KR102652220B1 - 1,4-디옥산 분해능이 우수한 시넬라 그래뉼리 ck-4 균주 및 이를 이용한 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법 - Google Patents
1,4-디옥산 분해능이 우수한 시넬라 그래뉼리 ck-4 균주 및 이를 이용한 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 1,4-디옥산 분해능이 우수한 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주 및 이를 이용한 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법에 관한 것이다.
본 발명의 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주는 1,4-디옥산 분해능이 우수하며, 상대적으로 고농도의 1,4-디옥산에 노출되는 경우에도 생존이 가능할 뿐만 아니라 1,4-디옥산을 효율적으로 분해할 수 있다.
또한, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주 및/또는 이의 배양액은 종래에 사용되고 있는 1,4-디옥산의 화학적 처리 방법의 문제점 즉, 새로운 시설장비 설치, 고가의 유지비용, 및 처리 후 생성되는 다양한 부산물들에 의한 환경오염 등을 해결할 수 있기 때문에, 1,4-디옥산 분해용 조성물 또는 폐수처리장치용 첨가제 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주는 1,4-디옥산 분해능이 우수하며, 상대적으로 고농도의 1,4-디옥산에 노출되는 경우에도 생존이 가능할 뿐만 아니라 1,4-디옥산을 효율적으로 분해할 수 있다.
또한, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주 및/또는 이의 배양액은 종래에 사용되고 있는 1,4-디옥산의 화학적 처리 방법의 문제점 즉, 새로운 시설장비 설치, 고가의 유지비용, 및 처리 후 생성되는 다양한 부산물들에 의한 환경오염 등을 해결할 수 있기 때문에, 1,4-디옥산 분해용 조성물 또는 폐수처리장치용 첨가제 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 1,4-디옥산 분해능이 우수한 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주 및 이를 이용한 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법에 관한 것이다.
산업이 급속도로 발전함에 따라 사용되는 유기화학물질의 종류가 다양해질 뿐만 아니라, 이들 화학물질의 사용량도 매년 크게 증가하고 있다. 이에 따른 환경오염 문제도 증가하고 있으며, 특히 산업체에서 방류되는 산업폐수로 인한 수질오염 문제가 지속적으로 제기되고 있다 (Ministry of Environment, 2019). 1,4-디옥산은 최근 수계에서 주목받고 있는 오염물질로서, 염소계 용매의 안정제와 광택제, 코팅제, 접착제 등의 원료인 cellulose acetate, ethyl cellulose, benzyl cellulose 등을 용해시키는 용매로서 뿐만 아니라 (Anderson et al., 2012; U.S. Department of Health, 2016), 화장품, 의약품 제조, 고무화학 등 여러 산업 분야에서 용매로 사용되며 (ATSDR 2012; U.S. EPA, 2006), 폴리에스터 및 계면활성제 등의 제조 공정에서 부산물로 생성된다 (Popoola et al., 1991; Zenker et al., 2003). 1,4-디옥산은 화학적으로 안정한 고리형태의 에테르 화합물로서, 물에 쉽게 용해되며, 가연성으로, 빛에 장기간 노출 시 폭발성의 과산화물(peroxides)을 형성할 수 있다 (U.S. EPA, 2006). 토양, 유기물 등에 잘 흡착되지 않기 때문에 인근 하천이나 지하수로 쉽게 유입될 수 있으며, 하천과 지하수 등으로 유입된 1,4-디옥산은 광범위한 지역에서 오염원이 될 수 있다고 알려져 있다 (Han et al., 2012; Kim et al., 2009).
1,4-디옥산은 인간과 동물에서 눈과 호흡기에 질병을 유발하고, 고농도의 1,4-디옥산에 노출 시 단시간에 신장과 간에 심각한 손상을 유발하며, 직업적으로 피부 또는 점막에 노출되거나 흡입한 사람들에서 신장에 건강상의 문제를 일으키는 것으로 보고되었다 (National Industrial Chemicals, 1998). 국제 암 연구기관(International Agency for Research on Cancer)에서는 1,4-디옥산을 인간에서 발암 가능성이 있는 물질인 Group 2B로 분류하고 있다 (National Toxicology Program, 1978). 세계 보건기구(WHO)는 2006년부터 음용수에 대한 지침으로, 1,4-디옥산 농도를 50 ㎍/L로 규제하였으며 (WHO, 2005), 우리나라에서도 2012년부터 음용수에 대한 1,4-디옥산의 허용농도를 50 ㎍/L 이하로, 그리고 산업폐수의 방류는 5 mg/L 이하로 규제하고 있다.
1,4-디옥산은 대부분 화학적 방법으로 처리하고 있으나, 산화제 또는 촉매 등을 사용하기 때문에 이 화합물을 제거하기 위해서 추가적인 작업이 요구된다. 또한 높은 에너지 소비, 높은 운영비용, 폐수의 탁도와 환원성 화합물의 존재에 의한 반응 효율 감소 등으로 인한 2차 오염과 경제적으로 비용 부담을 발생시킬 수 있다 (Adams et al., 1994; Andreozzi et al., 1999; Kosaka et al., 2000). 이러한 문제점들을 극복하기 위해서, 1,4-디옥산의 미생물학적 처리가 운전비용이 저렴하면서 기존의 폐수 처리 시설에도 쉽게 적용할 수 있는 친환경인 정화 기술로서 주목받고 있다.
최근, 1,4-디옥산의 미생물학적 처리를 위해, 1,4-디옥산 분해능이 있는 균주들에 대한 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 기존의 1,4-디옥산 분해능을 갖는 균주들은 고농도의 1,4-디옥산에 노출되는 경우에는 1,4-디옥산을 분해하지 못하고 오히려 사멸하게 되므로, 저농도의 1,4-디옥산 함유 폐수에서만 운용이 가능한 한계가 있어, 실제 폐수처리 시스템에 적용하기에는 부적합하였다.
또한, 스케일-업(scale-up)을 위해 생물반응기에서 1,4-디옥산의 미생물학적 처리에 대한 연구가 진행되었으나, 이 경우에도 300 mg/L 이하의 1,4-디옥산을 제거하는 정도에 그쳐, 고농도의 1,4-디옥산 함유 폐수를 처리하기에는 한계가 있었다.
본 발명자들은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 자연계에서 고농도의 1,4-디옥산을 효율적으로 분해하는 신규한 미생물 균주, 바람직하게는 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주를 동정하였고, 상기 균주 및/또는 이의 배양물의 이용 방법, 및 최적화된 1,4-디옥산 분해 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은 1,4-디옥산 분해능을 갖는 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P)를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 1,4-디옥산 분해용 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 폐수처리장치용 첨가제 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 1,4-디옥산 함유 폐수에 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 혼합하는 단계;를 포함하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P)는 1,4-디옥산 분해능이 있다.
상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 포함한다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 1,4-디옥산 분해용 조성물은 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 폐수처리장치용 첨가제 조성물은 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법은 1,4-디옥산 함유 폐수에 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 혼합하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 폐수는 1,4-디옥산을 5 내지 3000 mg/L 농도로 포함할 수 있다.
상기 폐수에 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF)을 추가로 혼합할 수 있다.
상기 테트라하이드로퓨란은 20 내지 200 mg/L 농도로 혼합될 수 있다.
상기 혼합하는 단계는 공기가 지속적으로 주입되는 생물반응기에서 이루어질 수 있다.
상기 생물반응기는 온도가 20 내지 35 ℃; 통기량이 0.5 내지 3.0 L/min; 및 교반속도가 200 내지 800 rpm인 조건으로 작동되는 것일 수 있다.
본 발명의 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주는 1,4-디옥산 분해능이 우수하며, 상대적으로 고농도의 1,4-디옥산에 노출되는 경우에도 생존이 가능할 뿐만 아니라 1,4-디옥산을 효율적으로 분해할 수 있다.
