター（Pseudarthrobacter）属に属するシュードアルスロバクター・エスピー（Pseudarthrobacter sp.）株であるNo.7a株（受託番号NITE　BP-03484）、又は
(iii)　シュードモナス（Pseudomonas）属に属するシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）株であるNo.8d株（受託番号NITE　BP-03485）。
[３]　ビス（2-ヒドロキシエチル）テレフタレート（BHET）を分解する[１]または[２]の微生物。
[４]　モノヒドロキシエチルテレフタレート（MHET）を分解する[１]または[２]の微生物。
[５]　テレフタル酸（TPA)を分解する[１]または[２]の微生物。
[６]　[１]～[３]のいずれかの微生物の１以上を、芳香族ポリエステルまたはその分解産物と接触させることを含む、芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する方法。
[７]　ポリエチレンテレフタレート（PET)のリサイクル工程において得られる廃液中の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する、[６]の方法。
[８]　芳香族ポリエステルまたはその分解産物がビス（2-ヒドロキシエチル）テレフタレート（BHET）である、[６]または[７]の方法。
[９]　[１]～[５]のいずれかの微生物の１以上を含む、組成物。
[１０]　活性汚泥である、[９]の組成物。
[１１]　[１]～[５]のいずれかの微生物を保持した微生物担体である、[９]の組成物。
[１２]　微生物担体が、樹脂、活性炭およびゼオライトからなる群から選択される[１１]の組成物。
[１３]　[９]～[１２]のいずれかの組成物をポリエチレンテレフタレート（PET)のリサイクル工程において得られる廃液に接触させることを含む、PETリサイクル工程で得られる廃棄物中の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する方法。
[１４]　芳香族ポリエステルまたはその分解産物がビス（2-ヒドロキシエチル）テレフタレート（BHET）である、[１３]の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-115744号の開示内容を包含する。
　本発明のBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解し得る微生物を用いることにより、円滑なPETのケミカルリサイクルが可能となる。これらの微生物を単体で、又はこれらの微生物と活性汚泥を組み合わせることで、従来は分解処理が困難であったBHET廃液の迅速な処理が可能となる。
2a株の16S rDNAの塩基配列に基づく系統推定の結果を示す図である。 2a株とDelftia lacustrisの16S rDNA部分塩基配列比較の結果を示す図である。 2a株とDelftia lacustrisの16S rDNA部分塩基配列比較の結果を示す図である（図２－１の続き）。 2a株のコロニー像を示す図である。 2a株のグラム染色像を示す図である。 2a株の生化学的性質（細菌第一段階試験）の結果を示す図である。 2a株の生化学的性質（細菌第二段階試験）の結果を示す図である。 2a株の生化学的性質（細菌第二段階試験（追加試験））の結果を示す図である。 7a株の16S rDNAの塩基配列に基づく系統推定の結果を示す図である。 7a株のコロニー像を示す図である。 7a株のグラム染色像を示す図である。 7a株の生化学的性質（細菌第一段階試験)の結果を示す図である。 7a株の生化学的性質（細菌第二段階試験）の結果を示す図である。 7a株の生化学的性質（細菌第二段階試験（追加試験））の結果を示す図である。 8d株の16S rDNAの塩基配列に基づく系統推定の結果を示す図である。 8d株のコロニー像を示す図である。 8d株のグラム染色像を示す図である。 8d株の生化学的性質（細菌第一段階試験)の結果を示す図である。 8d株の生化学的性質（細菌第二段階試験）の結果を示す図である。 8d株の生化学的性質（細菌第二段階試験（追加試験））の結果を示す図である。 2a株、7a株及び8d株による８mMのBHETの0～150時間での分解を示す図である。図２０Ａはコントロールであり、図２０Ｂは2a株の結果、図２０Ｃは7a株の結果、図２０Ｄは8d株の結果を示す。 2a株、7a株及び8d株による12mMのBHETの0～150時間での分解を示す図である。図２１Ａはコントロールであり、図２１Ｂは2a株の結果、図２１Ｃは7a株の結果、図２１Ｄは8d株の結果を示す。 2a株、7a株及び8d株による16mMのBHETの0～150時間での分解を示す図である。図２２Ａはコントロールであり、図２２Ｂは2a株の結果、図２２Ｃは7a株の結果、図２２Ｄは8d株の結果を示す。 活性汚泥に2a株、7a株及び8d株を添加した場合の、BHETの分解を示す図である。図２３Ａはコントロールであり、図２３Ｂは2a株の結果、図２３Ｃは7a株の結果、図２３Ｄは8d株の結果を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明において、濃度を表す％はwt％を示す。
　本発明の微生物は、ポリエチレンテレフタレート（PET)等の芳香族ポリエステルを分解する芳香族ポリエステル分解菌である。
　本発明において、「ポリエステル」とは、主鎖にエステル結合を有する高分子物質をいう。また、本発明の微生物が分解する「芳香族ポリエステル」とは、芳香族成分を繰り返し単位として含むポリエステルをいう。該繰り返し単位の含有量は、化合物全体に対して、例えば50～100重量％、好ましくは70～100重量％、より好ましくは90～100重量％、さらに好ましくは95～100重量％である。芳香族ポリエステルとして、ポリエチレンテレフタレート（PET）が挙げられ、さらに、エチレンテレフタレート繰り返し単位を95重量％以上含むPETが挙げられる。
