JP2008199957A - 芳香族ポリエステル分解細菌およびこれを用いた芳香族ポリエステル分解方法 - Google Patents

Abstract

【課題】芳香族ポリエステル分解能を有する細菌、およびこれを用いた芳香族ポリエステル分解方法の提供。
【解決手段】特定の塩基配列と９７％を超える相同性を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有し、かつ芳香族ポリエステル分解能を有する細菌。芳香族ポリエステルの存在下で該細菌を培養する、芳香族ポリエステル分解方法。該細菌が、さらにエチル−４−ヒドロキシベンゾエート、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、４−メチルカテコール、モノメチルテレフタレート、テレフタル酸およびテレフタル酸二ナトリウム塩からなる群より選択される化合物を分解する能力を有する、芳香族ポリエステル分解方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規な芳香族ポリエステル分解能を有する細菌およびこれを用いた芳香族ポリエステル分解方法に関する。

ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は、テレフタル酸とエチレングリコールの縮重合により製造される芳香族ポリエステルであり、加工性、耐久性に優れ、安価であることから、飲料用ボトル、フィルム、繊維などに汎用されている。

これらは使用後、主に埋め立てや焼却により処理され、環境汚染の原因となっている。そこで、ＰＥＴを再利用することが試みられている。例えば、原料を物理的に処理するマテリアルリサイクルでは、ＰＥＴボトルなどを細かく砕いてフレーク状やペレット状にして、繊維やシート類、洗剤ボトルなどの形成品に再商品化している。また、近年開発された化学分解法では、いくつかの化学的手法による処理工程を経て高純度の原料にまで戻し、再びＰＥＴ樹脂にしている。さらに、使い捨ての食品用ＰＥＴボトルを再使用する「ボトルｔｏボトル」というリサイクル手法も提唱されている。

しかし、このような処理に必要とされるコストや消費エネルギーなどの観点から、微生物、酵素などを用いた生分解法の開発が望まれていた。

脂肪族系ポリエステルは一般的な土壌微生物やリパーゼ等の既知酵素によって分解されることから、生分解性のポリマーとして研究開発が行われている。また、テレフタル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸等の芳香族成分を有するポリエステルであっても、含有される芳香族成分が少量であったり、耐熱性が著しく低下していたりする場合には、一般土壌中や活性汚泥中の微生物や既知酵素により生分解可能であることが知られている。しかし、ＰＥＴのように芳香族成分を主成分とする芳香族系ポリエステルを分解する微生物及び酵素はほとんど知られておらず、わずかに、ＰＥＴ繊維やＰＥＴ織布を酵素で処理することにより、親水性の向上などの表面改質を行うことが提案されているが（例えば、特許文献１、２等参照。）、ＰＥＴが分解されていることを明確に示すデータはない。真菌類由来の酵素クチナーゼをＰＥＴに作用させ得るという報告もあるが、その分解は限定的である（非特許文献１）

本発明者らはこれまでに芳香族ポリエステルに作用する微生物として根粒菌の１種であるリゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３（Rhizobium sp. OKH-03）を単離し（特許文献３参照）、他の微生物と上記リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３とを組み合わせた微生物群を用いてＰＥＴを二酸化炭素および水まで分解することができることを見出した（特許文献４参照）。また、Ｎａｇａｒａｊａｎらは複数の好熱性微生物からなるコンソーシアムを用いて脂肪族芳香族ポリエステルを分解することを報告している（非特許文献２）。培養条件の制御の容易さや分解効率の向上などの観点からは、より効率よく芳香族ポリエステルを分解する能力を有する少数、できれば単一の微生物を用いることが望ましいが、そのような微生物は現在までに知られていない。

特表２０００−５０２４１２号公報 特表２００１−５０２０１４号公報 特開２００６−１８７２０１号公報 国際公開第２００６／０９０９１３号パンフレット Vertommen, M.A.M.E. et al., J. Biotechnol., 120:376-386 (2005) Nagarajan, V. et al., J. Polym. Environ., 14:281-287 (2006)

