KR100864448B1 - １，４－디옥산 분해능을 갖는 신규한 슈도노카디아 속ｇｂ７ 균주 및／또는 이의 배양물, 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연계로부터 분리한 1,4-디옥산(1,4-dioxane)을 효율적으로 분해하는 신규한 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주 및 이의 배양물, 이들의 배양 방법, 및 상기 균주 및/또는 배양물을 이용한 1,4-디옥산 분해 방법에 관한 것이다.

1,4-디옥산, 슈도노카디아 속 GB7 균주, 배양물

Description

１，４－디옥산 분해능을 갖는 신규한 슈도노카디아 속 ＧＢ７ 균주 및／또는 이의 배양물, 및 이의 용도{NOVEL PSEUDONOCARDIA SP. WITH DEGRADABLE ACTIVITY OF 1,4-DIOXANE AND/OR ITS CULTURE, AND USASE THEROEOF}

도 1은 자연계로부터 분리된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 각각 균주 계대용 고체배지(1a)와 균 분리용 고체선택배지(1,4-디옥산 고체배지; 1b)에 배양시켜 나타낸 균체의 콜로니 형태, 및 상기 1,4-디옥산 고체배지에서 생육시킨 균체의 주사전자현미경 사진(1c 및 1d)을 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명에 의해 동정된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 도면이고,

도 3은 1,4-디옥산의 표준품(3a), 및 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 고농도 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지에 접종하기 전(3b) 및 접종 후 20일이 경과된 후의 배지의 Mass spectra(3c)를 각각 GC-Mass를 이용하여 측정한 사진이고,

도 4는 고농도 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지에 접종시킨, 본 발명의 1,4-디옥산 분해효소가 비유도된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주의 배양시간에 따른 고농도 1,4-디옥산 분해능 및 생육도를 나타낸 그래프이고,

도 5는 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지에서 15일간 종균 배양시킨, 본 발 명의 1,4-디옥산 분해효소가 유도된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주의 배양시간에 따른 고농도 1,4-디옥산 분해능 및 생육도를 나타낸 그래프이고,

도 6은 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지에서 15일간 종균 배양시킨 1,4-디옥산 분해효소가 유도된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주 및 종균 배양시키지 않은 비유도된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주의 배양시간에 따른 저농도 1,4-디옥산 분해능을 나타낸 그래프이고,

도 7은 1,4-디옥산 분해효소가 유도된 본 발명의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주의 온도에 따른 1,4-디옥산 분해도를 나타낸 그래프이고,

도 8은 1,4-디옥산 분해효소가 유도된 본 발명의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주의 산소에 따른 1,4-디옥산 분해도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 자연계로부터 분리한 1,4-디옥산(1,4-dioxane)을 효율적으로 분해하는 신규한 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주 및 이의 배양물, 이들의 배양 방법, 및 상기 균주 및/또는 배양물을 이용한 1,4-디옥산 분해 방법에 관한 것이다.

1,4-디옥산(1,4-dioxane, C₄H₈O₂)은 무색이며 단맛 향이 나는 유기합성 화합물로서, 열, 산소, 산 등으로부터 용매의 수명을 연장시키기 위하여 페인트, 라커, 화장품, 방향제, 훈증소독제, 부동액, 농약, 화장품, 전자제품 등의 제조 시 용매의 안정제로 널리 사용되고 있다. 또한, 가죽공장 또는 인조합섬 제조과정에서 생성되는 부산물로서, 국제 암 연구기관(IARC: International Agency for Research on Cancer)에 의해 발암가능성이 있는 그룹 2B로 분류되어 있다(Howard P., 2ed, vol. II, Leqis publishers, Chelsea, MI, USA, pp. 216-221, 1990; 임재림, 대한환경공학회지, 26(11), 1238-1239, 2004).　

자연계에서 1,4-디옥산(1,4-dioxane)의 반감기는 6개월에서 2년 정도로 매우 길며, 미생물에 의한 분해가 거의 일어나지 않고, 끓는점이 101.1℃로서 휘발성이 매우 낮아 이로 인해 수질이 오염된 경우에는 일반적인 방법으로는 제거하기가 매우 어렵다(임재림, 대한환경공학회지, 26(11), 1238-1239, 2004). 또한, 토양 중에 유출되면 토양흡착계수가 낮아, 지하수에 고농도로 농축되어 동물이나 식물 등으로 전달되는 심각한 문제점을 유발하게 된다(Adams, C. D., et al., Environ, Sci. Technol., 28, 1812-1818, 1994; Howard, P. H., et al., Handbook of environmental Degradation rate, Lewis publish, Inc., Chelsea, Michigan, USA, 1991; Sasaki, S., Hutzinger, O. et al., Editors., Pergamon, press, Oxford, U.K., 283-298, 1978). 우리나라에서는 구미와 왜관공단 합성섬유 생산업체에서 폴리에스테르 제조공정 중에 생성된 고농도의 1,4-디옥산이 낙동강 수계에 배출되 어 커다란 사회적 문제가 된 적이 있다(MBC 시사매거진 2580; 2004년 6월 12일).

1,4-디옥산(1,4-dioxane)을 제거하기 위한 방법으로는 대표적으로 생물학적 처리 방법 및 화학적 처리 방법 등이 알려져 있으며, 이 중 대부분의 폐수처리에 이용되는 종래의 생물학적 처리 방법은 1,4-디옥산을 분해 또는 제거 효율이 30~50%로 매우 낮아, 분해되지 않고 남은 1,4-디옥산이 유출돼 수질 및 토양 오염을 유발하게 된다(www. Epa. Gov/ttn/atw/hithef/dioxane html.: D. Roy, et al., J. Environ. Sci. Health, A29(1), 129-147, 1994). 이처럼 생물학적 처리 방법에 따른 1,4-디옥산의 제거율이 낮은 원인은 첫째, 폐수 처리에 이용되는 기존 미생물들이 1,4-디옥산의 분해관련효소를 보유하고 있지 않거나, 둘째, 폐수 내 1,4-디옥산의 분해관련효소를 생산하는 미생물 숫자가 절대적으로 부족하거나, 셋째, 1,4-디옥산을 분해하는데 30일 이상의 긴 시간이 요구되는 것 등이　원인이 되고 있다(D. Roy, et al., J. Environ, Sci, Health, A29(1), 129-147, 1994; Mahendra, S. and Alvarez-Cohen, L., Environ, Sci. Technol., 1: 40(17), 5435-5442, 2006).