　芳香族ポリエステルはジカルボン酸成分及びジオール成分の重縮合により製造することができる。例えば、PETジカルボン酸成分としてテレフタル酸を使用し、ジオール成分としてエチレングリコールを使用し製造することができる。テレフタル酸以外の他のジカルボン酸成分として、フタル酸、イソフタル酸、ジフェニルジカルボン酸、ジフェノキシエタンジカルボン酸、2,5-ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸及びその誘導体；コハク酸、アジピン酸、アゼライン酸、セバチン酸、デカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸及びその誘導体が挙げられる。また、エチレングリコール以外の他のジオール成分としては、ジエチレングリコール、トリメチレングリコール、テトラメチレングリコール、プロピレングリコール、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコール、デカメチレングリコール等が挙げられる。
　本発明の芳香族ポリエステル分解菌を用いて芳香族ポリエステルを分解する場合、分解する芳香族ポリエステルの形態に限定はなく、例えば、繊維状、粒状、フレーク状、ペレット状、フィルム状、塊状、ボトル状のものが挙げられる。また、これらの混合体を用いることもできる。
　本発明の芳香族ポリエステル分解菌である微生物は、PETの分解中間産物であるモノヒドロキシエチルテレフタレート（MHET）およびテレフタル酸（TPA）も分解することができる。MHETは、加水分解されてTPAへ分解され、TPAは最終的に二酸化炭素にまで分解される。すなわち、BHET→MHET→TPA→二酸化炭素の経路で分解される。本発明の微生物を用いることにより、PETの分解中間産物であるBHETやMHETを最終的に二酸化炭素まで完全に分解することができる。
　本発明の芳香族ポリエステル分解菌である微生物は、特にポリエチレンテレフタレート（PET)を化学的に分解してケミカルリサイクルするときの分解中間産物であり廃液中に排出されるビス（2-ヒドロキシエチル）テレフタレート（BHET）を分解する細菌である。本発明の芳香族ポリエステル分解菌をBHET分解菌ということもできる。
　PETはその製造工程やリサイクルの工程において廃水が発生することがあり、ここに高濃度のPET分解産物が含まれる。本発明の微生物は、これらのPET分解産物を分解することができる。
　例えば、PETのケミカルリサイクルにおいて、PETを化学的に分解してモノマーのBHETとした後、精製し再重合させてPETとする。PETの化学分解法として、メタノリシス法、グリコリシス法、ヒドロリシス法等がある。これらのリサイクル方法において、BHETが廃棄物である廃液中に排出される。
　本発明の微生物を用いることにより、PETのリサイクル工程で出る廃液中のBHETを分解することができる。
　本発明のBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解し得る微生物として、2a株、7a（31076-02-B1）株および8d株の3株を挙げることができる。これらの３株の微生物は土壌より単離されたものである。
　生化学的性質および遺伝学的に関する同定試験の結果、2a株は、デルフチア・ラクストリス（Delftia lacustris）株、7a（31076-02-B1）株はシュードアルスロバクター（Pseudarthrobacter）属に属するシュードアルスロバクター・エスピー（Pseudarthrobacter sp.）株、8d株はシュードモナス（Pseudomonas）属に属するシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）株と同定された。
2a株：デルフチア・ラクストリス（Delftia lacustris）
　16S rDNAの塩基配列を配列番号１に示す。既知の16S rDNA（16S rRNA遺伝子）の塩基配列と比較した場合の最高の相同率は99.9％である。図１に16S rDNAの塩基配列に基づく系統推定の結果を示す。
　2a株は、2021年6月17日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE)　特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depository)（日本国　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-03483（「識別の表示」は、「31076-01」）で寄託されている。その後、国際寄託へと移管した（国際寄託への移管請求日：２０２２年５月２７日、受託番号：NITE BP-03483）。
7a（31076-02-B1）株：シュードアルスロバクター・エスピー（Pseudarthrobacter sp.）　16S rDNAの塩基配列を配列番号２に示す。既知の16S rDNAの塩基配列と比較した場合の最高の相同率は99.4％である。図２に16S rDNAの塩基配列に基づく系統推定の結果を示す。
　7a（31076-02-B1）株は、2021年6月17日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE)　特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depository)（日本国　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-03484（「識別の表示」は、「31076-02-B1」）で寄託されている。その後、国際寄託へと移管した（国際寄託への移管請求日：２０２２年５月２７日、受託番号：NITE BP-03484）。
8d株：シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）
　16S rDNAの塩基配列を配列番号３に示す。既知の16S rDNAの塩基配列と比較した場合の最高の相同率は99.7％である。図３に16S rDNAの塩基配列に基づく系統推定の結果を示す。
　8d株は、2021年6月17日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE)　特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depository)（日本国　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-03485（「識別の表示」は、「31076-03」）で寄託されている。その後、国際寄託へと移管した（国際寄託への移管請求日：２０２２年５月２７日、受託番号：NITE BP-03485）。
