JP4753210B2 - 微生物を用いた芳香族ポリエステルの分解方法 - Google Patents
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Description
また、テレフタル酸、p−ヒドロキシ安息香酸等の芳香族成分を有するポリエステルであっても、含有される芳香族成分が少量であったり、耐熱性が著しく低下していたりする場合には、一般土壌中や活性汚泥中の微生物や既知酵素により生分解可能であることが知られている。しかしながら、ポリエチレンテレフタレート(以下、PETと略記することがある。)のように芳香族成分を主成分とする芳香族ポリエステルを分解する微生物及び酵素はほとんど知られておらず、わずかに、PET繊維やPET織布を酵素で処理することにより、親水性の向上などの表面改質を行うことが提案されているが(特許文献1および特許文献2参照)、PETが分解されていることを明確に示すデータはない。
このようなことから、PETを分解する際には高濃度の水酸化ナトリウム水溶液に代表される強塩基性下で加熱処理する方法が一般的である。
1. テレフタル酸を分解する能力を有するピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)。
2. リゾビウムsp.OKH−03(FERM BP−10547)の芳香族ポリエステル分解能力を向上させうる能力を有する、ピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)とバシラス メガテリューム(NITE BP−67)とシュードモナスsp.(NITE BP−64)とアルファプロテオバクテリア綱(NITE BP−66)を含む微生物群。
3. リゾビウムsp.OKH−03(FERM BP−10547)および上記2に記載された微生物群を、芳香族ポリエステルに接触させて該芳香族ポリエステルを分解させることを特徴とする、芳香族ポリエステルの分解方法。
4. 芳香族ポリエステルが、エチレンテレフタレート繰り返し単位を95重量%以上含むポリエステルである、上記3記載の分解方法。
5. 微生物と芳香族ポリエステルとの接触をLE培地中で行う、上記3記載の分解方法。
6. 微生物と芳香族ポリエステルとの接触を20℃〜37℃の範囲で行う、上記3記載の分解方法。
7. 微生物と芳香族ポリエステルとの接触をpH5〜9の範囲で行う、上記3記載の分解方法。
8. 微生物と芳香族ポリエステルとの接触を、微生物を芳香族ポリエステルに吸着させ、バイオフィルムを形成させることにより行う、上記3記載の分解方法。
特に、ピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)が存在すると、芳香族ポリエステル分解時に発生するテレフタル酸を分解する能力を有するのでポリエステルの分解能を高めることが出来る。
本発明において、分解の対象となる芳香族ポリエステルとは、芳香族ジカルボン酸と脂肪族ジオール成分からなる繰り返し単位を50重量%以上含むポリエステルである。特にエチレンテレフタレート繰り返し単位を85重量%以上含む芳香族ポリエステルが好ましい。この時に、共重合してよい成分としては、例えばテレフタル酸以外のジカルボン酸成分としてフタル酸、イソフタル酸、ジフェニルジカルボン酸、ジフェノキシエタンジカルボン酸、2,6−ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸及びその誘導体、コハク酸、アジピン酸、アゼライン酸、セバチン酸、デカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸及びその誘導体が挙げられる。
また、エチレングリコール以外のジオール成分としては、例えばジエチレングリコール、トリメチレングリコール、テトラメチレングリコール、プロピレングリコール、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコール、デカメチレングリコール等が例示される。
この芳香族ポリエステルは、分解時において、例えば繊維状、フィルム状、塊状、これらの混合体など、どのような形態をもっていてもよい。
本発明の微生物群は、ピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)、バシラス メガテリューム(NITE BP−67)、シュードモナスsp.(NITE BP−64)およびアルファプロテオバクテリア綱(NITE BP−66)を含有してなる。
上記の菌株群は、本発明者らが日本国内の土壌から新たに分離した菌株であり、以下の菌学的性質を有する。
なお、リゾビウムsp.OKH−03の菌学的性質を表2に、また、その化学分類学的性質・リボソーマルDNAの配列は別添の配列番号5に示すとおりである。
これらの微生物はバイオセーフティーレベルIであり病原性が無いことから、この菌株を用いることにより、生物学的にも安全に作業を行うことが可能である。
また、リゾビウムsp.OKH−03については、平成15年8月11日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1−1−1中央第6)に寄託している(受託番号はFERM P−19483である)。更にこの菌株は、平成16年3月3日付けでブダペスト条約に基づく寄託への移管請求を行い、受領された(受託番号はFERM BP−10547である。)。