이러한 1,4-디옥산의 생물학적 처리 방법에 따른 문제점을 해결하기 위하여, 최근에는 자외선(UV) 및 UV-Fenton 산화(H₂O₂/Fe) 처리법 등의 화학적 처리 방법이 이용되고 있으며, 그 처리 효율성은 약 90% 정도이다. 그러나,　화학적 처리 방법은 새로운 시설장비의 설치 및 고가의 유지비용이 요구되며, 처리 후 생성되는 다양한 부산물들에 의한 환경오염과　분해되지 않고 잔류된 저농도의 1,4-디옥산이 자 연계로　방류되어 수질오염 및 토양오염을 유발(Bernhardt, D. and H. Diekmann., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 120-123, 1991)하기 때문에, 이에 대한 대책이 시급히 요구된다.

따라서, 1,4-디옥산의 화학적 처리 방법에 따른 문제점을 해결하기 위해서는 기존의 폐수 처리 방법으로 가장 많이 이용되는 생물학적 처리 방법의 문제점인 1,4-디옥산의 분해 속도 및 효율을 개선하는 것이 무엇보다 중요하다.

또한, 1,4-디옥산의 분해능을 갖는 미생물 균주에 대하여 국내에서는 현재까지 보고된 바가 없으며, 국외에서는 로도코커스(Rhodococcus), 미코박테리움(Mycobacterium), 및 버크홀더리아 속(Burkholderia sp .) 등의 균주가 1,4-디옥산을 탄소원으로 이용하여 생육한다는 보고가 있다(Bock, C., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 408-410, 1996; Parales, R. E., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60, 4527-4530, 1994; Richardson, R. E., et al., Environ. Sci. Technol., 36, 2652-2662, 2002).

이러한 요구에 부응하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 생물학적 처리 방법 및 화학적 처리 방법의 문제점을 해결하기 위하여, 자연계에서 1,4-디옥산을 효율적으로 분해하는 신규한 미생물 균주, 바람직하게는 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 동정하였고, 상기 균주 및/또는 이의 배양물의 배양 방법, 및 최적화된 1,4-디옥산 분해 방법을 확립함으 로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 자연계로부터 분리한 1,4-디옥산을 효율적으로 분해하는 미생물 균주 및/또는 이의 배양물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 균주 및/또는 이의 배양물에 의한 1,4-디옥산의 분해 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 1,4-디옥산을 함유하는 시료의 분해 속도 및 분해 효율을 향상시키기 위한 최적화된 배양 조건, 즉 배양 방법, 종균 배양 배지, 및 배양 온도 등을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는 1,4-디옥산의 분해제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1,4-디옥산(1,4-dioxane)을 효율적으로 분해하는 신규한 미생물 균주, 보다 바람직하게는 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주 및/또는 이의 배양물을 제공한다. 상기 균주 및/또는 이의 배양물은 1,4-디옥산을 함유하는 시료에 접촉하기 전, 본 발명의 바람직한 구체예에서와 같이 상기 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 종균 배양 배지에 접종하여 10일 내지 20일, 보다 바람직하게는 15일간 배양한 종균 및/또는 이를 포함하는 배양액일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주 및/또는 이의 배양물을 1,4-디옥산을 함유하는 시료와 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하는, 1,4-디옥산의 분해 방법을 제공한다. 상기 시료는 1,4-디옥산을 함유하는 어떠한 용매도 이용가능하며, 예를 들면, 페인트, 라커, 화장품, 방향제, 훈증소독제, 부동액, 농약, 화장품, 및 가죽공장 또는 인조합섬 제조과정에서 생성되는 부산물 등으로 오염된 폐수일 수 있다.

또한, 본 발명은 기질인 1,4-디옥산을 함유하는 시료의 분해 속도 및 분해 효율을 촉진시키기 위하여, 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주의 1,4-디옥산 분해효소를 유도하는 종균 배양 배지를 제공한다. 상기 "종균 배양 배지"의 조성은 일반적으로 균주가 증식하는데 필요한 최소배지(basal medium)와 미량금속염 용액을 포함하는 배지에 추가적으로 1,4-디옥산(dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)를 포함하는 배지를 의미한다. 이때, 상기 최소배지는 Yeast extract, Na₂HPO₄ㆍ12H₂O, KH₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄ㆍ7H₂O, 및 CaCl₂ 등을 배지의 조성물로 이용하는 모든 배지를 포함하는 것일 수 있고, 상기 미량금속염 용액은 FeSO₄ㆍ7H₂O, ZnSO₄ㆍ7H₂O, CaClㆍ₂6H₂O, CoCl₂ㆍ6H₂O, 및 BaCl₂ㆍ6H₂O 등을 함유한 용액일 수 있다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는, 1,4-디옥산 분해제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 종래에 사용되고 있는 1,4-디옥산의 화학적 처리 방법의 문제점 즉, 새로운 시설장비 설치, 고가의 유지 비용, 및 처리 후 생성되는 다양한 부산물들과 잔류된 1,4-디옥산에 의한 환경오염(토양 및 수질 오염) 등을 해결할 수 있는 보다 개선된 생물학적 처리 방법을 개발하고자 하였다.

따라서, 본 발명에서는 자연계로부터 분리한 1,4-디옥산(1,4-dioxane)을 효율적으로 분해하는 신규한 미생물 균주, 바람직하게는 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 제공한다. 상기 분리된 균주의 대상시료로는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 1,4-디옥산의 분해능을 갖는 미생물 균주를 분리할 수 있는 시료, 예를 들면 합성섬유공장, 가죽가공공장, 및 세차장의 폐수 및 토양시료 등을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 구체예에서는 상기에서 분리된 균주의 동정을 위하여, 일반적으로 사용되는 균주 동정 방법 중 하나인 16S rRNA를 이용한 서열정렬 분석방법을 이용할 수 있으며, 이를 위한 분석 프로그램으로는 대표적으로 GeneBank BlastN 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)을 이용할 수 있다.

본 발명자들은 이와 같이 동정된 균주를 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주로 명명하였고, 이를 2007년 1월 19일에 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 기탁하였다(수탁번호: KACC 91296P).

또한, 본 발명에서는 상기로부터 동정된 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주 및/또는 이의 배양물을 1,4-디옥산을 함유하 는 시료와 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하는, 1,4-디옥산의 분해 방법을 제공한다. 상기 배양물은 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 바람직하게는 상기 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 1,4-디옥산(dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 1,4-디옥산(dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)를 모두 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 것일 수 있다.