　本発明の微生物の培養には、当該微生物が増殖でき、かつBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物の分解に適切な任意の培地を使用することができる。そのような培地は限定されないが、一例としては、普通寒天培地（Nutrient agar)やMS培地やMS(+)培地が挙げられる。普通寒天培地は、例えば、肉エキス5.0g、ペプトン10.0g、塩化ナトリウム5.0g、カンテン15.0gを脱イオン水1000mLに溶解させて作製することができる。MS(+)培地は、例えば、酵母エキス、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウムバッファーを含み、さらに、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸マグネシウム等の金属塩およびその水和物を含む培地である。
　本発明の微生物の培養は、好気条件での静置培養、浸透培養のいずれによって行ってもよいが、静置培養によって行うことが好ましい。振盪培養で培養する場合の振盪速度は例えば100～400往復／分、好ましくは200～300往復／分である。
　本発明の微生物の培養温度は限定されないが、例えば20～40℃の範囲、好ましくは25～35℃の範囲、より好ましくは30℃で培養することができる。培養時のpHも限定されないが、例えば、５～９の範囲、好ましくは６～８の範囲で培養することができる。pHをこの範囲に調整するために、塩酸、硫酸等の無機酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基およびその水溶液、あるいはリン酸緩衝液等の各種緩衝液を用いてもよい。
　培養期間に限定はなく、例えば１日以上、好ましくは２日以上、より好ましくは５日以上、さらに好ましくは10日以上、かつ例えば５ヶ月以下、好ましくは２ヶ月以下、より好ましくは１ヶ月以下培養することができる。必要に応じて培養途中に新鮮な微生物菌体を添加することや培地を新鮮なものに交換することが有効であり得る。
　本発明は、上記の微生物単体で、又は複数を混合して用いることによりBHETを分解する方法を包含する。
　上記の微生物をBHET分解に用いる場合のBHET分解能は、BHETを上記の微生物と混合し、処理液中のBHETをOD600を測定することにより算出することができる。また、BHETを薄層クロマトグラフィー（TLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等により検出することによっても調べることができる。
　上記の微生物によるBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物の分解は、BHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物と上記の微生物を接触させることにより行うことができる。ここで、接触とは、BHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物と微生物を混合し、BHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物に微生物を作用させ、微生物によるBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物の分解反応を起こさせることをいう。分解反応させるときに作用させる微生物の密度は、分解するBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物の量等に応じ適宜設定することができる。反応温度は、20～40℃、好ましくは25～35℃、さらに好ましくは30℃である。反応時のpHは、pH7.0付近であり、好ましくは5.0～9.0、さらに好ましくは6.0～8.0、特に好ましくは6.5～7.5である。反応時間は、分解するBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物の量等により適宜設定できる。反応時間は、数時間から数ヶ月である。長時間の処理を行う場合は、定期的に上記の微生物を添加してもよい。
　上記の微生物のうち、いずれか単一の株のみを用いてもよいし、いずれか２株、すなわち、2a株および7a（31076-02-B1）株、2a株および8d株、または7a（31076-02-B1）株および8d株を組合わせて用いてもよいし、３株、すなわち、2a株、7a（31076-02-B1）株および8d株を組合わせて用いてもよい。単一の株を用いる場合、使用する株の増殖および／またはBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物の分解に適切な条件をより容易に決定することができる。
　3株の中でも、8d株の分解能が高く、1白金耳の微生物で2mMのBHET、MHET及びTPAを処理した場合、24時間でBHETのみだけではなく、MHETおよびTPAも完全に分解することができる。7a株は、24時間でBHETを完全に分解し、96時間でMHETを完全に分解し、2a株は72時間でBHET、MHET及びPTAをほぼ完全に分解することができる。
　本発明の微生物を用いてBHETを分解するとき、BHET濃度は、20mM以下、好ましくは16mM以下、さらに好ましくは8mM以下である。すなわち、本発明の微生物を用いた場合、8mMのBHETを72時間以内、好ましくは48時間以下に、さらに好ましくは24時間以内に完全分解することができる。微生物をBHETを含む溶液に添加して、BHETを分解すればよい。
　本発明の微生物は、BHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を含有する廃液の処理に用いる。好ましくは、PETのケミカルリサイクルで生じるBHETを含む廃液の処理に用いる。PETのケミカルリサイクルでは、エチレングリコールを用いてPETの解重合を行い、中間体であるBHETを製造する。次に、純度の高いBHETを得るために、精製工程（蒸留と再結晶）がある。再結晶の工程において排出される廃液は、BHETをはじめMHET、TPAなどの類縁物質が高濃度に含まれる。
　本発明の微生物を含む溶液上記の廃液に添加し接触させることにより、BHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解することができる。
　また、通常、活性汚泥を用いて廃棄物を処理している。ここで、活性汚泥とは、人為的・工学的に培養・育成された好気性微生物群を含んだ「生きた」浮遊性有機汚泥の総称であり、排水・汚水の浄化手段として下水処理場、し尿処理場、浄化槽ほかで広く利用されている。しかしながら、活性汚泥を用いても、BHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物は分解することはできず、PETのリサイクルの過程で発生する活性汚泥で処理した廃棄物中には、BHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物が残存している。