本発明者らは、鋭意検討の結果、土壌より得られた新規細菌が単独で芳香族ポリエステルの一種であるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の主鎖を分解する能力を有していることを見出した。さらに本発明者らは、この細菌を用いてＰＥＴなどの芳香族ポリエステルを分解できることを見出し、本発明を完成させた。

本発明は以下に関する：
［１］芳香族ポリエステル分解細菌Ｎｏ．２０１−Ｆ６株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３１４）；
［２］配列番号３の１２〜１４６２位に示す塩基配列と９７％を超える相同性を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有し、かつ芳香族ポリエステル分解能を有する細菌；
［３］芳香族ポリエステルの存在下で芳香族ポリエステル分解能を有する細菌を培養する工程を包含する、芳香族ポリエステル分解方法；
［４］芳香族ポリエステルがポリエチレンテレフタレートである、［３］の方法；
［５］芳香族ポリエステル分解能を有する単一の細菌を培養する、［３］の方法；
［６］芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３１４）である、［３］の方法；
［７］芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３１４）由来の変異株である、［３］の方法；
［８］芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、配列番号３の１２〜１４６２位に示す塩基配列と９７％を超える相同性を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有し、かつ芳香族ポリエステル分解能を有する細菌である、［３］の方法；
［９］芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、さらにビス（２−ヒドロキシエチル）テレフタレートをモノヒドロキシエチルテレフタレートに分解する能力を有する、［３］の方法；
［１０］芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、さらにモノヒドロキシエチルテレフタレートをテレフタル酸二ナトリウム塩に分解する能力を有する、［３］の方法；
［１１］芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、さらにテレフタル酸二ナトリウム塩を分解する能力を有する、［３］の方法；
［１２］芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、さらにエチル−４−ヒドロキシベンゾエート、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、４−メチルカテコール、モノメチルテレフタレート、テレフタル酸およびテレフタル酸二ナトリウム塩からなる群より選択される化合物を分解する能力を有する、［３］の方法；
［１３］芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、イソフタル酸を分解する能力を有しない、［３］の方法；
［１４］芳香族ポリエステル分解産物を回収する工程をさらに包含する、［３］の方法；および
［１５］芳香族ポリエステル分解産物が、ビス（２−ヒドロキシエチル）テレフタレート、モノヒドロキシエチルテレフタレートまたはテレフタル酸二ナトリウム塩である、［１４］の方法。

本発明により、新規な芳香族ポリエステル分解能を有する細菌およびこれを用いた芳香族ポリエステル分解方法が提供される。

本発明の芳香族ポリエステル分解方法は、芳香族ポリエステルの存在下で芳香族ポリエステル分解能を有する細菌を培養する工程を包含する。

本明細書において「ポリエステル」とは、主鎖にエステル結合を持つ任意の高分子物質をいう。本明細書において「芳香族ポリエステル」とは、芳香族成分を繰り返し単位として含む任意のポリエステルをいう。当該繰り返し単位の含有量は、例えば５０〜１００重量％、好ましくは７０〜１００重量％、より好ましくは９０〜１００重量％、さらに好ましくは９５〜１００重量％である。芳香族ポリエステルは好ましくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）であり、さらに好ましくはエチレンテレフタレート繰り返し単位を９５重量％以上含むＰＥＴである。

芳香族ポリエステルはジカルボン酸成分およびジオール成分の重縮合により製造される。例えば、ＰＥＴはジカルボン酸成分としてテレフタル酸を、ジオール成分としてエチレングリコールを使用して製造される。テレフタル酸以外のジカルボン酸成分としては、フタル酸、イソフタル酸、ジフェニルジカルボン酸、ジフェノキシエタンジカルボン酸、２，５−ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸及びその誘導体、コハク酸、アジピン酸、アゼライン酸、セバチン酸、デカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸及びその誘導体が挙げられる。また、エチレングリコール以外のジオール成分としては、ジエチレングリコール、トリメチレングリコール、テトラメチレングリコール、プロピレングリコール、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコール、デカメチレングリコール等が例示される。

本発明による分解に供する芳香族ポリエステルの形態に限定はなく、形態の例としては繊維状、フィルム状、塊状、ボトル状、粒状、フレーク状、ペレット状、これらの混合体などが挙げられる。