本発明の菌類はそれぞれ、リゾビウムsp.OKH−03の芳香族ポリエステル分解能力を補完することによってその分解性を高めることが出来るが、例えば、ピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)は、特に分解時に発生するオリゴマーやモノマー、特にテレフタル酸を分解する能力を有するのでポリエステルの分解能を高めることが出来る。
芳香族ポリエステルを特異的に分解する微生物は、土壌、雨水等をサンプリングし、これを公知の方法で適宜選別することで単離される。このとき用いる土壌、雨水などは特に、芳香族ポリエステル廃棄物集積所やゴミ箱などからサンプリングすることが好ましい。
ついで、培地としては芳香族ポリエステルを唯一の炭素源として含有するものを用いる(以下、この培地を芳香族ポリエステル培地と記載することがある。)。
他の窒素源、ミネラル源等としては、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸マグネシウム等の金属塩及びその水和物を用いることができる。
培養の方法としては、例えば振盪培養、静置培養等が挙げられるが、微生物の混合系から特定の微生物を取得するには振盪培養が好ましく、なかでも栄養源を限定して培養を行う集積培養法を併用するのが特に好ましい。
土壌等からサンプリングしたサンプルを、前記培地で培養し、所定期間毎に培地を交換して有用細菌を集積させる。
培養期間に特に制限はないが、例えば1〜2ヶ月程度が好ましい。次いで集積培養液中の芳香族ポリエステルを採取し、微生物の芳香族ポリエステル分解活性を評価する。評価方法としては特に制限はないが、例えば走査型電子顕微鏡による表面観察は簡便で確実性も高いため好ましい。
次いで、一次選別された菌株から、リゾビウムsp.OKH−03の芳香族ポリエステル分解能に関与する菌株を選別する(二次選別)。リゾビウムsp.OKH−03が芳香族ポリエステルを分解するためには、1)芳香族ポリエステルへの菌の付着、2)芳香族ポリエステル鎖の分解、3)芳香族ポリエステルオリゴマーおよびモノマーの分解、という過程を経ると推測される。これらの各段階においてリゾビウムsp.OKH−03の分解能力を補佐する菌株を二次選別により得ることが出来る。
本発明の菌株であるバシラス メガテリューム(NITE BP−67)、シュードモナスsp.(NITE BP−64)、アルファプロテオバクテリア綱(NITE BP−66)は、一次選別した菌株を対数増殖期まで増殖させ、集菌した大量の菌体を芳香族ポリエステル培地中にリゾビウムsp.OKH−03とともに植菌する等の方法で培養した後、これらのバイオフィルム生成能を確認することにより、リゾビウムsp.OKH−03の芳香族ポリエステル分解能力を向上させる菌株群として得ることができる。
本発明の分解方法は、芳香族系ポリエステル分解能を有する菌株に対して、本発明の微生物を組合せて用いることで、芳香族ポリエステルを安全にかつ二酸化炭素までより高速度で確実に分解することが出来る。
本発明の分解方法では、前記微生物群と芳香族ポリエステルが確実に接触し、且つ、微生物群が維持される状態が形成されればよいが、特に、本発明の微生物群が存在する水溶液中に分解対象とする芳香族ポリエステルを浸漬させることにより行うことが好ましい。
ここで添加する無機化合物としては、例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸マグネシウム等の金属塩及びその水和物が挙げられる。
また、微生物と芳香族ポリエステルとを接触させる温度としては、20〜37℃の範囲が好ましく、更に好ましくは25〜35℃、特に好ましくは30℃である。
また、接触させるときのpHは5〜9の範囲が好ましい。pHをこの範囲に調整するためには、例えば水溶液に芳香族ポリエステルを浸漬させて接触させる場合には、該水溶液中に、塩酸、硫酸等の無機酸、水酸化ナトリウ厶、水酸化カリウム等の無機塩基及びその水溶液を用いるのが好ましく、また、りん酸緩衝液等の各種緩衝液を用いるのも好ましい。
また、本発明の微生物と芳香族ポリエステルとの接触の際に、微生物を芳香族ポリエステルに吸着させ、芳香族ポリエステル表面にバイオフィルムを形成させることが好ましい。ここでいうバイオフィル厶とは微生物とその排出物からなる層状物質のことであり、これによって本発明の微生物が芳香族ポリエステルに強固に接着し、目つ、芳香族ポリエステルを分解する場を形成することになる。
また、本発明の微生物と芳香族ポリエステルとを接触させる期間は少なくとも24時間あればよいが、目標とする芳香族ポリエステルの分解量に応じて、任意の期間を設定することができる。なお、接触期間が2週間以上に及ぶ場合には2週間ごとに水溶液を新しいものに交換することが望ましい。
このような方法により、自然界においてはほとんど分解することの無い芳香族ポリエステルの分解を0.5〜4ケ月程度の短期間で行うことができる。
以上のとおり、本発明の芳香族ポリエステルを特異的に分解する能力を有する微生物を用いれば、安全かつ安価で比較的速やかに、芳香族ポリエステルを温和な条件で分解することができる
PETフィルムを、0.1規定の塩酸水溶液に3時間浸漬した後、70重量%エタノール水溶液に12時間以上浸漬し、そして無菌状態下で乾燥させた。このようにして滅菌処理した寸法1.4cm×2.0cm、重量68.6mgのPETフィルムを準備した。表3に記載の成分よりなるpH7.0の水溶液培地10mlと、リゾビウムsp.OKH−03(寄託番号FERM BP−10547)、ピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)、バシラス メガテリューム(NITE BP−67)、シュードモナスsp.(NITE BP−64)、アルファプロテオバクテリア綱(NITE BP−66)を含む培養液1mlとを併せて、シリコン栓をつけた内径18mmの試験管に封入した。