　そこで、活性汚泥中に本発明の微生物を混ぜ、PETリサイクル工程で得られた廃棄物である廃液を本発明の微生物を含む活性汚泥に添加し混合することにより、廃棄物中のBHET等の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解することができる。
　例えば、活性汚泥１Lに、本発明の微生物培養液を１～100mL、好ましくは１～50mL、さらに好ましくは5～10mL程度添加し、微生物を含む活性汚泥をBHETを含む廃液に添加し、20～40℃で8時間～7日間、好ましくは8時間～3日間、さらに好ましくは8時間～2日間、さらに好ましくは8時間～12時間処理すればよい。処理後の廃液は、環境基準を超えない処理水として海域へ放流される。環境基準を超える場合は、産業廃棄物として処理される。
　この際、活性汚泥中に微生物の栄養となる物質、例えば、培地を添加してもよい。
　また、PETリサイクル工程で得られた廃棄物を活性汚泥と混合して処理する前に、別の本発明の微生物を保持した担体と混合して処理することもできる。そのような担体として、微生物を付着し保持し得る樹脂等が挙げられ、例えば、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリプロピレン、ポリウレタン等の樹脂、活性炭やゼオライト等の表面積の大きい多孔質体が挙げられる。PVAの微生物を保持し得る担体として、例えば、クラレポバールTMやクラゲール（登録商標）（株式会社クラレ）が挙げられる。これらの担体の形状は限定されず、膜状の担体、カプセル状の担体、チューブ状の担体、ゲル状の担体等を用いることができる。これらの微生物を保持し得る担体を微生物担体という。
　さらに、専用培養器にPETリサイクル工程で得られた廃液を入れ本発明の微生物を浮遊増殖させ廃液からBHETのみを分解除去した後、残った廃液を活性汚泥による曝気槽でBHET以外の有機物を除去し、BOD（生物化学的酸素要求量）やCOD（化学的酸素要求量）を除去することもできる。
　上の記載において、本発明の微生物を含む溶液、本発明の微生物を含む活性汚泥、本発明の微生物を保持した微生物担体を、本発明の微生物を含む組成物という。
　本発明は、上記のように、PETリサイクル工程で得られた廃液を処理する排水処理施設も包含する。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
[実施例１]　BHET分解菌の単離および活性測定
１.　目的
　PETのケミカルリサイクルでは、エチレングリコールを用いてPETの解重合を行い、中間体であるBHETを製造する。次に、純度の高いBHETを得るために、精製工程（蒸留と再結晶）がある。再結晶の工程において排出される廃液は、BHETをはじめMHET、TPAなどの類縁物質が高濃度に含まれる。しかし、この廃液は活性汚泥法によって十分に処理できず、新たな処理技術が求められていた。そこで、効率よくBHETを分解する菌の取得を目的とした。
２.　実験材料と方法
2.1　土壌試料およびBHET精製品と晶析排水
　日本環境設計の川崎工場の敷地内から土壌を採取した。BHET試薬として会社から寄与されたリサイクル精製品のBHETペレットを用いた。同じく寄与された晶析排水3種類（廃液A 20190604、廃液B 20191009、廃液C 20190517）については、おもに廃液Aを用いて実験を行った。
2.2　集積培養培地および培養方法
　10種類の土壌をそれぞれ1gずつ生理食塩水10ｍLに懸濁し、室温で1時間静置した。
　乳鉢ですりつぶしたBHET粉末を0.2％（8mM）含むスクリーニング培地　0.2％BHET/MS(+)(表１)10ｍLに土壌懸濁液の上清0.5ｍLを加えて集積培養を行った。培養はφ20mmの試験管を用いて、30℃で行った。
　集積培養は、1週間毎に培養液0.1ｍLを新しい培地に植え継ぎすることを数回繰りかえした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
2.3　菌の単離
　培養後の菌体を含む培養液から平板希釈法で菌を単離した。培養液を生理食塩水で103～109倍希釈し、0.2％BHET/MS(+)寒天培地(表２)と、酵母エキスを１/１０量にした0.2％BHET/MS(+1/10)寒天培地(表３)に塗布し、３０℃で平板培養を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 trace elementsの組成は、表１と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 trace elementsの組成は、表１と同じである。
2.4　HPLC分析による単離菌のBHET分解活性の測定
　単離株のBHET分解活性を調べるために、0.2％BHET/MS(+)寒天培地上で継代している菌を1白金耳取り、10mLの2mM BHET/MS(+)培地に植菌して30℃で5日間振盪培養した後、培養液をHPLCで分析した。
　採取した培養液を1ｍLに移動相(ギ酸/アセトニトリル/水＝1/2/7　vol比)を加えて適宜希釈して更によく攪拌した。前処理用の両親和性プレフィルター0.20μmでろ過した後、HPLCで分析を行った。
　HPLC分析には島津製作所LC-2010A HTの装置、カラムはナカライテスクのCOSMOCIL 5C18-AR-II(4.5ID×250mm)と5C18-AR-IIガードカラムを用いた。
　分析は移動相(ギ酸/アセトニトリル/水＝1/2/7　vol比)の流速1mL/min、カラム温度40℃でのイソクラティック溶離で行い、波長254nmで検出した。溶出時間から、培養液に含まれるBHET、MHETならびにTPAのピークを同定し、各々のピーク面積を調べた。BHETについては、70℃で溶解したBHET水溶液を用いて、BHET濃度とピーク面積との検量線を作製して、定量性についても検証した。
３.　結果
3.1　BHET資化菌の単離
　平板培養によって、以下の3株の分離に成功した。
2a
7a（31076-02-B1）
8d
　それぞれをテクノスルガラボにおいて、同定した。以下に同定結果を示す。同定結果は、16s rDNA塩基配列解析結果、形態観察および生理・生化学性状試験（細菌第一段階試験および細菌第二段階試験）を含む。