또한, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주 및/또는 이의 배양액은 종래에 사용되고 있는 1,4-디옥산의 화학적 처리 방법의 문제점 즉, 새로운 시설장비 설치, 고가의 유지비용, 및 처리 후 생성되는 다양한 부산물들에 의한 환경오염 등을 해결할 수 있기 때문에, 1,4-디옥산 분해용 조성물 또는 폐수처리장치용 첨가제 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P)의 유전학적 계통수(Phylogenetic tree)를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 다양한 1,4-디옥산 농도에서의 사멸률을 나타내는 그래프이다. 각 균주는 0(●), 5,000(■), 10,000(▲), 15,000(◆) 및 20,000(▼) mg/L의 1,4-디옥산에 168시간 동안 노출되었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 1,4-디옥산으로 처리된 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 주사전자현미경 사진으로, (a)는 1,4-디옥산으로 처리되지 않은 세포; (b)는 10,000 mg/L의 1,4-디옥산으로 24시간 동안 처리된 세포; (c)는 20,000 mg/L의 1,4-디옥산으로 24시간 동안 처리된 세포를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 250 mL 플라스크 내에서의 다양한 농도의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 각 균주는 1,000(●), 5,000(■), 10,000(▲), 15,000(◆) 및 20,000(▼) mg/L의 1,4-디옥산에서 배양되었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 5(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 1,4-디옥산에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 5(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 각 균주는 1,000(○,●), 2,000(□,■) 및 3,000(△,▲) mg/L의 1,4-디옥산에서 배양되었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 6(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 온도에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 6(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 온도에서의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 각 균주는 10 ℃ (○,●), 20 ℃ (□,■) 및 30 ℃ (△,▲)에서 배양되었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 7(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 통기량에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 6(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 통기량에서의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 통기량은 각각 0.5 (○,●), 1.5 (□,■) 및 2.5 (△,▲) L/min이었고, 1,4-디옥산의 초기 농도는 1,000 mg/L이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 8(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 교반속도에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 6(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 교반속도에서의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 교반속도는 각각 100 (○,●), 300 (□,■) 및 500 (△,▲) rpm이었고, 1,4-디옥산의 초기 농도는 1,000 mg/L이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 9(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 테트라히드로퓨란(THF) 존재 하에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 6(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 테트라히드로퓨란(THF) 존재 하에서의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 테트라히드로퓨란(THF) 농도는 각각 0 (○,●), 50 (□,■), 100 (△,▲) 및 500 (◇,◆) mg/L이었고, 1,4-디옥산의 초기 농도는 1,000 mg/L이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 온도의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 온도는 각각 10 ℃ (●), 20 ℃ (■) 및 30 ℃ (▲)로 조정되었다. 상기 생물반응기의 통기량 및 교반속도는 1.5 L/min 및 300 rpm이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 통기량에서의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 통기량은 각각 0.5 (●), 1.5 (■) 및 2.5 (▲) L/min로 조정되었다. 상기 생물반응기의 온도 및 교반속도는 30 ℃ 및 300 rpm이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 교반속도에서의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 교반속도는 각각 100 (●), 300 (■) 및 500 (▲) rpm으로 조정되었다. 상기 생물반응기의 온도 및 통기량은 30 ℃ 및 1.5 L/min이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 테트라히드로퓨란(THF) 존재 하에서의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 테트라히드로퓨란(THF) 농도는 각각 0 (●), 50 (■), 100 (▲) 및 150 (◆) mg/L이었다. 상기 생물반응기의 온도, 통기량 및 교반속도는 30 ℃, 1.5 L/min 및 300 rpm이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내에서의 인공폐수 내의 1,4-디옥산 분해능 (●) 및 이와 관련된 흡광도 (○) 및 pH (□)의 변화를 나타내는 그래프이다. 상기 균주는 1,4-디옥산 1,000 mg/L 및 부가탄소원인 테트라히드로퓨란(THF) 50 mg/L을 함유하는 인공 폐수에서 배양하였다. 상기 생물반응기의 온도, 통기량 및 교반속도는 30 ℃, 2.5 L/min 및 500 rpm이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내에서의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능 (●)을 나타내는 그래프이다. 상기 균주는 1,4-디옥산 797.1 mg/L 및 부가탄소원인 테트라히드로퓨란(THF) 50 mg/L을 함유하는 산업폐수에서 배양하였다. 상기 생물반응기의 온도, 통기량 및 교반속도는 30 ℃, 2.5 L/min 및 500 rpm이었다. 대조군은 (○)로 표시하였고, 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 다양한 1,4-디옥산 농도에서의 사멸률을 나타내는 그래프이다. 각 균주는 0(●), 5,000(■), 10,000(▲), 15,000(◆) 및 20,000(▼) mg/L의 1,4-디옥산에 168시간 동안 노출되었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 1,4-디옥산으로 처리된 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 주사전자현미경 사진으로, (a)는 1,4-디옥산으로 처리되지 않은 세포; (b)는 10,000 mg/L의 1,4-디옥산으로 24시간 동안 처리된 세포; (c)는 20,000 mg/L의 1,4-디옥산으로 24시간 동안 처리된 세포를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 250 mL 플라스크 내에서의 다양한 농도의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 각 균주는 1,000(●), 5,000(■), 10,000(▲), 15,000(◆) 및 20,000(▼) mg/L의 1,4-디옥산에서 배양되었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 5(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 1,4-디옥산에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 5(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 각 균주는 1,000(○,●), 2,000(□,■) 및 3,000(△,▲) mg/L의 1,4-디옥산에서 배양되었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 6(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 온도에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 6(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 온도에서의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 각 균주는 10 ℃ (○,●), 20 ℃ (□,■) 및 30 ℃ (△,▲)에서 배양되었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 7(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 통기량에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 6(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 통기량에서의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 통기량은 각각 0.5 (○,●), 1.5 (□,■) 및 2.5 (△,▲) L/min이었고, 1,4-디옥산의 초기 농도는 1,000 mg/L이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 8(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 교반속도에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 6(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 교반속도에서의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 교반속도는 각각 100 (○,●), 300 (□,■) 및 500 (△,▲) rpm이었고, 1,4-디옥산의 초기 농도는 1,000 mg/L이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 9(A)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 테트라히드로퓨란(THF) 존재 하에서의 생장을 나타내는 그래프이고, 도 6(B)는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 테트라히드로퓨란(THF) 존재 하에서의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 테트라히드로퓨란(THF) 농도는 각각 0 (○,●), 50 (□,■), 100 (△,▲) 및 500 (◇,◆) mg/L이었고, 1,4-디옥산의 초기 농도는 1,000 mg/L이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 온도의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 온도는 각각 10 ℃ (●), 20 ℃ (■) 및 30 ℃ (▲)로 조정되었다. 상기 생물반응기의 통기량 및 교반속도는 1.5 L/min 및 300 rpm이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 통기량에서의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 통기량은 각각 0.5 (●), 1.5 (■) 및 2.5 (▲) L/min로 조정되었다. 상기 생물반응기의 온도 및 교반속도는 30 ℃ 및 300 rpm이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 교반속도에서의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 교반속도는 각각 100 (●), 300 (■) 및 500 (▲) rpm으로 조정되었다. 상기 생물반응기의 온도 및 통기량은 30 ℃ 및 1.5 L/min이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내 다양한 농도의 테트라히드로퓨란(THF) 존재 하에서의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능을 나타내는 그래프이다. 테트라히드로퓨란(THF) 농도는 각각 0 (●), 50 (■), 100 (▲) 및 150 (◆) mg/L이었다. 상기 생물반응기의 온도, 통기량 및 교반속도는 30 ℃, 1.5 L/min 및 300 rpm이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내에서의 인공폐수 내의 1,4-디옥산 분해능 (●) 및 이와 관련된 흡광도 (○) 및 pH (□)의 변화를 나타내는 그래프이다. 상기 균주는 1,4-디옥산 1,000 mg/L 및 부가탄소원인 테트라히드로퓨란(THF) 50 mg/L을 함유하는 인공 폐수에서 배양하였다. 상기 생물반응기의 온도, 통기량 및 교반속도는 30 ℃, 2.5 L/min 및 500 rpm이었다. 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 벤치-규모 생물반응기 내에서의 산업폐수 내의 1,4-디옥산 분해능 (●)을 나타내는 그래프이다. 상기 균주는 1,4-디옥산 797.1 mg/L 및 부가탄소원인 테트라히드로퓨란(THF) 50 mg/L을 함유하는 산업폐수에서 배양하였다. 상기 생물반응기의 온도, 통기량 및 교반속도는 30 ℃, 2.5 L/min 및 500 rpm이었다. 대조군은 (○)로 표시하였고, 각 그래프는 3회 반복 시험한 데이터의 평균값(means±SEM)을 나타낸다.
