KR102238653B1 - 토양에서 유기염소계 농약을 분해할 수 있는 신규 스트렙토마이세스 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유기염소계 농약 분해능을 갖는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주(수탁번호: KACC 92284P)를 제공한다. 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주(수탁번호: KACC 92284P)는 유기염소계 농약, 특히 엔도설판(endosulfan)에 대한 분해능이 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주(수탁번호: KACC 92284P)는 세포내효소(endoenzyme)가 관여하는 대사에 의해 유기염소계 농약을 분해한다. 따라서, 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주(수탁번호: KACC 92284P)는 유기염소계 농약으로 오염된 토양 또는 수계의 생물학적 처리에 유용하다.

Description

토양에서 유기염소계 농약을 분해할 수 있는 신규 스트렙토마이세스 속 균주 및 이의 용도{Novel Streptomyces sp. capable of degrading organochlorine pesticide in soil and use of the same}

본 발명은 신규 스트렙토마이세스 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 유기염소계 농약 분해능이 우수한 신규 스트렙토마이세스 속 균주 및 이를 통해 유기염소계 농약의 분해, 유기염소계 농약이 함유된 토양 등의 처리 방법에 관한 것이다.

현재 여러 지역의 토양과 수계에는 유기물질뿐만 아니라, 여러 종류의 농약들이 포함되어 있다. 이러한 여러 종류의 농약들 중에서, 특히 유기염소계 농약은 농작물의 살충제로서 많이 사용되는 물질로서, 인삼밭 및 과수 토양과 인근 하천에서 많이 문제가 되고 있는 유해한 고독성 물질이다. 이러한 유기염소계 농약은, 대부분 환경 호르몬으로서 생체 내에 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 구조적 특징으로 인하여 토양 내에서 긴 잔류기간을 보이고 있으며 자연분해가 어려워 환경오염의 주요 원인물질로 대두되고 있다.

특히 고독성으로 알려져 있는 유기염소계 농약인 엔도설판(endosulfan)은 1956년 독일에서 개발된 유기염소계 살충제 농약으로 담배의 땅강아지, 거세미나방, 배추의 벼룩잎벌레, 뽕나무의 애바구미 방제용 토양살충제로 사용되어 왔으나, 이의 유해성으로 인해 국내에서 2015년부터 사용이 금지되었다. 현재 국내 토양에서 유기염소계 농약이 상당량 잔류되어 있어서, 토양 오염을 유발할 수 있는바, 이를 해결할 필요가 있다. 유기염소계 농약인 엔도설판(endosulfan)은 미생물에 의해 중간대사산물인 엔도설판 설페이트(endosulfan sulfate)와 엔도설판디올(endosulfan diol)로 분해되는 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로는, 엔도설판(endosulfan)은 2가지 반응인 산화반응과 가수분해반응을 통해서 분해가 각각 이루어진다. 우선, 산화반응을 통해서는, 엔도설판 설페이트로 분해가 이루어진다. 하지만, 가수분해반응을 통해서는, 엔도설판 디올로 분해가 이루어진 후, 엔도설판 에테르(endosulfan ether)로 분해되고 나서, 최종적으로 엔도설판 락톤(endosulfan lactone)으로 분해된다.