본 발명에서는 상기 1,4-디옥산(dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)를 포함하는 배지를 "종균 배양 배지"로 정의하였고, 보다 구체적으로는 상기 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 기질인 1,4-디옥산을 함유하는 시료와 접촉하기 전, 우선 상기 균주의 1,4-디옥산 분해효소를 유도(induction)하여 상기 균주 및/또는 이의 배양물로 하여금 1,4-디옥산을 함유하는 시료를 보다 효율적으로 분해할 수 있도록 제조된, 후술하는 본 발명의 실시예에 기재된 1,4-디옥산(dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)를 포함하는 상기 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주의 종균 배양용 배지를 의미한다. 또한, 본 발명에서는 상기 종균 배양 배지에 접종하여 1,4-디옥산 분해효소가 유도된 상기 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 "유도종균 혹은 유 도균"으로 명명하였고, 상기 종균 배양 배지에 접종하지 않은 즉, 1,4-디옥산 분해효소가 유도되지 않은 상기 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 "비유도종균 혹은 비유도균"으로 명명하였다. 이처럼, 상기 종균 배양 배지에 의해 1,4-디옥산 분해효소가 유도된 유도종균은 비유도종균에 비해 초기 생육적응기(lag phase), 1,4-디옥산의 최종 분해율, 및 최고 분해율에 도달하는 시간을 감소시키는 특징을 가진다(표 1 참조).

종균 항목	초기 1,4-디옥산의 농도 ( ppb )	생육적응기 ( day )	최종분해율 (%)	최고분해율에 도달시간 ( day )
비유도종균 배양물	100,000 (고농도)	5-7	95	19-21
	10,000 (저농도)	5-7	95	17-20
유도종균 배양물	100,000 (고농도)	0-1	97.5	13-15
	10,000 (저농도)	0-1	98.7	10-12

또한, 본 발명에서는 상기 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주에 의한 1,4-디옥산을 함유하는 시료의 분해를 최적화시키는 배양 조건, 즉 배양 방법, 배양 온도, 및 종균 배양 배지 등을 제공한다.

상기 배양 방법은 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주 및/또는 이의 배양물을 기질인 1,4-디옥산을 함유하는 시료와 접촉하기 전, 본 발명의 종균 배양 배지에 접종하여 10일 내지 20일, 보다 바람직하게는 15일간 배양하여 얻어진 균주 및/또는 이의 배양물일 수 있다.

상기 균주의 최적 배양 온도는 25 내지 35℃ 범위이며, 바람직하게는 30 내지 35℃ 범위이고, 보다 바람직하게는 1,4-디옥산의 분해율 및 분해 속도가 가장 높게 나타나는 온도인 30℃일 수 있다(도 6 참조).

상기 종균 배양 배지의 조성은 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 바람직하게는 최소배지(basal medium) 즉, 증류수 1L 당 4.0 내지 5.0g의 Na₂HPOㆍ12H₂O; 0.8 내지 1.2g의 KH₂PO₄; 1.5 내지 2.5g의 (NH₄)₂SO₄; 0.1 내지 0.3g의 MgSO₄ㆍ7H₂O; 및 0.8내지 1.2g의 CaCl₂를 첨가한 배지에,

추가적으로, 증류수 1L 당 0.5 내지 1.5g의 FeSO₄ㆍ7H₂O; 0.1 내지 0.2g의 ZnSO₄ㆍ7H₂O; 0.01 내지 0.03g의 CaClㆍ₂6H₂O; 0.01 내지 0.03g의 CoCl₂ㆍ6H₂O; 및 0.01 내지 0.03g의 BaCl₂ㆍ6H₂O를 함유한 미량금속염 용액 중 0.5 내지 1.0ml을 포함하고,

상기 혼합 배지에 추가적으로 1,4-디옥산(dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 배지일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 혼합 배지에 1,4-디옥산(dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)을 각각 100: 1: 1 비율로 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 혼합 배지에 첨가되는 1,4-디옥산(dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)의 함량을 각각 최종농도가 100ppm(100,000ppb), 1.0ppm(1,000ppb), 및 1.0ppm(1,000ppb)가 되도록 첨가하여 얻어진 배지일 수 있다.

또한, 기질인 1,4-디옥산을 함유하는 시료에 접종할 경우, 상기 1,4-디옥산 분해효소가 유도되거나 혹은 1,4-디옥산 분해효소가 유도되지 않은 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주의 배양물에 접종된 균체수는 상기 기질인 1,4-디옥산을 함유하는 시료 1L 당 1 X 10⁹ 내지 1 X 10¹¹개, 보다 바람직하게는 1 X 10¹⁰ 내지 1 X 10¹¹개일 수 있다.

상기 1,4-디옥산의 함량은 시료 1L 당 최종농도가 90 ppm(90,000 ppb) 내지 110ppm(110,000 ppb), 바람직하게는 9 ppm(9,000 ppb) 내지 110 ppm(110,000 ppb), 보다 바람직하게는 10ppm(10,000ppb) 내지 100ppm(100,000ppb)이 되도록 포함하는 것일 수 있다.

특히, 본 발명에서는 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 상기 종균 배양 배지에 접종하여 배양한 유도종균의 경우, 유도되지 않은 비유도종균에 비해 1,4-디옥산의 고농도 및 저농도, 초기 생육적응기(lag phase), 1,4-디옥산 최종 분해율(%), 및 최고 분해율에 도달하는 시간(day) 모두에서 1,4-디옥산을 보다 효율적으로 분해할 수 있음을 확인하였다(표 1 참조).

따라서, 본 발명은 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주 및/또는 이의 배양물을 포함하는, 1,4-디옥산 분해제를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 시료 준비 및 사용된 배지의 종류와 특징

<1-1> 균 분리용 시료 준비

1,4-디옥산(1,4-dioxane) 분해능을 가진 미생물 균주를 분리하기 위하여, 본 실시예에서는 합성섬유공장, 가죽가공공장, 및 세차장의 폐수 및 토양시료 등 총 1000여 점을 각각 50㎖ 또는 50g 정도 채취하여　균 분리용 시료로 이용하였다.