본 발명은 신규한 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 및 상기 균주의 용도를 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 신규한 시넬라 그래뉼리 균주가 1,4-디옥산 분해능이 우수함을 규명하고, 특히 고농도의 1,4-디옥산 함유 폐수를 처리할 수 있음을 규명한 점에 특징이 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 1,4-디옥산 분해능을 갖는 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P)에 관한 것이다.
상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 포함하며, 상기 염기서열이 시넬라 그래뉼리 Ch06와 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다. 이에 본 발명자는 상기 균주를 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주로 명명하고, 2021년 10월 4일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC18920P).
상기 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 1,4-디옥산 분해능을 가지며, 고농도의 1,4-디옥산에 대한 저항성이 있음을 특징으로 한다. 구체적으로 상기 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 폐수에 함유된 1,4-디옥산 함량을 감소시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 폐수는 1,4-디옥산을 5 내지 3000 mg/L, 바람직하게는 100 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 300 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 400 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 500 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 600 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 700 내지 3000 mg/L 농도로 포함하는 것일 수 있다. 특히 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 1,4-디옥산을 500 mg/L, 바람직하게는 600 mg/L, 더욱 바람직하게는 700 mg/L 이상의 고농도로 함유하는 폐수로부터 1,4-디옥산을 제거할 수 있어, 실제 폐수처리 시스템에 적용하기에 적합하다.
또한, 본 발명은 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 1,4-디옥산 분해용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 상기 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축물, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 배양액은 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 배양 배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하고, 상기 균주를 포함하는 배양물이다.
상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여, 배양 대상 즉, 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것 일 수 있다. 상기 배지는 배양액이라고도 할 수 있고, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 배양한 배지로부터 분리하여 얻은 것일 수 있고, 상기 배지는 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주 균주가 성장할 수 있는 것이라면 한정되지 않고 이용할 수 있다.
구체적인 예시로서, 상기 배양 배지의 조성은 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 바람직하게는 기본배지(basal medium) 즉, 증류수 1L 당 0.5 내지 2.5g의 (NH4)2SO4; 0.1 내지 1.2g의 MgSO4ㆍ7H2O; 및 0.01 내지 1.2g의 CaCl2ㆍ2H2O를 첨가한 배지에,
추가적으로, 증류수 1L 당 0.5 내지 1.5g의 FeSO4ㆍ7H2O; 0.1 내지 0.5g의 ZnSO4ㆍ7H2O; 0.01 내지 0.05g의 MnSO4ㆍH2O; 0.01 내지 0.05g의 H3BO3, 0.01 내지 0.05g의 NiCl2ㆍ6H2O; 0.1 내지 0.5g의 EDTA; 0.01 내지 0.05g의 CoCl2ㆍ6H2O; 및 0.001 내지 0.005g의 CuCl2ㆍ5H2O를 함유한 미량금속염 용액 0.5 내지 2.0 mL을 첨가한 것일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축물, 상기 배양액의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나는 상기 1,4-디옥산 분해용 조성물에 포함되어 공급될 수도 있고, 장기간 보존을 위해 별도로 보관하였다가 사용 직전에 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 균주를 장기간 보존하기 위해 별도로 공급되는 경우에는 -70℃ 이하로 보존하거나 -20℃ 내지 -80℃에서 동결건조 보존하여 사용할 수 있다.
상기 조성물은 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 안정적인 제제화를 목적으로, 수화제, 입제 또는 캡슐제로 제제화하여 사용할 수 있고, 상기 종류에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 폐수처리장치용 첨가제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 “시넬라 그래뉼리 CK-4 균주 및/또는 이의 배양액”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 1,4-디옥산 함유 폐수에 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 혼합하는 단계;를 포함하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법에 관한 것이다.
본 발명의 “시넬라 그래뉼리 CK-4 균주 및/또는 이의 배양액”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
상기 폐수는 1,4-디옥산을 5 내지 3000 mg/L, 바람직하게는 100 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 300 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 400 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 500 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 600 내지 3000 mg/L, 더욱 바람직하게는 700 내지 3000 mg/L 농도로 포함하는 것일 수 있다. 특히 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 1,4-디옥산을 500 mg/L, 바람직하게는 600 mg/L, 더욱 바람직하게는 700 mg/L 이상의 고농도로 함유하는 폐수로부터 1,4-디옥산을 제거할 수 있어, 실제 폐수처리 시스템에 적용하기에 적합하다.
본 발명은 상기 폐수에 부가탄소원으로서 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF)을 추가로 혼합할 수 있다.
상기 테트라하이드로퓨란은 20 내지 200 mg/L, 바람직하게는 20 내지 150 mg/L, 더욱 바람직하게는 20 내지 100 mg/L, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 mg/L, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 mg/L 농도로 혼합될 수 있다.
상기 추가로 혼합되는 THF의 농도가 상기 하한치 미만인 경우에는 THF 첨가로 인한 1,4-디옥산 제거능 향상 효과가 미미해지고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 1,4-디옥산 제거능이 오히려 감소하게 된다.
또한, 상기 혼합하는 단계는 공기가 지속적으로 주입되는 생물반응기에서 이루어질 수 있다.
상기 생물반응기는 온도가 20 내지 35 ℃, 바람직하게는 25 내지 35 ℃, 더욱 바람직하게는 27 내지 32 ℃인 조건으로 작동되는 것이 1,4-디옥산 분해능 측면에서 좋다.
상기 생물반응기의 온도가 상기 범위인 경우에 1,4-디옥산 제거 효율이 가장 높고, 상기 하한치 미만이거나 상기 상한치를 초과하는 경우에는 1,4-디옥산 제거능이 낮아지게 된다.
또한, 상기 생물반응기는 통기량이 0.5 내지 3.0 L/min, 바람직하게는 1.0 내지 3.0 L/min, 더욱 바람직하게는 1.2 내지 2.8 L/min, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 2.8 L/min, 더욱 바람직하게는 2.0 내지 2.8 L/min, 더욱 바람직하게는 2.2 내지 2.8 L/min인 조건으로 작동될 수 있다.
상기 생물반응기의 통기량이 상기 범위인 경우에 1,4-디옥산 제거 효율이 가장 높고, 상기 하한치 미만이거나 상기 상한치를 초과하는 경우에는 1,4-디옥산 제거능이 낮아지게 된다.
또한, 상기 생물반응기는 교반속도가 200 내지 800 rpm, 300 내지 700 rpm, 더욱 바람직하게는 400 내지 600 rpm인 조건으로 작동될 수 있다.
상기 생물반응기의 교반속도가 상기 범위인 경우에 1,4-디옥산 제거 효율이 가장 높고, 상기 하한치 미만이거나 상기 상한치를 초과하는 경우에는 1,4-디옥산 제거능이 낮아지게 된다.
이하, 본 발명에 따른 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주에 대해 실시 예를 들어 상세히 설명하기로 한다.
<실험방법>
1,4-디옥산 분해 균주인 시넬라 그래뉼리 CK-4의 분리
폴리에스터 제조 공장지역에서 채취한 폐수 표본으로부터 농화배양 기법을 통하여 1,4-디옥산을 분해할 수 있는 미생물 컨소시엄(microbial consortium)을 확보하였다. 사용된 배지의 조성은 증류수 1 L당 0.66 g (NH4)2SO4, 1.0 g MgSO4ㆍ7H2O, 0.015 g CaCl2ㆍ2H2O, 1.0 mL AMS 미량원소 (증류수 1 L당 0.5 g FeSO4ㆍ7H2O, 0.4 g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.02 g MnSO4ㆍH2O, 0.015 g H3BO3, 0.01 g NiCl2ㆍ6H2O, 0.25 g EDTA, 0.05 g CoCl2ㆍ6H2O, 0.005 g CuCl2ㆍ5H2O), 1 mL AMS stock A (증류수 1 L당 5.0 g Fe-Na EDTA, 2.0 g NaMoO4·2H2O), 20.0 mL 1.0 M phosphate buffer (증류수 1 L당 113.0 g K2HPO4, 47.0 g KH2PO4)을 포함하는 기본 배지에 탄소원으로 다양한 농도의 1,4-디옥산이 첨가된 배지였다. 준비된 배지는 고압멸균 (121℃, 15분)한 후, pH 8.0으로 조절하였다.