本発明の細菌は、芳香族ポリエステルを分解する能力を有する。１つの実施態様において、本発明の細菌は、単独で芳香族ポリエステルを分解する能力を有する。例えば、本発明の細菌は、芳香族ポリエステル（例えば、ＰＥＴ）の主鎖を分解する能力を有する。１つの実施態様において、本発明の細菌は、ビス（２−ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）をモノヒドロキシエチルテレフタレート（ＴＡ−ＥＧ）に分解する能力、ＴＡ−ＥＧをテレフタル酸二ナトリウム塩（ＴＰＡ・２Ｎａ）に分解する能力、および／またはＴＰＡ・２Ｎａを分解する能力を有している。別の実施態様において、本発明の細菌は、エチル−４−ヒドロキシベンゾエート（ＥＨＢ）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（ＨＢ）、４−メチルカテコール（ＭＣ）、モノメチルテレフタレート（ＭＭＴ）、テレフタル酸（ＴＰＡ）およびテレフタル酸二ナトリウム塩（ＴＰＡ・２Ｎａ）からなる群より選択される化合物を分解する能力を有する。さらなる実施態様において、本発明の細菌は、イソフタル酸（ｉｓｏＰＡ）を分解する能力を有しない。

このような細菌の例としては、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株が挙げられる。Ｎｏ．２０１−Ｆ６株は本発明者によって土壌から単離されたグラム陰性桿菌である。生化学的性質および遺伝学的性質に基づいた分類によれば、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株は既知のいずれの細菌とも異なる属、種の新規な細菌である。配列番号３に示すＮｏ．２０１−Ｆ６株の１６ＳリボゾーマルＤＮＡ（１６Ｓ ｒＤＮＡ）を既知の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と比較した場合の最高の相同率は９７．０％である。これに基づき、配列番号３の１２〜１４６２位に示す塩基配列と９７％を超える相同性を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌はＮｏ．２０１−Ｆ６株と近縁であり、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株と同等の芳香族ポリエステル分解能を有する可能性が高い。従って、配列番号３の１２〜１４６２位に示す塩基配列と９７％を超える相同性を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有し、かつ芳香族ポリエステル分解能を有する細菌を本発明に使用することができる。

また、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株由来の変異株を本発明に使用することができる。Ｎｏ．２０１−Ｆ６株は、ＰＥＴの主鎖を分解する能力、ＢＨＥＴをＴＡ−ＥＧに分解する能力、ＴＡ−ＥＧをＴＰＡ・２Ｎａに分解する能力、およびＴＰＡ・２Ｎａを分解する能力を有している。この株を変異誘発に供して上記分解を特定の段階で停止させれば、ＢＨＥＴ、ＴＡ−ＥＧ、ＴＰＡ・２Ｎａなどの特定のＰＥＴ分解産物を効率的に得ることができる。従って、このような変異株は芳香族ポリエステル分解産物の製造に有用である。あるいは、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株を変異誘発に供して、芳香族ポリエステル分解能をさらに向上させた変異株を得ることができる。例えば、このような変異株は公知の変異原物質での処理、およびその後のスクリーニングによって得ることができる。あるいは、上記分解の各段階に関与する酵素をコードする遺伝子を単離し、これを人為的に改変した後にもとの細菌に戻す方法によって、目的の変異株を得ることができる。

芳香族ポリエステル分解能は、芳香族ポリエステルからなる材料（例えば、フィルム）の存在下で目的の細菌を培養し、材料の白化を観察することや、培養後の材料の重量損失を測定することによって調べることができる。あるいは、芳香族ポリエステルや、ＢＨＥＴ、ＴＰＡ・２Ｎａなどの分解中間産物に対する作用を、被検物質の存在下で目的の細菌株を培養し、得られた培養液中に存在する物質を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いる公知の方法で検出することによって、芳香族ポリエステル分解能を確認することができる。