<1-2> 균주 계대용 고체배지

균주 계대용 배지를 제조하기 위하여, 증류수 1L에 2.0g의 Glucose, 5.0g의 Glycerol; 1.0g의 Na2HPO₄ㆍ7H₂O; 0.2g의 KH₂PO₄, 2.0g의 Bactopeptone, 4.0g의 Yeast extract,　1g의 Casein(pancreatic digestion), 15g의 Bactoagar를 완전히 녹이고, pH를 7.0으로 조절하였다. 상기 혼합액에 1㎖의 미량금속염 용액(mineral salts solution)을 첨가하여 고압 멸균시킨 후, 페트리 접시에 25㎖ 정도 분주하여 고상화시켜 사용하였다. 이때, 상기 미량금속염 용액은 증류수 1L에 1.0g의 FeSO₄ㆍ7H₂O, 0.02g의 CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.014g의 H₃BO₃, 0.1g의 MnSO₄ㆍ4H₂O, 0.1g의 ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.02g의 CaCl₂ㆍ6H₂O, 0.02g의 CoCl₂ㆍ6H₂O, 0.02g의 BaCl₂ㆍ6H₂O을 완전히 녹이고, 0.22um의 여과지(Millipore Co., MA, USA)로 여과 및 멸균하여 사용하였다(Ronald, M. A., Handbook of Microbiological Media, CRC press).

상기 배지 제조용 시약은 Oxoid사(Oxoid LTD, 영국) 및 Difco사(BD bioscience, CA, 미국)로부터 구입하였고, 상기 미량금속염 용액 제조용 시약은 Shinyo pure　chemical사(Shinyo Pure chemicals Co., Osaka, 일본)로부터 구입하였다.

<1-3> 균 증식용 액체선택배지

상기 실시예 1로부터 얻은 시료로부터 1,4-디옥산 분해능을 가진 균주를 효율적으로 증균시키기 위하여 사용된 배지는 다음과 같다:

즉, 증류수 1L에 1g의 Yeast extract, 4.5g의 Na₂HPO₄ㆍ12H₂O, 1.0g의 KH₂PO₄, 1.8g의 (NH₄)₂SO₄, 0.2g의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.1g의 CaCl₂을 혼합한 기초배지(basal medium)에, 상기 1-2의 계대배지에서 사용된 미량금속염 용액 1㎖을 첨가하여 완전히 녹인 후, pH를 7.0으로 조절하였다.

상기 배지를 고압 멸균시킨 후, 상기 배지에 1,4-디옥산 및 테트라하이드로푸란을 　최종농도가 각각 100ppm(100,000ppb) 및 10ppm(10,000ppb)이 되도록 첨가한 다음, 시험관에 20㎖씩 분주하여 냉장 보관하였다. 이때, 상기 1,4-디옥산 및 테트라하이드로푸란은 모두 Merck사(Merck, Darmstadt, 독일)로부터 구입하였다.　

<1-4> 균 분리용 고체선택배지(1,4-디옥산 고체배지 )

1,4-디옥산 분해능을 가진 균주를 분리하기 위하여, 상기 1-2에서 사용된 균 증식용 액체선택배지 중 육안으로 균의 생육도가 확인된 배양액을 대상으로 1,4-디옥산을 유일한 탄소원(sole carbon source)으로 함유하는 고체선택배지를 제조하였다. 배지의 조성은 다음과 같다:

즉, 증류수 1L에 4.5g의 Na₂HPO₄ㆍ12H₂O, 1.0g의 KH₂PO₄, 1.8g의 (NH₄)₂SO₄, 0.2g의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.1g의 CaCl₂, 15g의 Bactoagar를 혼합한 용액에, 상기 1-3의 선택배지에서 사용된 미량금속염 용액 1㎖을 첨가하여 완전히 녹이고, 1N의 NaOH를 이용하여 상기 용액의 pH를 7.0으로 조절하였다.

상기 배지를 고압 멸균하여 60℃ 정도에서 식힌 후, 1,4-디옥산의 최종농도가 10ppm(10,000ppb)되도록 첨가하여, 페트리 접시에 25㎖ 정도로 분주한 후 상온에서 고상화시켜 냉장 보관하였다.

<1-5> 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지

상기 실시예 2-3의 균 분리용 고체선택배지에서 1,4-디옥산을 탄소원으로 이용하여 생육한 균주를 대상으로, 상기 균주에 의한 1,4-디옥산 분해율 및 분해 속도를 측정하기 위해 제조된　고농도 및 저농도 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지의 조성은 다음과 같다:

즉, 고농도 배지는 증류수 1L에 4.5g의 Na₂HPO₄ㆍ12H₂O, 1.0g의 KH₂PO₄, 1.8g의 (NH₄)₂SO₄, 0.2g의 MgSO_{4 ㆍ}7H₂O, 0.1g의 CaCl₂를 혼합한 용액에, 상기 미량금속염 용액 1㎖을 첨가하여 완전히 녹인 후 pH를 7.0으로 조절하였다. 상기 배지를 고압 멸균하여 60℃ 정도에서 식힌 후, 실제 공단에서 배출되는 폐수 내에 존재하는 1,4-디옥산의 농도와 유사한 농도인 100ppm(100,000ppb)으로 최종농도가 되도록 배지에 첨가하였다.

반면, 저농도 배지는 증류수 1L에 4.5g의 Na₂HPO₄ㆍ12H₂O, 1.0g의 KH₂PO₄, 1.8g의 (NH₄)₂SO₄, 0.2g의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.1g의 CaCl₂를 혼합한 용액에, 상기 미량금속염 용액 1㎖을 첨가하여 완전히 녹인 후 1N NaOH를 이용하여 pH가 7.0이 되도록 첨가하여 조절하였다. 상기 배지를 고압 멸균하고 60℃ 정도에서 식힌 후, 종래에 보고된 1,4-디옥산의 화학적 처리율을 90%로 가정하여 1,4-디옥산의 최종농도가 10ppm(10,000ppb)되도록 첨가하였다(대구지방환경청, 새로운 미량유해물질의 발견과 대처, 2005. 07, pp. 4-5; 박진호 외 2명, 한국환경공학회지, 15(3), 193-201, 2006).