상기 미생물군집을 배양하여 얻은 배양액의 5% (v/v)를 신선한 AMS 무기배지에 계대 배양 (25℃, 160 rpm)하였고, 이로부터 1,4-디옥산 분해능이 탁월한 세균인 시넬라 그래뉼리 CK-4를 분리하였다. 상기 AMS (Ammonium Mineral salt) 무기배지는 하기 생물반응기에서의 1,4-디옥산 분해 실험에서 “산업폐수”와 대비하기 위하여 “인공폐수”라는 이름으로 사용하였다.
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 동정, 형태학적 관찰 및 생화학적 특성 조사
분리된 세균을 고체 Luria-Bertani (LB) 배지에 도말하여 단일 집락의 형태를 관찰하였으며, 그람염색과 위상차현미경을 사용하여 분리세균의 형태학적 특성을 관찰하였다. 분리균주의 생리화학적 특성을 조사하기 위하여, indole 생성유무, glucose의 이용여부, methyl red (MR) 및 voges-proskauer (VP) 시험, Klingler iron agar (KIA) 시험, litmus milk 시험, 녹말과 gelatin 및 citrate의 이용 여부 확인시험을 실시하였다 [18]. 다양한 탄소원 이용 능력을 확인하기 위해 BIOLOGTM 분석시스템을 이용하여 실시하였다. 시넬라 그래뉼리 CK-4의 단일집락을 5% 혈액이 첨가된 BIOLOG universal growth (BUG) 고체 평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 균주는 생리식염수에 현탁시키고, 혼탁도를 35% (±3%)로 조절하여 GN2 MicroplateTM (BIOLOG, Hayward, USA)에 200 μL씩 접종한 후, 48시간 동안 배양하였다. 배양된 Microplate는 BIOLOG automated Micro-Station instrument를 사용하여 탄소원의 이용여부를 조사하였다.
16S rRNA 염기서열 분석에 의한 계통수 분석
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 16S rRNA 부분 염기서열 분석과 이를 기초로 한 유전학적 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 16S rRNA 유전자를 증폭시켰다. Genomic DNA는 G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit (Intron Biotechnology Inc., Korea)을 이용하여 추출하였으며, primer는 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3‘)와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였다. PCR은 genomic DNA를 주형으로 하여, PCR premix (GenDEPOT, Korea)를 사용하여 진행하였으며, 수행조건은 변성(denaturation) (94℃, 1분), 냉각(annealing) (60℃, 1분), 신장(elongation) (70℃, 1분)의 단계를 33회 반복한 후, 70℃에서 15분간 유지하였다. PCR을 통하여 증폭된 DNA 단편은 전기영동을 이용하여 확인하였고 agarose extraction kit (Intron, Korea)를 사용하여 gel로부터 분리, 정제하였다. 염기서열은 ABI373 Automated sequencer (Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였고, 분석된 16S rRNA 염기서열은 Clustal X software (http://www.clustal.org) 및 Molecular Evolutionary Genetic Analysis 4 (MEGA4; The Biodesign Institute, Tempe, AZ, USA) 소프트웨어를 사용하여 동정하였으며, 계통수를 작성하였다.
시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 분석
균주의 생장은 분광광도계 (Model Epoch, BioTek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였으며, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산의 농도는 Scalia 등 (1990)의 방법을 이용하여 HPLC로 분석하였다. HPLC system은 UV/Visible Detector 2489, Isocratic HPLC Pump 1515와 Autosampler 2707 (Waters, Milford, MA, USA)로 구성되었으며, 컬럼은 Eclipse XDB-C18 (4.6 × 250mm, 5 μm, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하였다. 표준물질은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 분석용 1,4-디옥산을 사용하였으며, 분석 시료의 경우 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 균체를 제거한 후, 0.45 μm syringe filter로 여과하여 분석하였다.
산업폐수의 분석
산업폐수에 포함된 1,4-디옥산 이외에, terephthalic acid, ethylene glycol, formaldehyde, formic acid 등에 대해서도 HPLC를 이용하여 분석하였으며, 각 성분의 분석조건을 하기 표 1에 나타내었다. HPLC system은 UV/Visible Detector 2489, Isocratic HPLC Pump 1515와 Autosampler 2707 (Waters, Milford, MA, USA)로 구성되었으며, 컬럼은 Eclipse XDB-C18 (4.6 x 250 mm, 5 ㎛, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하였다. 각각의 표준물질은 Sigma 사 (St. Louis, MO, USA)의 분석용 시약을 사용하였다. 분석 시료의 경우 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 균체를 제거한 후, 상등액을 0.45 ㎛ syringe filter로 여과하여 사용하였다.
| 구분 | 1,4-디옥산 | Terephthalic acid | Ethylene glycol | Formaldehyde | Formic acid |
| Mobile Phase | 12:88 (A:B) | 50:50 (A:B) | 55:45 (A:B) | 50:50 (A:B) | 100% (A) |
| Solvent A | Acetonitrile | Acetonitrile | Acetonitrile | Acetonitrile | 20 mM H2SO4 |
| Solvent B | Water | 0.5% Acetic acid | Water | Water | - |
| Flow rate (mL/minute) | 1.0 | 0.7 | 0.05 | 0.8 | 0.8 |
| Column Oven Temperature (℃) | 30 | 30 | 30 | 30 | 40 |
| Injection volume (μL) |
20 | 20 | 1 | 25 | 10 |
| Wavelength (nm) | 200 | 230 | 237 | 355 | 210 |
| Elution Program | Isocratic | Isocratic | Isocratic | Isocratic | Isocratic |
생물반응기와 운전조건
1,4-디옥산의 분해에 사용된 생물반응기 (높이: 300 mm, 직경: 125 mm, 총 부피: 3.7 L, 운전 부피: 3.0 L)는 Model KLF (Bioengineering AG, Zurich, Switzerland)를 변형하여 사용하였다. 반응기 내부에 2개의 임펠러(impeller)가 장착되었으며, 반응기 상단에는 pH probe (Mettler Toledo Co., Columbus, OH, USA)와 에어펌프 (Model KH-60D, Kyungheung Co., Korea), 하단에는 자체 제작한 온도 센서, 가열 및 냉각 장치로 구성되었다. (Fig. 1). 운전은 호기적 조건 하에서 진행되었으며, 배양액의 부피는 3 L, 배양온도는 10~30℃, 교반 속도는 100~500 rpm, 통기량은 0.5~2.5 L/min 등의 조건을 유지하였다. 생물반응기가 운전되는 동안, 증발될 수 있는 배양액은 배양기 상단에 부착된 응축기를 통하여 회수되었다.
생물반응기에서 시넬라 그래뉼리 CK-4에 의한 1,4-디옥산 제거에 영향을 미치는 요인 분석
생물반응기에서 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 제거에 영향을 미치는 요인에 대하여 조사하였으며, 기질로서 (i) 인공폐수와 (ii) 산업폐수에 대하여 각각 실시하였다. 실험방법은 아래와 같았다.
기질 농도
인공폐수 연구에서, 1,4-디옥산의 농도에 따른 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 분해능에 미치는 영향을 조사하였다. 배양기 내에 각각 1,000 mg/L, 2,000 mg/L, 3,000 mg/L의 1,4-디옥산을 첨가한 후, 약 108 CFU/ml의 시넬라 그래뉼리 CK-4를 5% (v/v) 접종하고, 배양온도는 30℃, 교반 속도는 300 rpm, 통기량은 1.5 L/min 조건을 유지하면서, 12시간 간격으로 시료를 채취하여 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다. 산업폐수 연구는 약 797.1 mg/L의 1,4-디옥산이 포함된 폐수를 이용하여 전체 연구를 진행하였다.