本発明の細菌は高い芳香族ポリエステル分解能を有する。例えば、本発明の細菌を下記のＭＬＥ培地中でイソフタル酸共重合非晶質ＰＥＴフィルム（ｉｓｏＰＥＴフィルム）またはテレフタル酸共重合非晶質ＰＥＴフィルム（ｔｅｒｅＰＥＴフィルム）の存在下で培養した場合、当該フィルムを、例えば０．０２ｍｇ／ｃｍ^２・日以上、好ましくは０．０５ｍｇ／ｃｍ^２・日以上、より好ましくは０．１ｍｇ／ｃｍ^２・日以上、かつ例えば０．３ｍｇ／ｃｍ^２・日以下、好ましくは０．５ｍｇ／ｃｍ^２・日以下、より好ましくは１．０ｍｇ／ｃｍ^２・日以下の速度で分解することができる。

本発明の芳香族ポリエステル分解方法には、複数の細菌の組み合わせを使用してもよいが、単一の細菌を使用することが好ましい。これにより、使用する細菌の増殖および／または芳香族ポリエステルの分解に適切な条件をより容易に決定することができる。

本発明の細菌の培養には、当該細菌が増殖でき、かつ芳香族ポリエステルの分解に適切な任意の培地を使用することができる。そのような培地としては改変ＬＥ培地（ＭＬＥ培地）が挙げられる。ＬＥ培地はレタスと卵の黄味の抽出液からなる培地であり、次の方法で調製することができる。１１０℃で５時間乾燥させたレタスの葉３ｇと、ゆで卵の卵黄３ｇを別々にイオン交換水１Ｌで１０分間煎じ、室温まで冷却した後に、濾紙で濾過する。これらの濾液を混合してＬＥ培地が得られる。これにさらに無機化合物を添加してＭＬＥ培地が得られる。ここで添加する無機化合物としては、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸マグネシウム等の金属塩及びその水和物が挙げられる。

本発明の細菌の培養は、静置培養、浸透培養のいずれによって行ってもよいが、振盪培養によって行うことが好ましい。振盪速度は例えば１００〜４００往復／分、好ましくは２００〜３００往復／分である。

本発明の細菌の培養温度に限定はなく、例えば２０〜３７℃の範囲、好ましくは２５〜３５℃の範囲、より好ましくは３０℃で培養することができる。

培養時のｐＨに限定はなく、例えば５〜９の範囲、好ましくは６〜８の範囲で培養することができる。ｐＨをこの範囲に調整するために、塩酸、硫酸等の無機酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基及びその水溶液、あるいはリン酸緩衝液等の各種緩衝液を用いてもよい。

培養期間に限定はなく、例えば１日以上、好ましくは２日以上、より好ましくは５日以上、さらに好ましくは１０日以上、かつ例えば５ヶ月以下、好ましくは２ヶ月以下、より好ましくは１ヶ月以下培養することができる。必要に応じて培養途中に新鮮な菌体を添加することや培地を新鮮なものに交換することが有効であり得る。

また、本発明の細菌を芳香族系ポリエステルの存在下で培養する際に、細菌を芳香族ポリエステルに吸着させ、芳香族ポリエステル表面にバイオフィルムを形成させることが好ましい。本明細書において「バイオフィルム」とは細菌とその排出物からなる層状物質をいう。これによって当該細菌が芳香族ポリエステルに強固に接着し、且つ、芳香族ポリエステルを分解する場を形成することができる。ＰＥＴなどの芳香族ポリエステルの表面は高度に疎水性であるので、細菌の分解対象表面への吸着が困難である可能性がある。このような場合、バイオフィルムの形成は分解効率向上の観点から重要である。本発明の細菌の１種であるＮｏ．２０１−Ｆ６株は、ｉｓｏＰＥＴフィルム、ｔｅｒｅＰＥＴフィルムのいずれの表面にも同等に十分なバイオフィルムを形成することができるので、芳香族ポリエステルの分解に適切に使用することができる。

本発明の方法により、ＰＥＴなどの芳香族ポリエステルを分解することができる。従って、本発明の方法を用いればＰＥＴボトルなどの廃棄物を処理することができる。さらに、本発明の方法を、ＰＥＴ繊維の表面修飾、ＰＥＴ繊維を使用した衣類の洗浄、リサイクルに供するＰＥＴ樹脂の洗浄などに応用することができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