好気条件を保った状態で、横振り振盪培養機を用いて30℃、300ストローク/分の条件で振盪し、2週間毎に試験管内の溶液を新規なものと交換しながら、延べ35日間振盪培養を行った。
試験管内からPETフィルムを取り出し、70重量%エタノール水溶液中で20分間超音波処理することにより、フィルム表面に付着した菌体及び菌体排出物を除去した。
次いで、このPETフィルムを室温、真空下で24時間以上乾燥させた後に、重量を測定したところ、分解処理後のPETフィルムの重量は35.7mgであり、減量率は48.0%、フィルムの片面の面積を基準とした場合の分解速度は0.34mg/cm2・日であった。
イソフタル酸共重合PETフィルムを、0.1規定の塩酸水溶液に3時間浸漬した後、70重量%エタノール水溶液に12時間以上浸漬し、無菌状態下で乾燥させた。このようにして滅菌処理した寸法1.2cm×1.5cm、重量66.3mgの10%イソフタル酸共重合PETフィルムを準備した。表3に記載の成分よりなるpH7.0の水溶液培地10mlと、リゾビウムsp.OKH−03(寄託番号FERM BP−10547)、ピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)、バシラス メガテリューム(NITE BP−67)、シュードモナスsp.(NITE BP−64)、アルファプロテオバクテリア綱(NITE BP−66)を含む培養液1mlとを併せて、シリコン栓をつけた内径18mmの試験管に封入した。
好気条件を保った状態で、横振り振盪培養機を用いて30℃、300ストローク/分の条件で振盪し、2週間毎に試験管内の溶液を新規なものと交換しながら、延べ30日間振盪培養を行った。
試験管内からイソフタル酸共重合PETフィルムを取り出し、70重量%エタノール水溶液中で20分間超音波処理することにより、フィルム表面に付着した菌体及び菌体排出物を除去した。
次いで、このイソフタル酸共重合PETフィルムを室温、真空下で24時間以上乾燥させた後に、重量を測定したところ、分解処理後のフィルムの重量は40.6mgであり、減量率は39%、フィルムの片面の面積を基準とした場合の分解速度は0.48mg/cm2・日であった。
テレフタル酸二ナトリウム塩を4.8mM含む表2記載の培地10mlにピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)を含む培養液1mlを併せて、シリコン栓をつけた内径18mmの試験管に封入した。好気条件を保った状態で、横振り振盪培養機を用いて30℃、300ストローク/分の条件で振盪し、2日間培養を行った。
試験管から培養液を取り出し、TLCを用いてテレフタル酸の検出を行ったところ、テレフタル酸を示すスポットは確認されなかった。
実施例1において、寸法が1.4cm×2.0cmであり、初期重量60.7mgのPETフィルムを用い、リゾビウムsp.OKH−03(寄託番号FERM BP−10547)のみを含む培養液1mlを添加した以外は、同様の操作を行ったところ、55日間でPETフィルムの重量は56.2mgであり、減量率は7.4%、フィルムの片面の面積を基準とした場合の分解速度は0.029mg/cm2・日であった。
実施例1において、寸法が1.4cm×2.0cmであり、初期重量60.7mgのPETフィルムを用い、菌を含む培養液を添加しなかったこと以外は、同様の操作を行ったところ、PETフィルムの重量は60.7mgであり、有意な重量減少は認められなかった。また、図2に示すとおり、電子顕微鏡による目視観察でも表面は分解されていないことが確認された。
実施例3において、ピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)を含まないこと以外は同様の操作を行ったところ、TLCによって、培養初期と同濃度のテレフタル酸が検出された。
Claims (8)
- テレフタル酸を分解する能力を有するピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)。
- リゾビウムsp.OKH−03(FERM BP−10547)の芳香族ポリエステル分解能力を向上させうる能力を有する、ピグメンティファーガsp.(NITE BP−65)、バシラス メガテリューム(NITE BP−67)とシュードモナスsp.(NITE BP−64)とアルファプロテオバクテリア綱(NITE BP−66)を含む微生物群。
- リゾビウムsp.OKH−03(FERM BP−10547)および請求項2に記載された微生物群を、芳香族ポリエステルに接触させて該芳香族ポリエステルを分解させることを特徴とする、芳香族ポリエステルの分解方法。
- 芳香族ポリエステルが、エチレンテレフタレート繰り返し単位を95重量%以上含むポリエステルである、請求項3記載の分解方法。
- 微生物と芳香族ポリエステルとの接触をLE培地中で行う、請求項3記載の分解方法。
- 微生物と芳香族ポリエステルとの接触を20℃〜37℃の範囲で行う、請求項3記載の分解方法。
- 微生物と芳香族ポリエステルとの接触をpH5〜9の範囲で行う、請求項3記載の分解方法。
- 微生物と芳香族ポリエステルとの接触を、微生物群を芳香族ポリエステルに吸着させ、バイオフィルムを形成させることにより行う、請求項3記載の分解方法。
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