온도
인공폐수 연구에서, 배양 온도에 따른 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 분해를 비교하였다. 1,000 mg/L의 1,4-디옥산이 첨가된 AMS 배지에 약 108 CFU/ml의 시넬라 그래뉼리 CK-4균주를 5% (v/v) 접종한 후, 교반 속도는 300 rpm, 통기량은 1.5 L/min 조건을 유지하면서, 각각 10℃, 20℃, 30℃에서 배양하며, 12시간 간격으로 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다. 산업폐수 연구에서 배양온도는 인공폐수와 동일한 조건을 유지하며 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 접종한 후 폐수에 포함된 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다.
통기량
인공폐수 연구에서, 통기량에 따른 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 분해를 비교하였다. 사용한 배지는 AMS 배지에 탄소원으로 1,000 mg/L의 1,4-디옥산을 첨가하였으며, 약 108 CFU/ml의 시넬라 그래뉼리 CK-4를 5% (v/v) 접종한 후, 배양온도는 30℃, 교반 속도는 300 rpm에서, 배양액 3 L에 대하여 통기량을 0.5 L/min, 1.5 L/min, 2.5 L/min으로 각각 유지하면서 12시간 간격으로 시료를 채취하여 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다. 산업폐수 연구에서 통기량은 인공폐수에서와 같은 동일한 조건을 유지하면서 시넬라 그래뉼리 CK-4를 접종한 후, 일정 간격으로 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다.
교반 속도
인공폐수 연구에서, 교반 속도에 따른 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 분해를 비교하였다. 1,000 mg/L의 1,4-디옥산이 첨가된 AMS 배지에 약 108 CFU/ml의 시넬라 그래뉼리 CK-4를 5% (v/v) 접종한 후, 배양온도는 30℃, 통기량은 1.5 L/min 조건 하에서 교반속도를 각각 100 rpm, 300 rpm, 500 rpm으로 유지하면서 12 시간 간격으로 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다. 산업폐수 연구에서 교반속도는 인공폐수에서와 동일한 조건에서 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다.
테트라하이드로퓨란(tretrahydrofuran, THF)의 첨가
인공폐수에서, THF의 첨가와 농도에 따른 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 분해를 조사하였다. 1,000 mg/L의 1,4-디옥산이 첨가된 AMS 배지에 0 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L THF을 각각 첨가하고, 약 108 CFU/ml의 시넬라 그래뉼리 CK-4를 5% (v/v) 접종한 후, 배양온도는 30℃, 교반 속도는 300 rpm, 통기량은 1.5 L/min으로 유지하며, 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다. 산업폐수 연구에서는 폐수에 인공폐수에서와 같이 동일한 농도의 THF를 첨가하고 조건에서 폐수에 포함된 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다.
생물반응기에서 시넬라 그래뉼리 CK-4에 의한 1,4-디옥산 제거의 최적조건
인공폐수 연구에서는 본 연구를 통해서 얻어진 최적조건을 동시에 생물반응기에 적용하여 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산 잔존량을 조사하였다. 생물반응기의 운전조건으로, 1,4-디옥산 농도는 1,000 mg/L, 온도는 30℃, 500 rpm, 통기량은 2.5 L/min 50 mg/L의 THF를 첨가하고, 약 108 CFU/ml의 시넬라 그래뉼리 CK-4를 접종한 후, 균주의 생장과 1,4-디옥산의 잔존량을 조사하였다.
산업폐수 연구에서는 폐수 내에 포함된 약 797.1 mg/L의 1,4-디옥산에, 운전조건으로 온도 30℃, 교반속도 500 rpm, 통기량 2.5 L/min으로 설정하고 50 mg/L의 THF를 첨가하였으며, 동일한 양의 시넬라 그래뉼리 CK-4를 접종한 후, 폐수에 포함된 1,4-디옥산과 그 외 화학물질의 잔존량을 조사하였다.
<시험예>
시험예 1: 1,4-디옥산 분해 균주의 분리
폴리에스터 제조공장에서 폐수 시료를 채취하여, 농화배양 기법으로 1,4-디옥산을 탄소원으로 이용하는 미생물군집을 확보하였다. 이 미생물군집으로부터 순수배양기법에 의해 1,4-디옥산을 분해하는 단일 세균을 분리하였다. 분리된 세균은 1,000 mg/L의 1,4-디옥산을 포함하는 액체배지로 옮겨 30℃에서 분당 160회로 회전하는 진탕배양기에서 배양하며 생장과 1,4-디옥산 분해능을 조사하였으며, 배지 내의 잔존 1,4-디옥산의 양을 HPLC로 측정하여 1,4-디옥산의 분해능이 가장 우수한 균주를 확보하였다. 확보된 균주는 연속적인 실험을 위하여 1,4-디옥산을 포함하는 AMS 배지에 계대 배양하면서 여러 가지 실험에 이용하였다.
시험예 2: 1,4-디옥산 분해균주의 동정 및 상기 균주의 특성 분석
1,4-디옥산 분해세균에 대한 형태학적 및 생화학적 특성조사와 동정을 실시하였다. 이 균주의 집락은 연노랑의 불투명한 크림색으로 관찰되었으며, 위상차현미경을 통해서 균주의 형태는 간균으로 확인되었다. 그람염색 결과는 음성으로 관찰되었으며, 여러 가지 생리학적 실험을 실시하여 분석한 1,4-디옥산 분해균주의 형태학적 특성 및 생리학적 특성을 하기 표 2에 나타내었다.
| Morphological characteristics | Cell shape | Rod |
| Gram stain | Negative | |
| Physiological characteristics | Glucose | + |
| Indole production | - | |
| Methyl red | - | |
| Voges-Proskauer | - | |
| H2S (KIA) | - | |
| Gelatin hydrolysis | + | |
| Starch hydrolysis | + | |
| Litmus milk (peptonization) | - | |
| Simmon's citrate | - |
또한 상기 균주의 다양한 탄소원의 이용 여부는 GN2 MicroplateTM를 이용하여 분석하였으며, 이를 BIOLOG database software 분석시스템을 통해 분석한 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 상기 분석 결과, 상기 1,4-디옥산 분해세균은 시넬라 그래뉼리 균주로 동정되었으며, 상기 동정한 균주를 시넬라 그래뉼리 CK-4로 명명하였다.