3.2　分離した微生物の同定
（１）同定方法
(i)　培養条件
・培地：Nutrient Agar（Oxoid, GBR)
・培養温度：30℃
・培養時間：24～72時間
・その他の条件：好気培養
(ii)　16s rDNA部分塩基配列解析
・DNA抽出：アクロモペプチダーゼ (FUJIFILM Wako Pure Chemical, Japan) 
・PCR増幅：Tks Gflex DNA Polymerase (Takara Bio, Japan) 
・サイクルシークエンス：BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) 
・使用プライマー（中川恭好他、遺伝子解析法 16S rRNA 遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編集、放線菌の分類と同定、日本学会事務センター；2001, pp.88-117)
　PCR 増幅: 9F, 1510R
　シークエンス (約 1,500 bp): 9F, 515F, 1099F, 536R, 926R, 1510R 
・シークエンス：ABI PRISM 3130xL Genetic Analyzer System (Applied Biosystems) 
・塩基配列決定：ChromasPro 2.1 (Technelysium, AUS) 
・BLAST 相同性検索
　解析ソフトウェア: ENKI v3.2 (TechnoSuruga Laboratory, Japan)
　データベース：DB-BA15.0 (TechnoSuruga Laboratory)、国際塩基配列データベース (DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank)
・簡易分子系統解析
　系統樹の推定: 近隣結合法
　塩基置換モデル: Kimura-2-parameter 
　樹形の信頼性評価: ブートストラップ法 (1,000 反復)
(iii)　細菌第一段階試験
　実体顕微鏡によるコロニー観察、光学顕微鏡による形態観察および Barrow & Feltham （Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria, 3rd ed. Cambridge: Cambridge University Press; 1993.）の方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸/ガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵(O/F)について試験を行った。
・グラム染色：フェイバーG「ニッスイ」(Nissui Pharmaceutical, Japan)
・顕微鏡：光学顕微鏡 BX50F4 (Olympus, Japan)
・実体顕微鏡：SMZ800N (Nikon, Japan)
(iv)　細菌第二段階試験 
　細菌第二段階試験には以下のキットを用いた。
2a株：API 20 NE、API ZYM (bioMerieux, FRA) 
7a株：API CORYNE (bioMerieux, FRA) 
8d株：API 20 NE (bioMerieux, FRA) 
（２）同定結果
(i)　2a株
　図１に16S rDNAの塩基配列に基づく系統推定の結果を示す。図１中、左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のTはその種の基準株(Type strain)、BSL はバイオセーフティレベル(BSL1*(日和見病原体)以上を表記)を示す。16s rDNAの塩基配列を配列番号１に示す。
　図２－１及び２－２（図２－２は、図２－１の続き）に、2a株とDelftia lacustrisの16S rDNA部分塩基配列比較の結果を示す。図２中、Queryは2a株、SbjctはDelftia lacustrisの配列を示す。
　図３に2a株のコロニー像を、図４に2a株のグラム染色像を示す。
　2a株の生化学的性質を図５（細菌第一段階試験結果）、図６（細菌第二段階試験結果）及び図７（細菌第二段階試験（追加試験）結果）に示す。
　微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-BAおよび国際塩基配列データベースに対する BLAST相同性検索の結果、2a株の16S rDNA部分塩基配列はDelftia lacustrisの基準株332T(アクセッション番号EU888308)およびD. tsuruhatensis T7T(AB075017)に対し相同率 99.9%の相同性を示した。
　DB-BAに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹(図１)において、2a株はDelftia属が構成するクラスター内に含まれ、D. lacustris 332T(EU888308)と同一の分子系統学的位置を示した。
　細菌第一段階試験の結果、2a株は運動性を有するグラム陰性桿菌で、グルコースを酸化せず、カタラーゼおよびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した(図３、４および５)。これらの性状はDelftia属の性状と一致した。
　APIキットを用いて行った細菌第二段階試験の結果、検体は硝酸塩を還元し、D-マンニトール、グルコン酸カリウムおよび n-カプリン酸などを資化し、グルコースやマルトースなどを資化しなかった(図６)。また、追加試験の結果、検体は5％NaClで生育し、カゼインを加水分解し、リパーゼ活性(Tween 80)を示した(図７)。API ZYMを用いて行った各酵素反応の結果を図７に示した。また、これらの性状はD. lacustris の性状と多くの類似点が確認されたが、相違点も認められた。特にL-アラビノースおよびN-アセチル-D-グルコサミンを資化せず、α-グルコシダーゼおよび β-グルクロニダーゼ活性を示さない点はD. lacustrisの性状と異なっていた。
　以上の結果から、16S rDNA部分塩基配列解析の結果を重視し、2a株をD. lacustrisの株と同定した。