Ｎｏ．２０１−Ｆ６株の性質
土壌より得たＰＥＴ分解能を有する細菌群から限界希釈法により、単独でＰＥＴ主鎖分解能を有する細菌株Ｎｏ．２０１−Ｆ６を得た。この株は、ｂａｃｔｅｒｉａ ２０１−Ｆ６と表示され、平成１９年２月１４日より、〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３１４のもとで寄託されている。

以下、本菌株の培養には改変ＬＥ培地（ＭＬＥ培地）を用いた。ＬＥ培地はレタスと卵の黄味の抽出液からなる培地であり、次の方法で調製した。１１０℃で５時間乾燥させたレタスの葉３ｇと、ゆで卵の卵黄３ｇを別々にイオン交換水１Ｌで１０分間煎じ、室温まで冷却した後に、濾紙で濾過した。これらの濾液を混合してＬＥ培地を得た。これにさらに表１に記載のように無機化合物を添加してＭＬＥ培地を得た。

本菌株の生化学的性質を表２および３に示す。また、菌株の電子顕微鏡写真を図１に示す。

次に、遺伝学的分類方法を用いて検討を加えた。すなわち、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株のゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてＰＣＲ法によって１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅し、ＤＮＡ塩基配列を決定した。ＰＣＲ法に使用したプライマー８−２７ ｆｗｄおよび１５２５ ｒｅｖの配列を配列番号１および２に、決定した１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。なお、配列番号３中の１〜１１の塩基配列はＰＣＲ法に使用したプライマーに由来する配列である。

１６Ｓ ｒＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を既知の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と比較するＢＬＡＳＴ検索の結果、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ ＡＴＣＣ１７０１１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１６２１３）と最高の相同率９７．０％（配列番号３の１２〜１４６２位に相当する１４５１塩基中１４０７塩基）が示された。この細菌は光合成細菌であり、一方、本発明のＮｏ．２０１−Ｆ６株は光合成能を有していなかった。図２に１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく系統推定の結果を示す。

上記生化学的性質および遺伝学的性質に基づき、本発明のＮｏ．２０１−Ｆ６株は既知のいずれの細菌とも異なる属、種の新規な細菌であると判断した。

培養条件の検討
Ｎｏ．２０１−Ｆ６株を振盪培養または静置培養した場合のＰＥＴ分解活性を比較した。

１０ｍＬの培地の入った中試験管（φ１８×１８０ｍｍ）をオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）し、そこに０．１規定の塩酸水溶液と７０％エタノール水溶液を用いて滅菌したイソフタル酸共重合非晶質ＰＥＴフィルム（ｉｓｏＰＥＴフィルム、１．４×２．０ｃｍ）を無菌的に入れた。そこにＮｏ．２０１−Ｆ６株を植菌した。培養は３０℃で１０日間行い、振盪は２８５往復／分で行った。１０日後、ＰＥＴフィルムを回収し、水洗後、減圧下で乾燥させ、重量を測定し、分解量を算出した。

その結果、振盪した場合に、静置の場合に比較して約２倍の重量損失が観察された。以上より、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株を用いたＰＥＴの分解には振盪培養が適切であることが示された。

ＰＥＴ中間産物の分解性、資化性
ＰＥＴの分解に際して分解産物として生じる可能性のあるテレフタル酸二ナトリウム塩（ＴＰＡ・２Ｎａ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）の３種の化合物の分解性、資化性について調べた。

３．１ テレフタル酸二ナトリウム塩（ＴＰＡ・２Ｎａ）の分解性、資化性
終濃度が１、２、４、１０ｍＭとなるように培地にＴＰＡ・２Ｎａ（東京化成）を溶解させ、中試験管に分注しオートクレーブ滅菌を行った。そこに前培養したＮｏ．２０１−Ｆ６株を植菌し、振盪培養（２８５往復／分、３０℃）を行った。植菌後、経時的に培養液を回収し、Ａ_６６０を測定後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、２分）し、その上清２μＬをＴＬＣ板（２５ ＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｈｅｅｔｓ ２０×２０ｃｍ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ_２５４、Ｍｅｒｃｋ Ｌｔｄ． Ｊａｐａｎ）にスポットし、ヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝５：４：１を展開溶媒として用いて展開を行った。展開終了後、ＵＶ照射により検出した。