| Physiological and biochemical tests | |||
| Water | - | p-Hydroxy Phenylacetic Acid | + |
| α-Cyclodextrin | - | Itaconic Acid | - |
| Dextrin | + | α-Keto Butyric Acid | - |
| Glycogen | - | α-Keto Glutaric Acid | + |
| Tween 40 | - | α-Keto Valeric Acid | - |
| Tween 80 | - | D,L-Lactic Acid | + |
| N-Acetyl-D-galactosamine | - | Malonic Acid | - |
| N-Acetyl-D-glucosamine | + | Propionic Acid | + |
| Adonitol | + | Quinic Acid | - |
| L-Arabinose | - | D-Saccharic Acid | - |
| D-Arabitol | + | Sebacic Acid | - |
| D-Cellobiose | + | Succinic Acid | + |
| i-Erythritol | + | Bromo Succinic Acid | + |
| D-Fructose | + | Succinamic Acid | + |
| L-Fucose | + | Glucuronamide | - |
| D-Galactose | + | L-Alaninamide | - |
| Gentiobiose | + | D-Alanine | - |
| α-D-Glucose | + | L-Alanine | + |
| m-Inositol | + | L-Alanyl-glycine | + |
| α-D-Lactose | - | L-Asparagine | + |
| Lactulose | - | L-Aspartic Acid | + |
| Maltose | + | L-Glutamic Acid | + |
| D-Mannitol | + | Glycyl-L-Aspartic Acid | - |
| D-Mannose | + | Glycyl-L-Glutamic Acid | - |
| D-Melibiose | - | L-Histidine | + |
| β-Methyl-D-Glucoside | + | Hydroxy-L-Proline | + |
| D-Psicose | + | L-Leucine | - |
| D-Raffinose | - | L-Ornithine | + |
| L-Rhamnose | + | L-Phenylalanine | + |
| D-Sorbitol | + | L-Proline | + |
| Sucrose | + | L-Pyroglutamic Acid | + |
| D-Trehalose | + | D-Serine | - |
| Turanose | + | L-Serine | - |
| Xylitol | + | L-Threonine | - |
| Methyl Pyruvate | + | D,L-Carnitine | - |
| Mono-Methyl-Succinate | + | γ-Amino Butyric Acid | - |
| Acetic Acid | + | Urocanic Acid | + |
| Cis-Aconitic Acid | + | Inosine | + |
| Citric Acid | - | Uridine | + |
| Formic Acid | + | Thymidine | - |
| D-Galactonic Acid Lactone | + | Phenyethylamine | - |
| D-Galacturonic Acid | - | Putrescine | - |
| D-Gluconic Acid | - | 2-Aminoethanol | - |
| D-Glucosaminic Acid | - | 2,3-Butanediol | - |
| D-Glucuronic Acid | - | Glycerol | + |
| α-Hydroxy Butyric Acid | - | D,L-α-Glycerol Phosphate | - |
| β-Hydroxy Butyric Acid | + | Glucose-1-Phosphate | + |
| γ-Hydroxy Butyric Acid | + | Glucose-6-Phosphate | + |
| +; positive reaction -; negative reaction | |||
시험예 3: 16S rRNA 염기서열 계통수 분석
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 16S rRNA 염기서열을 ABI373 Automated sequencer를 이용하여 분석하였다(서열번호 1). 이 세균은 Rhizobiaceae 과(科)로 분류되고, 시넬라 그래뉼리 균주와 99%의 유전적 상동성을 나타내었다. NCBI의 BLAST 이용하여 상동성을 확인한 결과, Shinella granuli strain Ch06과 99%로 가장 높은 상동성을 나타내었고, Shinella curvata strain C3 (98%), Shinella zoogloeoides strain NBRC 102405 (98%), Shinella yambaruensis strain MS4 (98%), Shinella fusca DC-196 (97%) 등의 순서로 높은 상동성을 보여주었다. 이 균주와 밀접하게 관련된 다른 균주들과의 유전적 유사성을 16S rRNA 염기서열 결과에 기초하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다 (도 1).
시험예 4: 1,4-디옥산 농도에 따른 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 사멸률 분석
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 250 mL 플라스크에 넣고, 다양한 농도 (0∼20,000 mg/L)의 1,4-디옥산 함유 배지에서 168시간 동안 배양하면서, 1,4-디옥산의 배양 기간에 따른 세포 사멸률을 분석하였다 (도 2).
도 2에 나타낸 바와 같이, 전반적으로 168시간의 조사 기간 동안 1,4-디옥산의 농도와 노출 기간이 증가할수록 CK-4 균주의 사멸률이 증가하였다. 각각의 CK-4 균주는 5,000 mg/L, 10,000 mg/L의 1,4-디옥산에 168시간 동안 노출된 후, 균체수가 약 107 CFU/mL, 106 CFU/mL로 측정되었으며, 1,4-디옥산에 노출되지 않은 균주과 비교하여 사멸률의 차이가 유의적으로 나타나지 않았다. 15,000 mg/L의 1,4-디옥산에 노출된 CK-4 균주는 168시간이 경과된 후, 균체수가 약 104 CFU/mL로 측정되었고, 20,000 mg/L의 1,4-디옥산에 노출된 CK-4 균주는 72시간 이내에 집락이 완전히 사멸되는 것으로 나타났다.
시험예 5: 고농도의 1,4-디옥산에 노출된 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 외부형태 변화
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 250 mL 플라스크에 넣고, 다양한 농도 (0, 10,000 및 20,000 mg/L)의 1,4-디옥산 함유 배지에서 24시간 동안 배양하면서, 1,4-디옥산의 농도에 따른 세포의 외부형태 변화를 주사전자현미경으로 관찰하였다 (도 3).
그 결과, 1,4-디옥산에 노출되지 않은 CK-4 세포의 모양은 모두 매끄러운 표면을 가진 막대형으로 확인되었으며 (도 3A), 10,000 mg/L의 1,4-디옥산에 노출된 CK-4 세포에서도 대부분 노출되지 않은 것과 거의 차이 없이 유사한 형태가 관찰되었다 (도 3B). 그러나 20,000 mg/L의 1,4-디옥산에 노출된 시넬라 그래뉼리 CK-4는 세포 표면이 거칠고 불규칙적이며, 주름진 표면, 쭈그러진 형태 등의 세포 외부형태에서 구조적 변화가 관찰되었다 (도 3C).
시험예 6: 플라스크에서 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 고농도 1,4-디옥산 분해능
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 250 mL 플라스크에 넣고, 다양한 농도 (1,000, 5,000, 10,000, 15,000 및 20,000 mg/L)의 1,4-디옥산 함유 배지에서 28일 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 4).
그 결과, 시넬라 그래뉼리 CK-4는 배지에 포함된 1,000 mg/L, 5,000 mg/L의 1,4-디옥산을 각각 6일, 22일 이내에 완전히 분해하였다. 한편, 상기 균주는 1,4-디옥산 10,000 mg/L, 15,000 mg/L 및 20,000 mg/L 농도에서는 28일 동안 각각 1,4-디옥산을 약 74%, 46% 및 15%를 분해하였다.
이와 같은 결과로부터, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주가 1,000 mg/mL 이상의 고농도 1,4-디옥산을 제거할 수 있는 분해능이 있고, 특히 1,000 내지 5000 mg/L의 고농도 1,4-디옥산을 28일 이내에 100% 분해하는 것이 가능하다는 것을 알 수 있다. 또한, 10,000 내지 20,000 mg/L의 초고농도 1,4-디옥산의 경우에도 28일 이내에 부분적으로 제거하는 것이 가능함을 확인하였다.
시험예 7: 생물반응기에서 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장과 1,4-디옥산의 제거에 영향을 미치는 요인
7-1: 인공폐수에서 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장 및 1,4-디옥산 제거
(a) 기질 농도
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 생물반응기에 넣고, 다양한 농도 (1,000, 2,000 및 3,000 mg/L)의 1,4-디옥산 함유 인공폐수에서 168시간 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생물반응기에서의 생장 및 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 5).
그 결과, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 생물반응기에서 1,000 ~ 3,000 mg/L의 1,4-디옥산 함유 인공폐수를 기질로 이용할 수 있었고, 그 농도가 높아질수록 균주의 생장도 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
특히, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 1,000 mg/L와 2,000 mg/L의 1,4-디옥산을 각각 96시간과 156시간 이내에 100% 분해하였다. 한편, 상기 균주는 1,4-디옥산 3,000 mg/L는 168시간 동안 약 70%의 부분적인 분해를 나타내어, 1,4-디옥산의 농도가 높아질수록 완전 분해가 지연되는 결과를 나타내었다.
(b) 온도
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 생물반응기에 넣고, 다양한 온도(10, 20, 30 ℃)의 1,4-디옥산 함유 인공폐수(1,000 mg/L)에서 168시간 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생물반응기의 온도에 따른 생장 및 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 6).
그 결과, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 30 ℃에서 가장 높은 생장을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 30 ℃의 생물반응기에서 배양되는 경우 1,000 mg/L의 1,4-디옥산을 96시간 이내에 100% 분해하였다. 또한, 상기 균주는 20 ℃의 생물반응기에서 배양되는 경우 동일 농도의 1,4-디옥산을 144시간 이내에 100% 분해하였다. 한편, 상기 균주는 10 ℃에서는 168시간 동안 1,4-디옥산을 약 65%분해하여, 가장 낮은 분해능을 나타내었다.
(c) 통기량
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 생물반응기에 넣고, 1,4-디옥산 함유 인공폐수(1,000 mg/L)에서 다양한 통기량(0.5, 1.5 및 2.5 L/min)으로 168시간 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생물반응기에서의 생장 및 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 7).
그 결과, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 생물반응기의 통기량의 증가에 비례하여 빠르게 생장하였으며, 2.5 L/min에서 84시간이 경과한 후 최대 생장에 도달하였다.