　2a株は、2021年6月17日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE)　特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depository)（日本国　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-03483（「識別の表示」は、「31076-01」）で寄託されている。その後、国際寄託へと移管した（国際寄託への移管請求日：２０２２年５月２７日、受託番号：NITE BP-03483）。
(ii)　7a株
　図８に16S rDNAの塩基配列に基づく系統推定の結果を示す。図８中、左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のTはその種の基準株(Type strain)、BSLはバイオセーフティレベル(BSL1*(日和見病原体)以上を表記)を示す。16s rDNAの塩基配列を配列番号２に示す。
　図９に7a株のコロニー像を、図１０に2a株のグラム染色像を示す。
　7a株の生化学的性質を図１１（細菌第一段階試験結果）、図１２（細菌第二段階試験結果）及び図１３（細菌第二段階試験（追加試験）結果）に示す。
　微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-BAおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、SIID31076-02-B1の16S rDNA部分塩基配列はPseudarthrobacter equi IMMIB L-1606T(FN673551)に対し相同率99.4％、P. defluvii 4C1-aT(AM409361)に対し相同率99.1％、P. chlorophenolicus A6T(AF102267)に対し相同率99.0％の相同性を示した。
　DB-BAに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹(図８)において、7a株はPseudarthrobacter属が形成するクラスターに含まれ、P. chlorophenolicus A6T(AF102267)とクラスターを形成したが、両者の間には距離が認められた。
　細菌第一段階試験の結果、7a株は運動性を有さないグラム陽性桿菌で、芽胞を形成せず、培養時間の経過につれて形態変化する桿菌-球菌生活環を示した(図９、１０、１１)。また、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性を示した(図１１)。これらの性状はPseudarthrobacter属の性状に一致した。
　APIキットを用いて行った細菌第二段階試験の結果、検体は硝酸塩を還元せず、エスクリンを加水分解し、ゼラチンを加水分解せず、各糖を酸化しなかった(図１２)。また、追加試験の結果、検体は嫌気条件下で生育せず、カゼインおよびチロシンを加水分解し、でんぷんを加水分解しなかった(図１３)。これらの性状は16S rDNA部分塩基配列解析の結果において、同じクラスターを形成したP. chlorophenolicusの性状と類似点があるものの、相違も確認された。特に、運動性を示さず、ゼラチンを加水分解しない点はP. chlorophenolicusの性状と異なっていた。また、Pseudarthrobacter属の中に検体と一致する既知種は見当たらなかった。
　以上の結果は、7a株はPseudarthrobacter属に含まれ、既知種では P. chlorophenolicusに最も近縁であることを示す。しかし、16S rDNA塩基配列解析および生理・生化学性状試験の結果は、7a株がP. chlorophenolicusとは異なることを示唆している。
　最終的に、7a株をPseudarthrobacter sp.と同定した。
　7a株は、2021年6月17日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE)　特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depository)（日本国　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-03484（「識別の表示」は、「31076-02-B1」）で寄託されている。その後、国際寄託へと移管した（国際寄託への移管請求日：２０２２年５月２７日、受託番号：NITE BP-03484）。
(iii)　8d株
　図１４に16S rDNAの塩基配列に基づく系統推定の結果を示す。図１４中、左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のTはその種の基準株(Type strain)、BSL はバイオセーフティレベル(BSL1*(日和見病原体)以上を表記)を示す。16s rDNAの塩基配列を配列番号３に示す。
　図１５に8d株のコロニー像を、図１６に8d株のグラム染色像を示す。
　8d株の生化学的性質を図１７（細菌第一段階試験結果）、図１８（細菌第二段階試験結果）及び図１９（細菌第二段階試験（追加試験）結果）に示す。
　微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-BAおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、8d株の16S rDNA部分塩基配列はPseudomonas nitroreducens DSM 14399T(AM088474)に対し相同率99.7％の相同性を示した。
　DB-BAに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹(図１４)において、S8d株はPseudomonas属が形成するクラスターに含まれP. nitroreducens DSM 14399T(AM088474)と99％の高いブートストラップ値で支持されるクラスターを形成し、近縁であることが示されたが、両者の間には距離が認められた。
　細菌第一段階試験の結果、8d株は運動性を有するグラム陰性桿菌で、グルコースを酸化し、カタラーゼおよびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した(図１５、１６、１７)。これらの性状はPseudomonas属の性状と一致した。