<1-6> 종균 배양 배지(1,4-디옥산 분해효소 생산유도배지 ) 및 배양 조건

폐수에 균을 투입할 경우, 상기 균의 1,4-디옥산 분해와 관련된 유도효소의 생산시간(적응기)을 줄이거나 혹은 제거시키기 위한 목적으로, 본 실시예에서는 종균 배양 배지에 균 생육용 탄소원으로 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 및 테트라하이드로푸란을 (100: 1: 1) 비율로　첨가하였다. 이때, 상기 종균 배양 배지의 조성은 다음과 같다:

즉, 증류수 1L에 4.5g의 Na₂HPO₄ㆍ12H₂O, 1.0g의 KH₂PO₄, 1.8g의 (NH₄)₂SO₄, 0.2g의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.1g의 CaCl₂를 혼합한 용액에　상기에서 사용된 미량금속염 용액(1.0g의 FeSO₄ㆍ7H₂O, 0.1g의 ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.02g의 CaClㆍ₂6H₂O, 0.02g의 CoCl₂ㆍ6H₂O) 1㎖을 첨가하여 완전히 녹인 후, 1N의 NaOH로　상기 용액의 pH를 7.0으로 조절하였다. 상기 배지를 고압 멸균하여 60℃ 정도에서 식힌 후, 최종농도가 각각 100ppm(100,000ppb),　1.0 ppm(1000ppb) 및 1.0 ppm(1000ppb)이 되도록 상기 용액에 각각 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 테트라하이드로푸란을 각각 첨가하였다.

이와 같이 제조된 상기 배지에 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주를 접종하여 30℃, 140rpm으로 15일간 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 4℃, 10,000rpm, 10분간 원심 분리하여 수집한 후, 40㎖의 생리식염수로 3회 세척하고, 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지에 현탁하여 종균으로 사용하였다. 또한, 매 실험 시 종균의 접종량을 660nm에서 흡광도가 0.1이 되도록 분광광도계를 이용하여 조절하였다.

< 실시예 2> 균주 동정 및 특징 분석

<2-1> 분리된 균주의 형태 및 배양학적 특징

본 발명에 의해 분리된 균주를 동정하기 위하여, 균주 계대용 고체배지와 1,4-디옥산을 유일한 탄소원으로 함유한 고체배지(1,4-디옥산 고체배지)에 각각 생육시켜 형성되는 콜로니 형태 및 생육한 균을 유리 슬라이드에 도말하고 이온스포트로 백금이온 코팅하여 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM, S-4300, Hitachi)으로 그 형태를 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 균주 계대용 배지에서 3일 동안 배양시킨 균은 표면이 거칠고,　색소가 생성되지 않아 흰 색깔을 나타내었고(도 1a), 균 분리용 고체선택배지(1,4-디옥산 고체배지)에서 10일간 배양시킨 균은 콜로니 모양이 둥글며, 표면이 거칠고 건조하였다(도 1b). 또한, 균 분리용 고체선택배지(1,4-디옥산 고체배지)에서 생육한 균주를 전 처리하여 주사전자현미경으로 측정한 결과, 도 1c 및 1d와 같이 간균 형태의 모양이 연결되어 있는 것처럼 관찰되었으나, 균의 크기와 분지점들은 다양하게 나타났고, 운동성이 없었으며, Gram(+), 및 Catalase(+)를 나타내었다(도 1c 및 1d). 또한, 기균사(aerial mycelium) 및 conidia는 모두 관찰되지 않았으나, 배지 속의 균사(substrate mycelium)는 관찰됨을 알 수 있었다.

또한, 상기 균주의 배양학적 특징을 분석한 결과, 상기 균주를 1,4-디옥산이 함유되지 않은 Luria broth(LB), Tryptic soy broth 등의 완전배지에서 배양할 경우, 접종 7일 이후부터 균체를 관찰할 수 있을 정도로 매우 느리게 생육하였다(Mahendra, S. et al., Int. J. of systematic and Evolutionary Microbiology, 55, 593-598, 2005). 반면, 1,4-디옥산 만을 유일한 탄소원으로 함유한 분해 측정용 액체배지에 배양할 경우, 밀가루 모양으로 배지상층부에서 생육하다가 10일 경과 후 증식된 균체가 완전히 현탁되지 않고, floc 형태의 미세한 덩어리로 존재하였으며, 플라스크 벽면과 밑부분에 점질 물질(biofilm)을 많이 생성하였다(Mahendra, S. et al., Int. J. of systematic and Evolutionary Microbiology, 55, 593-598, 2005). 또한, 상기 균의 생육도 측정을 위하여, 상기 균을 종균 배양 배지에 접종한 후 진탕배양기(MaxQ400, Barnstead Int., 벨기에)에서 진탕 배양하면서 일자 별로 1㎖의 배양액을 수취하였고, 이를 분광광도계(Spectrophotometer, evolution300, Thermo electron Co. 영국)를 이용하여 660nm에서 흡광도(Optical density; OD)를 측정하였다.

<2-2> 균주의 동정을 위한 16S rRNA 서열 분석

상기에서 분리된 균주의 16S rRNA 서열을 분석하기 위하여, 분리된 균주로부터 염색체 DNA를 추출하였고, 추출은 QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit(QIAGEN　, CA., 미국)를 이용하였다.　 16S rRNA 유전자는 27F 및 1492R 유니버셜프라이머를 이용하여 증폭하였고, 염기서열분석은 솔젠트사(Solgent Co., Daejeon, 한국)에 의뢰하였다(Richardson, R. E., et al., Environ. Sci. Technol., 36, 2652-2662, 2002). 이렇게 분석된 16S rRNA 유전자를 코딩하는 염기서열(서열번호 1)을 GeneBank BlastN 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)에 적용시켜 상기 균을 동정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 분리된 균주는 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) 균주로 판명되었고, 본 발명자들은 상기 균주를 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주로 명명하였다. 또한, 상기 균주를 2007년 1월 19일에 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 기탁하였다(수탁번호: KACC 91296P).

< 실시예 3> 1,4-디옥산의 GC - Mass spectra 분석 및 슈도노카디아 속( Pseudonocardia sp . ) GB7 균주에 의한 1,4-디옥산의 분해능 측정

<3-1> 1,4-디옥산의 분석 및 분해 확인

1,4-디옥산의 추출 및 분석은 먹는물수질감시항목운영지침 및 시험방법(환경부, 먹는물수질감시항목운영지침 및 시험방법, 2004. 12)에 의하여 수행되었다. 즉, 본 실시예에서는 상기에서 동정된 균주 즉, 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주에 의한 1,4-디옥산의 분해율을 확인하기 위하여, 1,4-디옥산을 함유한 배지(1,4-디옥산분해율측정배지)에 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 접종하기 전 및 접종 후 20일 경과된 상기 배지를 각각 일자 별로 수취하여 4℃, 10,000ppm에서 10분간 원심 분리한 후, 20㎖의 상등액을 분액 깔대기에 취하였다. 이어, 2g의 NaCl,　100㎕의 염산, 및 10㎖의 디클로로메탄을 첨가하여 마개를 한 후 1분간 강하게 흔들어 주었다.　 상 분리여지를 이용하여 상기 디클로로메탄층을 여과하여 취하였다.　 이렇게 여과한 디클로로메탄층액 2㎖을 바이알에 옮긴 후 분석시료로 사용하였다.