그동안 국내외에서 미생물을 이용하여 유기염소계 등 농약을 생물학적으로 처리하는 방법에 대한 연구가 다양하게 진행되어 왔다. 종래의 유기염소계 농약 분해능을 가지는 미생물로슨 슈도모나스속(Pseudomonas sp.) 균주, 바실러스속(Bacillus sp.) 균주 등이 알려져 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허공보 제10-0336195호에는 유기염소계 농약 PCNB를 호기적으로 분해할 수 있는 호기성 세균 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) KTYY97(수탁일 1998년 5월 18일, 생명공학공업기술연구소, 수탁번호 FERM BP-6721호)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0549404호에는 엔도설판, 엔도설판 설페이트, 또는 엔도설판 및 엔도설판 설페이트의 분해능을 가진 클레브시엘라 옥시토카 KE-8(Klebsiella oxytoca KE-8) (기탁번호: KCTC 10551BP) 균주가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0761339호에는 호기성 조건에서 생육이 양호하고 엔도설판과 그 독성 대사산물인 엔도설판 설페이트의 분해능이 개선된 미생물 슈도모나스 KS-2P(Pseudomonas sp. KS-2P) (기탁번호 KCTC 10874BP)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1509326호에는 유기물 및 엔도설판 분해능이 우수한 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1(KCTC 12447BP) 및 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3(KCTC 12448BP)가 개시되어 있다. 또한, 일본 등록특허공보 제4395712호에는 아미드계 농약을 분해하는 노카르디오이데스 속(Nocardioides sp.), 로도코커스 속(Rhodococcus sp.) 또는 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.) 중 하나에 속하는 미생물을 적어도 1종 이상 이용하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 일본 등록특허공보 제5160443호에는 염소화, 메틸 티오화 및 메톡시화 트라이진계 농약을 분해하는 노카르디오이데스 MTD-22(Nocardioides MTD-22) (기탁번호: FERM BP-10849)가 개시되어 있다.

본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 유기염소계 농약 분해능이 우수한 신규 스트렙토마이세스 속 균주 및 이를 통해 유기염소계 농약의 분해, 유기염소계 농약이 함유된 토양 등의 처리 방법을 제공하는데에 있다.

본 발명의 발명자들은 토양으로부터 유기염소계 농약에 대해 내성을 가지면서 동시에 유기염소계 농약을 분해할 수 있는 방선균을 스크리닝하였고 이 중에서 특정 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) 균주가 대표적인 유기염소계 농약인 엔도설판(endosulfan) 및 이의 중간대사산물인 엔도설판 설페이트(endosulfan sulfate), 엔도설판 디올(endosulfan diol), 엔도설판 에테르(endosulfan ether) 등에 대해 우수한 분해능을 가지는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 해결하기 위해, 본 발명의 일 예는 유기염소계 농약 분해능을 갖는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)을 제공한다.

상기 목적을 해결하기 위해, 본 발명의 일 예는 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 배양액, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 세포 파쇄물, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 세포 파쇄물로부터 수득한 상등액 또는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 세포내효소(endoenzyme)로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효성분을 포함하는 유기염소계 농약 분해제를 제공한다.

상기 목적을 해결하기 위해, 본 발명의 일 예는 상기 유기염소계 농약 분해제를 사용하여 유기염소계 농약 또는 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 토양을 처리하는 것을 특징으로 하는 토양 처리방법을 제공한다.

상기 목적을 해결하기 위해, 본 발명의 일 예는 상기 유기염소계 농약 분해제를 사용하여 유기염소계 농약 또는 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 수계를 처리하는 것을 특징으로 하는 수계 처리방법을 제공한다.

본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)는 유기염소계 농약, 특히 엔도설판(endosulfan)에 대한 분해능이 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)는 세포내효소(endoenzyme)가 관여하는 대사에 의해 유기염소계 농약을 분해한다. 따라서, 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)는 유기염소계 농약으로 오염된 토양 또는 수계의 생물학적 처리에 유용하다.