図３に示すように、各培養液のＡ_６６０は培養２日目に最大の値に達しており、ＴＰＡ・２Ｎａの濃度が高くなるにつれて菌の生育はよくなった。ＴＰＡ・２Ｎａのスポットは培養２〜３日目に消失した。

以上より、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株はＴＰＡ・２Ｎａを分解し、資化することが示された。

３．２ エチレングリコール（ＥＧ）の資化性
終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）となるように培地にＥＧを加え、中試験管に分注し、オートクレーブ滅菌を行った。前培養したＮｏ．２０１−Ｆ６株をＥＧを培地中に含むものと含まないものとに植菌し、振盪培養（２８５往復／分、３０℃）を行った。

その結果、ＥＧを含まない培地に比較した場合、ＥＧを含む培地での濁度の上昇は確認できなかった。このことから、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株はＥＧを資化しないことが示された。

３．３ ビス（２−ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）の分解性
ＢＨＥＴ（東京化成）を２０ｍｇ／ｍＬとなるように７０％エタノールに溶解させ、２日間以上振盪し滅菌した。オートクレーブ滅菌をした培地４．０ｍＬに終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように上記滅菌済みＢＨＥＴ溶液を無菌的に加えた。そして、一晩振盪（２８５往復／分、３０℃）後、前培養したＮｏ．２０１−Ｆ６株を植菌した。振盪培養（２８５往復／分、３０℃）を行い、経時的に培養液を回収し、遠心（１５，０００ｒｐｍ、２分）後、その上清２．０μＬをＴＬＣ板にスポットし、展開を行った。展開終了後、ＵＶ照射により検出した。

その結果、ＢＨＥＴのスポットが培養４日後に完全に消失した。培養１日目には、モノヒドロキシエチルテレフタレート（ＴＡ−ＥＧ）のスポットが現れ、４日目には消失した。そして、ＴＰＡ・２Ｎａのスポットは培養２日目に現れ、４日目以降はＴＰＡ・２Ｎａのスポットのみとなった。

ＢＨＥＴのスポットが消失したことから、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株はＢＨＥＴを分解すると考えられる。スポットの位置から、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株はＢＨＥＴを分解し、一旦、ＴＡ−ＥＧを生産し、その後、ＴＰＡ・２Ｎａまで分解を行うと考えられる。しかし、上記のＮｏ．２０１−Ｆ６株がＴＰＡ・２Ｎａ資化性を有するという結果と、ここで得られたＴＰＡ・２Ｎａが蓄積するという結果は一見矛盾するかのように思われた。この原因として菌体の問題が考えられた。詳細には、培養３日目になると菌の濁度は減少していたことから、培養３日目には菌の活性がなくなり、ＴＰＡ・２Ｎａを分解できなくなったのではないかと推察した。そこで以下の実験を行った。

Ｎｏ．２０１−Ｆ６株を、終濃度１ｍｇ／ｍＬのＢＨＥＴを含む培地で３日間振盪（２８５往復／分、３０℃）培養した。ＴＬＣ板上でＴＰＡ・２Ｎａのスポットが現れていることを確認した後、別に培養したＮｏ．２０１−Ｆ６株菌体を遠心（１０，０００ｒｐｍ、３分）し、滅菌した培地で懸濁し、上記のように３日間培養した試験管に植菌した。植菌後、振盪（２８５往復／分、３０℃）培養し、経時的に培養液を回収し、遠心（１５，０００ｒｐｍ、２分）後、その上清２．０μＬをＴＬＣ板にスポットし、展開を行った。展開終了後、ＵＶ照射により検出した。

その結果、新鮮なＮｏ．２０１−Ｆ６菌体を添加した翌日、つまり４日目には、３日目のサンプルに蓄積していたＴＰＡ・２Ｎａのスポットは消失していた（図４）。このように、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株はＢＨＥＴを分解して生じたＴＡ−ＥＧ、ＴＰＡ・２Ｎａをさらに分解する能力を有することが示された。