또한, 검량선을 작성하기 위한 표준액도 상기 시료와 동일한 전처리 과정으로 처리하여 시료와 함께 가스크로마토그라피/메스(Gas Chromatography/Mass Selective Detector; GC/MSD, Agilent Tech. 5890N+5973i)로 분석하였고, 분석조건은 하기 표 2과 같다.

항목	조건
Injection	Split injection (15:1)
Temperature	200℃
Column	DB-5MS(60 x 0.25, df=1μm
Oven	40℃, 1min 40℃-> 150℃, 10℃/min
Carrier gas	He, 1ml/min
Detector	MSD(SIM mode)
Selected ion(m/z)	88, 58, 43

상기 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, GC-Mass를 이용하여 표준품 1,4-디옥산의 Mass spectra를 나타내었고(도 3a), 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 1,4-디옥산 분해율 측정용 액체 배지에 접종하기 전(도 3b) 및 접종 후 20일이 경과된 후의 고농도 1,4-디옥산을 함유한 배지의 Mass spectra(도 3c)를 각각 GC-Mass를 이용하여 측정한 결과, 후자의 경우 1,4-디옥산의 농도가 급격히 감소하며 새로운 피크가 형성됨을 관찰할 수 있었다. 이는, 본 발명에서 분리된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주가 1,4-디옥산의 분해율이 높음을 의미한다.

<3-2> 슈도노카디아 속( Pseudonocardia sp . ) GB7 균주에 의한 배양시간에 따른 1,4-디옥산 분해능 측정

본 발명의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주에 의한 배양시간에 따른 1,4-디옥산의 분해율 및 균 생육도를　조사하기 위하여 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 구체적으로, 균 증식용 액체배지에서 30℃, 15일간 140rpm으로 진탕 배양한 종균(비유도종균)을 4℃, 10,000ppm으로 원심 분리하여 40㎖의 식염수로 3회 세척한 후, 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지에 접종하고, 30℃, 140rpm으로 배양하면서 일자 별로 1,4-디옥산의 분해율 및 균 생육도를 각각 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지에 접종한 후 5일까지는 1,4-디옥산의 농도가 97,000ppb로 거의 분해가 일어나지 않았으며, 7일까지는 83,000ppb가 잔류되어 있어, 5~7일간 균의 초기 생육적응기(lag period)가 요구됨을 알 수 있었다(도 4).

또한, 접종 후 8일 이후부터 본격적인 분해가 시작되어 10일 정도에서 60,000ppb 정도가 잔류되었고, 13일 경과 후 49,000ppb가 잔류되어 총 1,4-디옥산량의 약 50%가 분해됨을 보였다(도 4).　 13일 이후부터는 급격하게 분해가 일어나, 20일 정도에서 4900ppb가 잔류되어, 분해율이 95% 정도로　나타났다(도 4).

반면, 상기 균주와 동일한 조건으로 배양한 후, 　1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지에 접종한 대조군인 대장균(E. coli W3110)의 경우, 접종 초기의 1,4-디옥산 농도(97,000ppb)가 20일 배양 후에도 거의 동일하게 잔류되어 있음을 확인할 수 있었고(도 4), 이는 상기 대장균에서는 1,4-디옥산의 분해가 일어나지 않음을 의미한다.

상기 균주의 배양시간에 따른 1,4-디옥산의 분해율 및 균체 증식에 따른 흡광도의 변화를 살펴보면, 균의 증식은 1,4-디옥산의 분해가 일어나는 접종 후 8일 이후부터 흡광도가 서서히 증가하기 시작하였고, 10일 이후부터 20일까지 흡광도가 급격히 증가하여 이 기간이 대수성장기(log period)임을 알 수 있었다(도 4). 배양 후 20일 정도에서　흡광도가 최고로 나타나는 상기 균주의 생육도는 앞서 언급한 1,4-디옥산의 분해율 결과와 일치하는 양상을 보였으며, 20일 이후부터는 잔류된 1,4-디옥산의 양도 큰 변화를 나타내지 않았고, 균체 증식 또한 정지기(stationary period)로 나타남을 알 수 있었다(도 4).

<3-3> 1,4-디옥산 분해효소가 유도된 슈도노카디아 속( Pseudonocardia sp . ) GB7 균주에 의한 고농도 1,4-디옥산 분해능 측정

초기 생육적응기(lag period)를 제거하여 상기 균주에 의한 1,4-디옥산의 분해 시간을 단축하기 위한 방법으로, 본 실시 예에서는 상기 균주를 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지에 접종하기 전, 1,4-디옥산 분해효소 및　1,4-디옥산 분해 후 생성되는 산물의 분해에 관련된 효소를　포함하는 효소생산 유도배지를 종균 배양 배지로 이용하여 1,4-디옥산 분해효소 생산을 유도하였다.　　

즉, 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜 및 테트라하이드로푸란에 의해 1,4-디옥산 분해효소 및 1,4-디옥산 분해 중간산물을 분해하는 효소가 유도된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주와 1,4-디옥산 분해효소가 유도되지 않은 상기 균주를 대조군로 하여 1,4-디옥산의 분해 양상을 조사하였다.