또한, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 생물반응기에서 배양되는 경우 0.5 L/min의 통기량에서 108시간, 1.5 L/min에서 96시간, 2.5 L/min에서 84시간 이내에 각각 1,000 mg/L의 1,4-디옥산을 100% 분해하였다. 이러한 결과로부터, 통기량이 증가함에 따라 균주의 생장과 1,4-디옥산 분해능이 향상되어 완전 분해되는 기간이 단축되는 것을 확인할 수 있었다.
(d) 교반속도
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 생물반응기에 넣고, 1,4-디옥산 함유 인공폐수(1,000 mg/L)에서 다양한 교반속도(100, 300 및 500 rpm)로 168시간 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생물반응기에서의 생장 및 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 8).
그 결과, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 생물반응기의 교반속도의 증가에 비례하여 빠르게 생장하였으며, 500 rpm에서 최대 생장을 나타내었다. 반면, 100 rpm에서는 균주가 응집되어 반응기의 바닥에 침전되는 현상이 발생하였다.
또한, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 생물반응기에서 배양되는 경우 100 rpm에서 132시간, 300 rpm에서 96시간, 500 rpm에서 84시간 이내에 각각 1,000 mg/L의 1,4-디옥산을 100% 분해하였다. 이러한 결과로부터, 교반속도가 증가함에 따라 균주의 생장과 1,4-디옥산 분해능이 효과적으로 향상됨을 알 수 있었다.
(e) 부가탄소원 테트라하이드로퓨란의 농도
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 생물반응기에 넣고, 1,4-디옥산 함유 인공폐수(1,000 mg/L)에 다양한 농도(0, 50, 100 및 150 mg/L)의 테트라하이드로퓨란(THF)을 첨가한 후 168시간 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생물반응기에서의 생장 및 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 9).
그 결과, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 THF 농도가 증가함에 따라 높은 생장이 관찰되었고, 특히 THF 150 mg/L 농도에서 최대 생장을 나타내었다.
또한, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 THF 50 mg/L에서 78시간 이내에 1,000 mg/L의 1,4-디옥산을 100% 분해하여, THF를 첨가하지 않은 대조군(96시간)과 비교하여 1,4-디옥산 분해능이 향상된 것으로 나타났으나, THF 100 mg/L 및 150 mg/L 농도에서는 오히려 1,4-디옥산 분해능이 감소하였다.
따라서, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 THF가 50 mg/L 농도로 첨가되었을 때 1,4-디옥산을 가장 효율적으로 분해하는 것으로 나타났다.
7-2: 산업폐수에서 시넬라 그래뉼리 CK-4의 생장 및 1,4-디옥산 제거
본 연구에서는 산업폐수에 포함되어 있는 다양한 유기 화합물 가운데 1,4-디옥산의 제거에 초점을 두고 수행하였으며, 벤치 규모의 생물반응기 운전 조건에 따른 균주의 생장 및 1,4-디옥산 분해능을 확인하고자 하였다.
(a) 기질 농도
일정기간 동안 산업폐수에서 1,4-디옥산의 농도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 산업폐수에 함유된 1,4-디옥산의 평균 농도는 약 750 mg/L인 것으로 나타났고, 1,4-디옥산 농도 범위는 680 내지 830 mg/L인 것으로 측정되었다. 본 연구에서 수행된 실험은 약 797.1 mg/L의 1,4-디옥산이 함유된 동일한 산업폐수를 이용하여 진행되었다.
한편, 산업폐수에 함유되어 있는 유기 화합물의 종류와 그 농도를 분석하기 위해 HPLC를 실시한 결과, 본 연구에서 사용된 산업폐수에는 대상 유기 화합물로서 1,4-디옥산 뿐만 아니라, 그 외 terephthalic acid (약 65.1 mg/L), ethylene glycol (약 89.5 mg/L), formaldehyde (약 8.6 mg/L) 및 formic acid (약 59.9 mg/L) 등의 유기 화합물이 검출되었다.
(b) 온도
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 생물반응기에 넣고, 다양한 온도(10, 20, 30 ℃)의 1,4-디옥산 함유 산업폐수(797.1 mg/L)에서 168시간 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생물반응기의 온도에 따른 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 10).
그 결과, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산을 완전히 제거하는 기간이 30 ℃에서 가장 짧은 것으로 나타났고, 배양 온도가 감소함에 따라 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산을 완전히 제거하는 기간이 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 생물반응기에서 30 ℃에서는 108시간, 20 ℃에서는 144시간 이내에 산업폐수 내의 약 800 mg/L의 1,4-디옥산을 완전히 제거하였으나, 10 ℃에서는 168시간 동안 약 48%만을 부분적으로 제거하였다. 1,4-디옥산 제거능은 30 ℃에서의 1,4-디옥산 제거능과 비교하여, 20 ℃에서는 약 25%, 10 ℃에서는 약 67% 감소하는 것으로 나타났다.
즉, 본 연구에서 수행된 온도에 따른 산업폐수의 처리는 30 ℃에서 가장 효율적인 것으로 나타났으며, 10 ~ 20 ℃에서도 기존 발표된 연구보다 높은 제거능을 나타내었다. 미생물학적 처리에 있어 온도는 매우 중요한 요소로서 실제 폐수 처리장의 온도는 계절적 요인에 영향을 받아 그 처리 효율이 증감된다. 따라서 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주에 의한 온도에 따른 산업폐수의 처리는 광범위한 온도에서 폐수의 미생물학적 처리 및 제거에 적용 가능성을 제시한다.
(c) 통기량
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 생물반응기에 넣고, 다양한 통기량(0.5, 1.5 및 2.5 L/min)의 1,4-디옥산 함유 산업폐수(797.1 mg/L)에서 168시간 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생물반응기의 통기량에 따른 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 11).
그 결과, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산을 완전히 제거하는 기간이 2.5 L/min에서 가장 짧은 것으로 나타났고, 통기량이 감소함에 따라 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산을 완전히 제거하는 기간이 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 생물반응기에서 0.5 L/min에서는 144시간, 1.5 L/min에서는 108시간, 2.5 L/min에서는 96시간 이내에 산업폐수 내의 약 800 mg/L의 1,4-디옥산을 완전히 제거하였다. 1,4-디옥산 제거능은 0.5 L/min에서의 1,4-디옥산 제거능과 비교하여, 2.5 L/min에서는 약 33% 향상되는 것으로 나타났다.
즉, 본 연구에서 수행된 통기량에 따른 산업폐수의 처리는 2.5 L/min에서 가장 효율적인 것으로 나타났으며, 통기량의 증가는 산업폐수의 용존 산소량을 증가시켜 세포 내로 산소 전달이 향상됨으로써 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주에 의한 1,4-디옥산의 제거가 증진된 것으로 판단된다.
(d) 교반속도
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 생물반응기에 넣고, 다양한 교반속도(100, 300 및 500 rpm)의 1,4-디옥산 함유 산업폐수(797.1 mg/L)에서 168시간 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생물반응기의 통기량에 따른 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 12).
그 결과, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산을 완전히 제거하는 기간이 500 rpm에서 가장 짧은 것으로 나타났고, 교반속도가 감소함에 따라 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산을 완전히 제거하는 기간이 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 생물반응기에서 100 rpm에서는 120시간, 300 rpm에서는 108시간, 500 rpm에서는 96시간 이내에 산업폐수 내의 약 800 mg/L의 1,4-디옥산을 완전히 제거하였다. 1,4-디옥산 제거능은 100 rpm에서의 1,4-디옥산 제거능과 비교하여, 500 rpm에서는 약 25% 향상되는 것으로 나타났다.
즉, 본 연구에서 수행된 교반속도에 따른 산업폐수의 처리는 500 rpm에서 가장 효율적인 것으로 나타났으며, 교반속도의 증가는 폐수 내의 유기물의 농도 구배를 일정하게 유지시켜 물질 전달이 증가되고 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주로의 산소 전달도 향상되어 1,4-디옥산의 제거가 향상되는 것으로 판단된다.