Ｎｏ．２０１−Ｆ６株によるＰＥＴフィルムの分解
ｉｓｏＰＥＴフィルムの存在下でＮｏ．２０１−Ｆ６株をＭＬＥ培地を用いて１６日間培養した。培養後にフィルム重量を測定したところ、重量損失は１１．７８ｍｇであった。この値に基づいて、１日当たり単位面積当たりの分解量は０．１３ｍｇ／ｃｍ^２・日と算出された。

さらに、ｉｓｏＰＥＴフィルムまたはテレフタル酸共重合非晶質ＰＥＴフィルム（ｔｅｒｅＰＥＴフィルム、１．４×２．０ｃｍ）の存在下でＮｏ．２０１−Ｆ６株を培養し、重量損失およびｐＨの経時的変化を調べた。すなわち、培養１、２、４、５、７、９、１１、１４日目に、ｉｓｏＰＥＴフィルム、ｔｅｒｅＰＥＴフィルムを回収し、その重量を測定すると共に、培養上清のｐＨを測定した。

Ｎｏ．２０１−Ｆ６株は、ｉｓｏＰＥＴフィルム、ｔｅｒｅＰＥＴフィルムのどちらの場合でもほぼ同程度の厚さのバイオフィルムをＰＥＴフィルム上に形成した。分解量の点ではｉｓｏＰＥＴフィルムとｔｅｒｅＰＥＴフィルムの間で違いはなく、ほぼ同程度の分解量を示した。しかし、培養上清のｐＨには差異が見られた。すなわち、両者ともｐＨの低下が生じたが、ｉｓｏＰＥＴフィルムで培養したほうがｐＨの低下が大きかった（図５）。これは分解産物の差に起因する可能性がある。１４日間培養した後の、分解により白化したＰＥＴフィルムの表面写真を図６に示す。

以上より、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株はｉｓｏＰＥＴフィルムおよびｔｅｒｅＰＥＴフィルムを同等に分解することが示された。

テレフタル酸誘導体の分解性
Ｎｏ．２０１−Ｆ６株の、種々のテレフタル酸誘導体を分解する能力について調べた。４ｍＭのテレフタル酸誘導体（プロトカテク酸（ＰＣＡ）、エチル−４−ヒドロキシベンゾエート（ＥＨＢ）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（ＨＢ）、４−メチルカテコール（ＭＣ）、ジメチルテレフタレート（ＤＭＴ）、モノメチルテレフタレート（ＭＭＴ）、テレフタルアルデヒド（ＴＡＤ）、エチル−３，４−ジヒドロキシベンゾエート（ＥＤＢ）、イソフタル酸（ｉｓｏＰＡ））、テレフタル酸（ＴＰＡ）またはテレフタル酸二ナトリウム塩（ＴＰＡ・２Ｎａ）を含む培地を４．０ｍＬずつ中試験管に分注し、オートクレーブ滅菌を行った。滅菌後、培養中のｉｓｏＰＥＴフィルムからＮｏ．２０１−Ｆ６株を剥ぎ取り、等量をそれぞれの中試験管に植菌し、振盪培養（２８５往復／分、３０℃）を行った。培養１、２日後にそれぞれ試料を回収した。回収した試料２．０μＬをＴＬＣ板にスポットし、展開を行い、ＵＶ照射によりスポットの検出を行った。結果を図７に示す。図中（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）はそれぞれ培養０、１、２日後の試料についての結果を示す。またレーン１〜１２はそれぞれ、ＴＰＡ・２Ｎａ、ＰＣＡ、ＥＨＢ、ＨＢ、ＭＣ、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ＴＡＤ、ＥＤＢ、ＴＰＡ、ｉｓｏＰＡおよびＴＰＡ・２Ｎａについての結果を示す。