　APIキットを用いて行った細菌第二段階試験の結果、検体は硝酸塩を還元し、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示し、ゼラチンを加水分解せず、グルコース、グルコン酸カリウムおよびn-カプリン酸などを資化し、L-アラビノースおよびD-マンノースなどを資化しなかった(図１８)。また、追加試験の結果、検体King's AおよびKing's B寒天培地上で蛍光色素を産生せず、でんぷんを加水分解しなかった(図１９)。これらの性状は、16S rDNA部分塩基配列解析の結果において、同じクラスターを形成したP. nitroreducensの性状と類似点があるものの、一致しなかった。特に蛍光色素を産生しない点はP. nitroreducensの性状と異なっていた。
　以上の結果は、8d株はPseudomonasに含まれ、既知種ではP. nitroreducensに最も近縁であることを示す。しかし、16S rDNA塩基配列解析および生理・生化学性状試験の結果は、8d株がP. nitroreducensとは異なることを示唆している。
　最終的に、8d株をPseudomonas sp.と同定した。
　8d株は、2021年6月17日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE)　特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depository)（日本国　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-03485（「識別の表示」は、「31076-03」）で寄託されている。その後、国際寄託へと移管した（国際寄託への移管請求日：２０２２年５月２７日、受託番号：NITE BP-03485）。
3.3　BHET分解菌の分解活性の経時的測定
　３種類の異なる分解菌（2a、7aおよび8d）を、2mM BHET/MS(+)培地で培養した。24時間ごとに培養液を1mLずつサンプリングし、OD600を測定した後回収した。そして、HPLCでBHETの分解量を調べた。
　2aのBHETの分解速度は、7aや8dに比べて遅いが、72時間ではBHET、MHETおよびTPAがほぼ消失した。
　7aは、24時間でBHETを、96時間でMHETをそれぞれ完全に分解した。
　8dは、24時間でBHET、MHETとTPAを完全に分解した。
　なお、BHETの分子量は254であるので、1 mM BHETは、254 mg/L BHETすなわち0.0254％ BHETであり、8 mM BHETは、2032 mg/L BHETすなわち0.2032％ BHETである。
3.4　高濃度BHET下における分解活性
　実際に晶析排水を処理するにあたり、より高濃度のBHETが分解できるか調べるために、8mM、12mM、および16mMのBHETを含む培養液において2a、7a、8dの菌がBHETを分解できるか調べた。同様の構成でBHET分解菌を加えない培養液はコントロールとして比較標準とした。
　8mM以上のBHETは70℃でも溶解しないためフィルターろ過滅菌できない。BHET/MS(+)FT培地時と同じ調製法を用いることができない。そこで、BHETが若干MHETに分解するが、次の方法で培地を調製した。BHETペレットを16mM、24mM、32mMになるように水に加えオートクレーブ滅菌処理により完全に溶解した。水溶液中のBHETが析出するまえに、同じくオートクレーブ滅菌した2×MS(+)と等量混合し攪拌した後、すぐに培養用の試験管に分注した。
　作製した8mM、12mM、16mMの各BHET/MS(+)培地に、菌体を1白金耳取り1mLのMS(+)培地に懸濁した後、10mLの各培地に80μLずつ植菌した。30℃で振盪培養し、24時間ごとに培養液を1mLずつサンプリングし、一旦-20℃で保管した後、後日解凍して培養液のpHと、HPLCでBHETの分解量を調べた。n=2で実験を行った。
　培養4日後の培養液の様子から、2a、7aは16mM BHETでも増殖が確認された。8dについては12mM以上では増殖しないことがわかった。
　図２０～２２に結果を示す。
　2a、7aは12mMのBHETを3日間で分解した。2aは12mMの時が最もBHET分解活性が高く7aは8mMの時が最も高かった。8dは8mMで非常にBHET分解活性が高く、24時間でBHET、MHET、TPAを完全に分解した。
[実施例２]　BHET分解菌を含む活性汚泥を用いたPETリサイクル工程で得られる廃棄物中のBHETの分解
１．　目的
　慶応義塾大学にて単離されたBHET分解菌を、日本環境設計株式会社工場の廃水処理施設の活性汚泥に加えた際のBHET分解能力向上の確認を目的とした。
２．　実験材料と方法
2.1　BHET分解菌およびBHET精製品と活性汚泥
　BHET分解菌として、慶応義塾大学にて単離した2a、7a、8dの3種の菌を使用した。日本環境設計株式会社の子会社であるペットリファインテクノロジーで製造されたBHET、日本環境設計株式会社北九州響灘工場の廃水処理設備から採取した活性汚泥を使用して実験を行った。
2.2　実験方法
　活性汚泥5mlにBHET分解菌3種の培養液100μlを加え、微量金属1％（表４）、BHET 0.2wt％、全量で10mlとなるように水を溶媒として培養液を調整した。同様の構成でBHET分解菌を加えない培養液はコントロールとして比較標準とした。調製した培養液を30℃で振盪培養し、1日後、2日後、3日後、5日後に100μlサンプリングを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
2.3　HPLCによるBHET分解活性の比較
　採取した培養液0.1mlに移動相(ギ酸/アセトニトリル/水＝1/2/7　vol比)を加えて10倍希釈してよく攪拌した後、0.2μmフィルターでろ過してからHPLCでの分析を行った。
　HPLC分析には島津製作所LC-2010A HTの装置、カラムはナカライテスクのCOSMOCIL 5C18-AR-II(4.6ID×250mm)と5C18-AR-IIガードカラムを用いた。分析は移動相(ギ酸/アセトニトリル/水＝1/2/7 vol比)の流速1mL/min、カラム温度40℃でのイソクラティック溶離で行い、波長254nmで検出した。溶出時間から、培養液に含まれるBHET、MHETならびにTPAのピークを同定し、各々のピーク面積を調べた。BHETについては、70℃で溶解したBHET水溶液を用いて、BHET濃度とピーク面積との検量線を作製して、定量性についても検証した。
３.　結果
　活性汚泥に3種類の異なるBHET分解菌（2a、7a、および8d）を加えた培養液の調整直後、培養開始から1日後、2日後、3日後、5日後に100μlずつサンプリングし、HPLCにかけてBHETの分解量を調べた。
　図２３に結果を示す。