(e) 부가탄소원 테트라하이드로퓨란의 농도
시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 생물반응기에 넣고, 1,4-디옥산 함유 산업폐수(797.1 mg/L)에 다양한 농도(0, 50, 100 및 150 mg/L)의 테트라하이드로퓨란(THF)을 첨가한 후 168시간 동안 배양하면서, 배양기간 동안의 잔존 1,4-디옥산 농도를 측정하여, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생물반응기에서의 1,4-디옥산 제거능을 확인하였다 (도 13).
그 결과, 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산을 완전히 제거하는 기간이 50 mg/L의 THF가 첨가되는 경우에 가장 짧은 것으로 나타났고, 그 이상의 농도로 첨가되는 경우 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산을 완전히 제거하는 기간이 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 배양 초기 THF가 첨가된 산업폐수의 잔존 1,4-디옥산 농도는 THF를 첨가하지 않은 것과 비교하여 높게 측정되었으나, 36시간이 경과한 후, 1,4-디옥산 제거능이 증가하였다. 특히, 50 mg/L의 THF가 첨가된 경우에는 96시간 이내 약 800 mg/L의 1,4-디옥산을 완전히 제거하였으며, 첨가되지 않은 것보다 1,4-디옥산의 완전 분해기간이 단축되는 것을 확인하였다. 한편, 동일 농도의 1,4-디옥산에서 100 mg/L와 150 mg/L의 THF가 첨가된 경우에는 1,4-디옥산이 각각 120시간과 132시간 이내에 제거되어, THF 농도가 증가함에 따라 1,4-디옥산의 제거가 지연되는 것을 확인하였다.
즉, 본 연구에서 수행된 부가탄소원 첨가에 따른 산업폐수의 처리는 50 mg/L 농도의 THF를 첨가한 경우에 가장 효율적인 것으로 나타났다.
시험예 8: 생물반응기에서의 시넬라 그래뉼리 CK-4에 의한 1,4-디옥산 제거를 위한 최적 조건
8-1: 인공폐수에서 1,4-디옥산 제거를 위한 최적조건
상기의 생물반응기의 운전 조건에 관한 실험에서 얻어진 결과를 바탕으로 생물반응기에 최적 조건을 동시에 적용하여 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 인공폐수에서의 생장과 1,4-디옥산의 생분해를 조사하였다 (도 14).
최적 조건으로 기질 농도는 1,000 mg/L의 1,4-디옥산 함유 인공폐수를 준비하였고, 온도 30℃, 통기량 2.5 L/min, 교반 속도 500 rpm, 그리고 50 mg/L의 THF를 부가탄소원으로 첨가하였다. 168시간 동안 배양한 결과, 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 생장과 1,4-디옥산의 생분해는 뚜렷한 변화를 보여주었다. 생장의 경우 72시간이 경과한 후, 최대 생장을 나타내었으며, 별도의 유도기는 관찰되지 않았다. pH는 초기 8.0에서 배양 기간에 따라 감소하였으며, 72시간이 경과한 후, 7.2로 측정되었으며, 이후 pH는 증감없이 일정한 값을 유지하였다. 1,4-디옥산의 생분해는 배양 초기부터 잔존 1,4-디옥산이 급격하게 감소되며, 1,000 mg/L의 1,4-디옥산을 72시간 이내 완전히 분해하는 것을 확인하였다.
8-2: 산업폐수에서 1,4-디옥산 제거를 위한 최적조건
상기의 생물반응기의 운전 조건에 관한 실험에서 얻어진 결과를 바탕으로 생물반응기에 최적 조건을 동시에 적용하여 본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주의 산업폐수에서의 생장과 1,4-디옥산의 생분해를 조사하였다 (도 15).
생물반응기에 적용된 운전 조건으로 온도는 30℃, 통기량은 2.5 L/min, 교반속도는 500 rpm을 설정하였으며, 추가적으로 50 mg/L의 THF를 첨가하였다. 168시간 동안 배양하며, 산업폐수에서 대상 물질인 1,4-디옥산의 제거를 조사하였다. 대조군으로는 동일한 조건에서 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주를 접종하지 않은 산업폐수를 설정하였으며, 168시간의 배양기간 동안 약 180 mg/L의 1,4-디옥산이 제거되어 약 22%의 부분적인 제거를 나타내었다. 그러나 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주가 접종된 산업폐수에서는 96시간 이내에 산업폐수에 포함된 1,4-디옥산을 완전히 분해하며, 대조군과 비교하여 탁월한 제거능을 보여주었다.
본 발명의 시넬라 그래뉼리 CK-4 균주는 최적 운전 조건을 적용시킨 생물반응기에서 1,4-디옥산이 첨가된 무기 배지에서뿐만 아니라 다양한 탄소원이 포함된 산업폐수에서도 짧은 기간 이내 고농도 (약 800 mg/L)의 1,4-디옥산을 완전히 분해함으로써 기존에 발표된 미생물보다 탁월한 1,4-디옥산 제거능을 보여주며, 미생물학적 처리의 가능성을 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
<110> CDI Co., Ltd.
<120> Novel Shinella granuli CK-4 strain with high capability of
1,4-dioxane decomposition and method for treating
1,4-dioxane-containing wastewater using the same
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<210> 1
<211> 1079
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Shinella granuli CK-4
<400> 1
ccaaagggac ccccttacac atgcagtcga acgcatcgca agatgagtgg cagacgggtg 60
agtaacgcgt gggaacgtgc cctttactac ggaataactc agggaaactt gtgctaatac 120
cgtatgtgcc cttcggggga aagatttatc ggtaaaggat cggcccgcgt tggattagct 180
agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca 240
gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 300
gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ctagggttgt 360
aaagctcttt caccggtgaa gataatgacg gtaaccggag aagaagcccc ggctaacttc 420
gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa 480
gcgcacgtag gcgggtattt aagtcagggg tgaaatcccg gagctcaact ccggaactgc 540
ctttgatact gggtacctag agtatggaag aggtaagtgg aattccgagt gtagaggtga 600
aattcgtaga tattcggagg aacaccagtg gcgaaggcgg cttactggtc cattactgac 660
gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 720
aacgatgaat gttagccgtc ggcatgcatg catgtcggtg gcgcagctaa cgcattaaac 780
attccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 840
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agcccttgac 900
atgtcggtcg cggtttccag agatggatac cttcagttag gctggaccga acacaggtgc 960
tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020
ccctcgccct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggggactgcc ggtgataac 1079
Claims (10)
1,4-디옥산 분해능을 갖는 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P).
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.
상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.
시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 1,4-디옥산 분해용 조성물.
시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 폐수처리장치용 첨가제 조성물.
1,4-디옥산 함유 폐수에 시넬라 그래뉼리 (Shinella granuli) CK-4 균주 (수탁번호: KCTC18920P) 또는 이의 배양액을 혼합하는 단계;를 포함하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
제5항에 있어서,
상기 폐수는 1,4-디옥산을 5 내지 3000 mg/L 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
상기 폐수는 1,4-디옥산을 5 내지 3000 mg/L 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
제5항에 있어서,
상기 폐수에 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF)을 추가로 혼합하는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
상기 폐수에 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF)을 추가로 혼합하는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
제7항에 있어서,
상기 테트라하이드로퓨란은 20 내지 200 mg/L 농도로 혼합되는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
상기 테트라하이드로퓨란은 20 내지 200 mg/L 농도로 혼합되는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
제5항에 있어서,
상기 혼합하는 단계는 공기가 지속적으로 주입되는 생물반응기에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
상기 혼합하는 단계는 공기가 지속적으로 주입되는 생물반응기에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
제9항에 있어서, 상기 생물반응기는
온도가 20 내지 35 ℃;
통기량이 0.5 내지 3.0 L/min; 및
교반속도가 200 내지 800 rpm인 조건으로 작동되는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
온도가 20 내지 35 ℃;
통기량이 0.5 내지 3.0 L/min; 및
교반속도가 200 내지 800 rpm인 조건으로 작동되는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 함유 폐수의 처리 방법.
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| JP2015160202A (ja) | 2014-02-28 | 2015-09-07 | 水ｉｎｇ株式会社 | １，４−ジオキサン含有有機性廃水の生物処理方法及びその処理装置 |
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