구체적으로, 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 및 테트라하이드로푸란이 각각 최종농도가 100ppm(100,000ppb), 1.0 ppm(1,000ppb), 및 1.0 ppm(1,000ppb)이 되도록 탄소원으로 함유된 1,4-디옥산 분해효소 생산유도배지에서 30℃,　140rpm으로 15일간 진탕 배양한 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 유도종균(실험군)으로 이용하였고,　균 증식용 액체배지에서 30℃, 　140rpm으로 15일간 진탕 배양한 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 비유도종균(대조군)으로 이용하였다. 이어, 상기 유도종균 및 비유도종균을 각각 97,000ppb의 1,4-디옥산을 함유한 분해 측정용 액체배지에 각각 접종한 후 30℃, 140rpm으로 진탕 배양하면서 일자 별로 유도종균 및 비유도종균간의 1,4-디옥산의 분해율(잔류량) 및 비유도종균 배양액의 pH 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 1,4-디옥산 분해효소가 비유도된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주(비유도종균)에 의한 　고농도의 1,4-디옥산 분해율은 상기 실시예 3-2의 비유도균의 1,4-디옥산 분해율과 동일하였으며, pH의 변화는 접종 초기에 pH가 7.0인 것이 7일 후엔 6.93으로, 21일 후에는 6.74로 감소하였다(도 5). 반면, 1,4-디옥산 분해관련 효소가 유도된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주(유도종균)에 의한　1,4-디옥산의 분해율은 접종 1일 후부터 분해가 시작되었고, 비유도종균에서 나타났던 5일 이상의 균 생육적응기가 제거되었으며, 접종 후 7일 후에는 57,000ppb가 잔류되어 약 42%의 1,4-디옥산이 분해되었고, 10일 후에는 13,000ppb가 잔류되어 86.6%의 1,4-디옥산이 분해되었다(도 5). 또한, 15일 경과 후에는 2500ppb가 잔류되어 97.5%가 분해되었다.

이러한 결과로부터, 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 및 테트라하이드로푸란이 각각 최종농도가 100ppm(100,000ppb), 1.0 ppm(1000ppb), 및 1.0 ppm(1,000ppb)이 되도록 함유된 1,4-디옥산 분해효소 생산유도배지에서 생육시킨 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주를 종균으로 이용하는 것은, 초기 생육적응기를 감소시켜 상기 균주의 처리시간 단축 및 1,4-디옥산의 분해 효율을 증가시켜 고 효율적인 1,4-디옥산의 분해를 위한 조건이 될 수 있다.

<3-4> 1,4-디옥산 분해효소 유도 및 유도되지 않은 슈도노카디아 속( Pseudonocardia sp . ) GB7 균주에 의한 저농도 1,4-디옥산 분해능 측정

1,4-디옥산 분해효소 생산유도배지에서 배양한 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주(유도종균)와 균 증식용 액체배지에서 배양한 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주(비유도종균)를 저농도의 1,4-디옥산(10,000ppb)를 포함하는 분해 측정용 액체배지에 접종하여, 30℃, 140rpm으로 진탕 배양하면서 일자 별로 배양액을 수취하여 상기 종균들에 따른 1,4-디옥산의 분해율을 비교하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 저농도의 1,4-디옥산을 포함하는 분해 측정용 액체배지에 접종된 비유도종균의 경우, 접종 후 5일 이후부터 1,4-디옥산의 분해가 활발하게 일어났으나,　고농도의 1,4-디옥산을 포함하는 분해 측정용 액체배지에서와 마찬가지로 일정기간의 초기 생육적응기 즉, 효소생산 유도기간이 요구됨을 알 수 있었다(도 6). 또한, 1,4-디옥산의 농도가 낮을 경우 적응기가 약간 짧아지는 것으로 나타났으며, 고농도 배지에서는 13일 경과 후 49,000ppb가 잔류되어 총 1,4-디옥산 양의 약 50%가 분해된 것으로 나타났으나(도 5), 저농도 배지에서는 11일 경과 후에 약 50%가 분해되었다(도 6). 또한, 고농도 배지에서는 20일 정도에서 4900ppb가 잔류량으로 나타나 분해율이 95% 정도로 나타낸 반면(도 5), 저농도 배지에서는 17일 경과 후 441ppb가 잔류되어 분해율이 96%인 것으로 나타났다(도 6). 20일이 경과 후에는 280ppb가 잔류되어 분해율이 98%로 나타나, 저농도의 1,4-디옥산이 함유된 배지에서　상기 비유도종균에 의한 분해 속도 및 분해율이 고농도에서보다 우수한 것으로 나타났다.

반면, 1,4-디옥산 분해효소 생산유도배지에서 유도된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp .) GB7 균주(유도종균)를 저농도 1.4-디옥산 분해 측정용 액체배지에 접종된 유도종균의 경우, 비유도종균 접종 시 나타난 5일 정도의 최초 생육적응기가 나타나지 않았다(도 6). 접종 후 6일이 경과된 후, 상기 유도종균에 의해 분해된 상기 액체배지에 잔류된 1,4-디옥산의 양은 5180ppb로서 약 50%의 분해율을 나타내었고, 10일 경과 후에는 96%, 15일 경과 후에는 230ppb가 잔류되어 98.7%의 1,4-디옥산의 분해율을 나타내었다(도 6).

< 실시예 4> 1,4-디옥산의 최적분해 조건

<4-1> 온도의 영향

슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주에 의한 1,4-디옥산 분해의 최적 온도를 측정하기 위하여, 종균 배양 배지(1,4-디옥산 분해효소 생산유도배지)에서 배양시킨 본 발명의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주(유도종균)를 4℃, 10,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 수집한 후, 40㎖의 생리식염수로 3회 세척한 다음 고농도 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지를 함유한 4개의 플라스크에 각각 접종하였다. 상기 플라스크를 통기성 실리콘으로 면전을 한 후, 25℃, 30℃, 35℃, 및 40℃의 온도 조건에서 140rpm으로 진탕 배양하였다. 또한, 특정 온도에서 자연 분해율을 측정하기 위한 대조군 실험을 위하여, 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지를 함유한 1개의 플라스크에 균을 접종하지 않고, 30℃에서 140rpm으로 진탕 배양하면서 일자 별로 배양액을 채취하여 1,4-디옥산의 분해 양상을 조사하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주를 접종하지 않고 30℃에서 진탕 배양한 배양액에서는 1,4-디옥산의 농도 변화는 전혀 나타나지 않았다(도 7).　 반면, 1,4-디옥산 분해효소생산이 유도된 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주(유도종균)을 접종하여 30℃에서 배양한 배양액에서 가장 높은 96%의 분해율 및 가장 빠른 분해 속도를 나타내었다(도 7). 또한, 35℃에서 배양한 경우, 초기 3~4일간의 생육기간에는 30℃에서와 유사한 분해 양상을 보였으나, 5일 이후부터 분해 속도가 늦어지면서 완만한 분해 양상을 나타내었고, 접종 20일 후 약 87%의 분해율을 나타냄을 알 수 있었다(도 7). 또한, 25℃에서 배양한 경우에는 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주의 생육이 35℃에서 배양한 균주의 것보다 더욱 느리게 일어남을 관찰하였는데, 이는 균의 생육도가 1,4-디옥산의 분해 속도에 영향을 미친다는 것을 의미한다. 따라서, 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주의 생육 속도 및 1,4-디옥산의 분해 속도에 요구되는 최적 온도는 30℃ 부근임을 알 수 있다.