　活性汚泥のみのコントロールと比較して、BHET分解菌2a、7a、8dの全てにおいてBHET分解速度は向上した。中でも8dのBHET分解速度が速く、5日後にBHET、MHET、およびTPAがほぼ消失した。
[実施例３]　BHET分解菌固定担体を用いたPETリサイクル工程で得られる廃棄物中のBHETの分解
１．　目的
　慶応義塾大学にて単離されたBHET分解菌を、市販の菌固定担体に固定した際のBHET分解能力の確認を目的とした。
２．　実験材料と方法
2.1　BHET分解菌およびBHET精製品と菌固定担体
　BHET分解菌として、慶応義塾大学にて単離した8dの菌を使用した。日本環境設計株式会社の子会社であるペットリファインテクノロジー株式会社で製造されたBHETを使用して実験を行った。菌固定担体として、クラレ社製のPVAゲル（クラゲール）を用いた。
2.2　菌固定担体へのBHET菌の固定
　試験管に、BHET0.4wt%を5ml、2×MS(+)を5ml加え、そこにBHET分解菌8dの培養液100μlを加えて培養液を調整した。あらかじめ滅菌済みの生理食塩水で置換および洗浄したクラゲール50粒を加え、30℃で２日間振盪培養した。
2.3　実験方法
　試験管に、BHET0.4wt%を5ml、2×MS(+)を5ml加え、そこにBHET分解菌を固定した固定化担体を50粒加え、培養液を調整した。調製した培養液を30℃で振盪培養し、1日後に100μlサンプリングを行った。
2.4　HPLCによるBHET分解活性の比較
　採取した培養液0.1mlに移動相(ギ酸/アセトニトリル/水＝1/2/7　vol比)を加えて10倍希釈してよく攪拌した後、0.2μmフィルターでろ過してからHPLCでの分析を行った。
　HPLC分析には島津製作所LC-2010A HTの装置、カラムはナカライテスクのCOSMOCIL 5C18-AR-II(4.6ID×250mm)と5C18-AR-IIガードカラムを用いた。分析は移動相(ギ酸/アセトニトリル/水＝1/2/7 vol比)の流速1mL/min、カラム温度40℃でのイソクラティック溶離で行い、波長254nmで検出した。溶出時間から、培養液に含まれるBHET、MHETならびにTPAのピークを同定し、各々のピーク面積を調べた。BHETについては、70℃で溶解したBHET水溶液を用いて、BHET濃度とピーク面積との検量線を作製して、定量性についても検証した。
３.　結果
　BHET分解菌を固定した菌固定担体の培養液の調整直後、培養開始から1日後に100μlサンプリングし、HPLCにかけてBHETの分解量を調べた。
　BHET分解菌を固定した菌固定担体はBHET分解速度が速く、1日後にBHET、MHET、およびTPAがほぼ消失した。
　本発明の微生物を用いて、ポリエチレンテレフタレートのリサイクルを効率的に行うことができる。
NITE BP-03483
NITE BP-03484
NITE BP-03485
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (14)

  1. 芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する以下の3株の微生物のいずれかの微生物：
    (i)　デルフチア・ラクストリス（Delftia lacustris）株、
    (ii)　シュードアルスロバクター（Pseudarthrobacter）属に属するシュードアルスロバクター・エスピー（Pseudarthrobacter sp.）株、又は
    (iii)　シュードモナス（Pseudomonas）属に属するシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）株。
  2. 芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する以下の3株の微生物のいずれかの微生物である請求項１記載の微生物：
    (i)　デルフチア・ラクストリス（Delftia lacustris）株であるNo.2a株（受託番号NITE　BP-03483）、
    (ii)　シュードアルスロバクター（Pseudarthrobacter）属に属するシュードアルスロバクター・エスピー（Pseudarthrobacter sp.）株であるNo.7a株（受託番号NITE　BP-03484）、又は
    (iii)　シュードモナス（Pseudomonas）属に属するシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）株であるNo.8d株（受託番号NITE　BP-03485）。
  3. ビス（2-ヒドロキシエチル）テレフタレート（BHET）を分解する請求項１または２に記載の微生物。
  4. モノヒドロキシエチルテレフタレート（MHET）を分解する請求項１または２に記載の微生物。
  5. テレフタル酸（TPA)を分解する請求項１または２に記載の微生物。
  6. 請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物の１以上を、芳香族ポリエステルまたはその分解産物と接触させることを含む、芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する方法。
  7. ポリエチレンテレフタレート（PET)のリサイクル工程において得られる廃液中の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する、請求項６記載の方法。
  8. 芳香族ポリエステルまたはその分解産物がビス（2-ヒドロキシエチル）テレフタレート（BHET）である、請求項６または７に記載の方法。
  9. 請求項１～５のいずれか１項に記載の微生物の１以上を含む、組成物。
  10. 活性汚泥である、請求項９記載の組成物。
  11. 請求項１～５のいずれか１項に記載の微生物を保持した微生物担体である、請求項９記載の組成物。
  12. 微生物担体が、樹脂、活性炭およびゼオライトからなる群から選択される請求項１１記載の組成物。
  13. 請求項９～１２のいずれか１項記載の組成物をポリエチレンテレフタレート（PET)のリサイクル工程において得られる廃液に接触させることを含む、PETリサイクル工程で得られる廃棄物中の芳香族ポリエステルまたはその分解産物を分解する方法。
  14. 芳香族ポリエステルまたはその分解産物がビス（2-ヒドロキシエチル）テレフタレート（BHET）である、請求項１３記載の方法。
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