オートクレーブにより、ＤＭＴがエステル分解し、ＭＭＴに変化した。従って、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株によるＤＭＴの分解能を確認することはできなかった。ＤＭＴ以外では、培養２日後に、ＰＣＡ、ＴＡＤ、ＥＤＢ、ｉｓｏＰＡの４種類を除く６種の化合物（ＥＨＢ、ＨＢ、ＭＣ、ＭＭＴ、ＴＰＡ、ＴＰＡ・２Ｎａ）が分解された。分解が観察されなかった４種類の化合物のうち、ＰＣＡ、ＴＡＤおよびＥＤＢの分解性に関してはさらなる確認が必要である。イソフタル酸（ｉｓｏＰＡ）を分解しなかったことから、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株はカルボキシル基がメタ位に存在する化合物を分解できないのではないかと考えられる。Ｎｏ．２０１−Ｆ６株をｉｓｏＰＥＴフィルムに作用させた培養上清には未知のスポットが観察されるが、上記結果から、これはイソフタル酸誘導体である可能性が示唆された。

本発明により、新規な芳香族ポリエステル分解能を有する細菌およびこれを用いた芳香族ポリエステル分解方法が提供される。

Ｎｏ．２０１−Ｆ６株の形態を示す図である。 １６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく系統推定の結果を示す図である。 種々の濃度のＴＰＡ・２Ｎａを含む培地でのＮｏ．２０１−Ｆ６株の増殖曲線である。 Ｎｏ．２０１−Ｆ６株によるＢＨＥＴ分解産物のＴＬＣ分析の結果を示す図である。 Ｎｏ．２０１−Ｆ６株によるＰＥＴフィルムの分解および培養上清のｐＨの経時変化を示す図である。 Ｎｏ．２０１−Ｆ６株によるｔｅｒｅＰＥＴフィルムおよびｉｓｏＰＥＴフィルムの分解を示す図である。 Ｎｏ．２０１−Ｆ６株による種々のテレフタル酸誘導体の分解のＴＬＣ分析の結果を示す図である。

SEQ ID NO:1: A primer 8-27 fwd for amplification of 16S rDNA
SEQ ID NO:2: A primer 1525 rev for amplification of 16S rDNA

Claims (15)

1. 芳香族ポリエステル分解細菌Ｎｏ．２０１−Ｆ６株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３１４）。
2. 配列番号３の１２〜１４６２位に示す塩基配列と９７％を超える相同性を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有し、かつ芳香族ポリエステル分解能を有する細菌。
3. 芳香族ポリエステルの存在下で芳香族ポリエステル分解能を有する細菌を培養する工程を包含する、芳香族ポリエステル分解方法。
4. 芳香族ポリエステルがポリエチレンテレフタレートである、請求項３記載の方法。
5. 芳香族ポリエステル分解能を有する単一の細菌を培養する、請求項３記載の方法。
6. 芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３１４）である、請求項３記載の方法。
7. 芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、Ｎｏ．２０１−Ｆ６株（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−３１４）由来の変異株である、請求項３記載の方法。
8. 芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、配列番号３の１２〜１４６２位に示す塩基配列と９７％を超える相同性を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有し、かつ芳香族ポリエステル分解能を有する細菌である、請求項３記載の方法。
9. 芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、さらにビス（２−ヒドロキシエチル）テレフタレートをモノヒドロキシエチルテレフタレートに分解する能力を有する、請求項３記載の方法。
10. 芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、さらにモノヒドロキシエチルテレフタレートをテレフタル酸二ナトリウム塩に分解する能力を有する、請求項３記載の方法。
11. 芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、さらにテレフタル酸二ナトリウム塩を分解する能力を有する、請求項３記載の方法。
12. 芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、さらにエチル−４−ヒドロキシベンゾエート、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、４−メチルカテコール、モノメチルテレフタレート、テレフタル酸およびテレフタル酸二ナトリウム塩からなる群より選択される化合物を分解する能力を有する、請求項３記載の方法。
13. 芳香族ポリエステル分解能を有する細菌が、イソフタル酸を分解する能力を有しない、請求項３記載の方法。
14. 芳香族ポリエステル分解産物を回収する工程をさらに包含する、請求項３記載の方法。
15. 芳香族ポリエステル分解産物が、ビス（２−ヒドロキシエチル）テレフタレート、モノヒドロキシエチルテレフタレートまたはテレフタル酸二ナトリウム塩である、請求項１４記載の方法。

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