<4-2> 산소의 영향

슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주에 의한 1,4-디옥산 분해에 있어서, 산소의 영향을 알아보기 위하여 종균 배양 배지(1,4-디옥산 분해효소 생산유도배지)에서 30℃, 140rpm으로 15일간 진탕 배양한 본 발명의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주를 4℃, 10,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 수집한 후, 40㎖의 생리식염수로 3회 세척한 다음,　고농도 1,4-디옥산 분해 측정용 액체배지를 함유한 2개의 플라스크에 각각 접종하였다. 상기 플라스크를 통기성 실리콘으로 면전을 한 후, 각각 정치배양(0 rpm) 및 140rpm으로 진탕 배양하면서 일자 별로 배양액을 수취하여 1,4-디옥산의 분해율을 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 산소 전달량에 따른 1,4-디옥산의 분해율은　전체적으로 유사한 양상을 보였다(도 8). 즉, 분해가 본격적으로 시작되는 접종 후 5일에는 진탕 배양액에서 88,680ppb가 잔류되었고, 정치 배양액에서 91,722ppb가 잔류된 것으로 나타났다(도 8). 접종　9일 후에는 진탕 배양액에서 49,454ppb가 잔류되어 약 54%가 분해되었고, 정치 배양액에서는　57,544ppb가 잔류되어 약 52%의 분해율을 나타내었다(도 8). 12일 경과 후, 진탕 배양액에서는 5,233ppb가 잔류되어 약 95%가 분해되었고, 정치 배양액에서는 10,362ppb가 잔류되어 약 91%의 1,4-디옥산이 분해되었다(도 8). 또한, 15일 경과 후에는 진탕 배양액에서 2,770ppb가 잔류되어 97.4%가 분해되었고, 정치 배양액에서는 2,881ppb가 잔류되어 97.3%가 분해되었다(도 8).

상기 결과로부터, 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주에 의한 1,4-디옥산 분해에 미치는 산소의 영향은 진탕 배양 및 정치 배양 모두에서 그 차이가 거의 나타나지 않았다(도 8). 또한, 접종 15일 후 1,4-디옥산 분해율도 진탕 배양에서는 약 95%, 정치배양에서는 약 91% 정도로 나타나 분해율 또한　 큰 차이가 나타나지 않음을 알 수 있었다(도 8).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주 및/또는 이의 배양물은 1,4-디옥산을 효율적으로 분해할 수 있을 뿐 아니라, 종래에 사용되고 있는 1,4-디옥산의 화학적 처리 방법의 문제점 즉, 새로운 시설장비 설치, 고가의 유지 비용, 및 처리 후 생성되는 다양한 부산물들에 의한 환경오염 등을 해결할 수 있기 때문에, 1,4-디옥산 분해제로 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Governor of Gyeongsangbuk-do <120> NOVEL PSEUDONOCARDIA SP. WITH DEGRADABLE ACTIVITY OF 1,4-DIOXANE AND/OR ITS CULTURE, AND USASE THEROEOF <130> DPP20070256KR <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1377 <212> DNA <213> Coding sequence for 16S rRNA of Pseudonocardia sp. strain GB7(KATCC 91296P) <400> 1 tcgagcggta aggcctttcg gggtacacga gcggcgaacg ggtgagtaac acgtgggcga 60 cctgccctcc actctgggat aagcccggga aactgggtct aataccggat atgaccttcc 120 ctcgcatggg ggttggtgga aagtttttcg gtgggggatg ggcccgcggc ctatcagctt 180 gttggtgggg tgatggccca ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg 240 ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 300 gcaatgggcg aaagcctgac gcagcgacgc cgcgtggggg atgacggcct tcgggttgta 360 aacctctttc gccagggacg aagcgcaagt gacggtacct ggataagaag caccggccaa 420 ctacgtgcca gcagccgcgg taacacgtag ggtgcgagcg ttgtccggaa ttattgggcg 480 taaagagctc gtaggcggtc tgtcgcgtcg gtcgtgaaaa cttggggctt aactctgagc 540 ttgcggtcga tacgggcatg actggagttc ggcaggggag actggaattc ctggtgtagc 600 ggtgaaatgc gcagatatca ggaggaacac cggtggcgaa ggcgggtctc tgggccgata 660 ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 720 ccgtaaacgt tgggcgctag gtgtgggggc cattccacgg tctctgtgcc gcagctaacg 780 cattaagcgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg 840 ggcccgcaca agcggcggag catgtggatt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg 900 ggtttgacat gcaccagaca tccctagaga tagggcttcc cttgtggttg gtgtgcaggt 960 ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1020 aacccttgtt ccatgttgcc agcacgtaat ggtggggact catgggagac tgccggggtc 1080 aactcggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgtcc agggcttcac 1140 acatgctaca atggccagta cagagggctg cgagaccgtg aggtggagcg aatctcttaa 1200 agctggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagttgg agtcgctagt 1260 aatcgcagat cagcaacgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1320 acgtcacgaa agttggtaac acccgaagcc ggcggcccaa cccttgtgga gggagtc 1377

Claims (9)

1,4-디옥산의 최종분해율(%)이 95% 내지 98.7%이고 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주.

제1항에 따른 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주 또는 이의 배양물을 1,4-디옥산을 함유하는 시료와 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하는, 1,4-디옥산의 분해 방법.

삭제

제 2 항에 있어서, 상기 배양물은 상기 슈도노카디아 속GB7 균주를 1,4-디옥산(1,4-dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)를 포함하는 배지에서 배양하여 1,4-디옥산 분해효소가 유도된 것인, 분해 방법.

삭제

제 2항에 있어서, 상기 배양물에 접종된 균체수는 1,4-디옥산이 시료 1L 당 최종농도가 10ppm(10,000ppb) 내지 100ppm(100,000ppb))로 함유하는 시료 1L 당 1 X 10¹⁰ 내지 1 X 10¹¹ 개인 것인, 분해 방법.

삭제

1,4-디옥산(1,4-dioxane), 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 및 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran, THF)을 포함하는, 제1항에 따른 1-4-디옥산 분해효소를 유도하는 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) 균주 생산용 배양 배지.

제1항에 따른 수탁번호 KACC 91296P의 슈도노카디아 속(Pseudonocardia sp.) GB7 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 1,4-디옥산 분해제.

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