도 1은 엔도설판(endosulfan)에 대해 내성을 갖는 균주의 선별 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 엔도설판(endosulfan) 분해능이 우수한 균주의 선별 실험에서 7일 동안 배양한 관리번호 14731, 14747, 14850, 14903 균주 배양액을 가스크로마토그래피로 분석한 결과 스펙트럼이다.
도 3은 엔도설판(endosulfan) 선별된 엔도설판(endosulfan)에 대해 내성을 갖는 균주 배양액에 존재하는 엔도설판(endosulfan)과 이의 여러가지 분해산물(metabolite)을 가스크로마토그래피를 이용하여, 배양 시간이 7일 경과되었을 때 분석한 결과이다.
도 4는 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등 및 멸균 처리된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 세포 중량 대비 엔도설판(endosulfan)의 분해능을 비교한 결과이다.
도 5는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 계통분석도이다.
도 6은 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등 및 멸균 처리된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 세포중량을 비교한 결과이다.
도 7은 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등 및 멸균 처리된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 엔도설판(endosulfan)의 잔류 농도를 비교한 결과이다.
도 8은 각 회수 일자에 대한 엔도설판(endosulfan)의 농도와 바이오매스(biomass)의 양을 나타내었고, 엔도설판(endosulfan)의 여러가지 분해산물의 농도를 나타낸 것이다.
도 9는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주로부터 얻은 조효소액에 의한 엔도설판(endosulfan)의 분해 거동을 나타낸 것이다.
도 10은 토양 환경에서 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 엔도설판(endosulfan) 분해율(%)을 측정한 것이다.
도 11은 멸균된 목분 대 1.0×10⁸cfu/mL 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양액을 1:1의 중량비로 혼합 및 균질화하여 목분-미생물 담체를 제조한 뒤, 상기 목분-미생물 담체를 60%RH, 30℃에서 15일, 30일 및 45일 동안 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 포자를 형성시켜 상기 포자 형성의 정도를 나타낸 것이다.
도 12는 직경 1 내지 20mm를 가지는 합성 제올라이트에 1.0×10⁸cfu/mL 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양액을 침지하여 제조한 제올라이트-미생물 담체가 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 수계에 투입되고, 산소가 충분히 공급되는 호기 조건에서 C:N:P=100:15:1, C:N:P=100:10:1 및 C:N:P=100:5:1인 촉진제(stimulant)를 투입하여 얻은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 세포 건조 중량을 나타낸 것이다.

본 발명의 사상은 제시되는 실시예에 제한되지 아니하고, 본 발명의 사상을 이해하는 통상의 기술자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본원 발명 사상 범위 내에 포함된다고 할 것이다.

이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어인 "배양액"이란 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 미생물이 포함되는 개념이다.

본 발명에서 사용되는 용어인 "조성물"이란 2가지 이상의 성분이 균일하게 혼합되어 있는 상태의 물질을 의마하며, 완제품뿐만 아니라 완제품 제조를 위한 중간 소재를 포함하는 개념이다.

이하, 본 발명에 관해서 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면은 농업, 환경 분야에서 매우 유용한 신규 스트렙토마이세스 속 균주에 관한 것이다.

본 발명의 일 예에 따른 신규 스트렙토마이세스 속 균주는 토양에서 분리되고 유기염소계 농약 또는 이의 중간대사산물에 대해 우수한 분해능을 갖는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)이다. 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)는 바람직하게는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함한다. 또한, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)는 바람직하게 탄소원으로 글루코스(Glucose), L-아라비노스(L-Arabinose), 갈락토스(Galactose), D-만니톨(D-Mannitol), 수크로스(Sucrose), 프락토스(Fructose), 말토스(Maltose), I-이노시톨(I-Inositol)을 이용할 수 있는 반면, 셀룰로스(Cellulose)는 이용하지 못한다. 또한, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)는 바람직하게 전분(starch), 카제인(casein), 티로신(tyrosine)에 대해 분해능을 보이나 잔틴(xanthine)에 대해서는 분해능을 보이지 않는다.

본 발명에서 상기 유기염소계 농약은 탄화수소에 염소가 공유결합하고 있는 구조를 취하는 농약으로서, 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 DDT(Dichlorodiphenyltrichloroethane), BHC(β-Hexachlorocyclohexane), DDE(Dichlorodiphenyldichloroethylene), DDD(Dichlorodiphenyldichloroethane), 엔도설판(Endosulfan), 알드린(Aldrin), PCNB(Pentachloronitrobenzene), PCP(Pentachlorophenol), 아조시스트로빈(azoxystrobin), 캡탄(captan), 사이퍼메트린(cypermethrin), 델타메트린(deltamethrin), 다이엘드린(dieldrin), 다이페노코나졸(difenoconazole), 엔드린(endrin), 펜헥사미드(fenhexamid), 퀸토젠(quintozene) 등이 있으며, 이 중 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 분해능을 고려할 때 엔도설판(Endosulfan)인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 측면은 신규 스트렙토마이세스속 균주의 다양한 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P), 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 배양액, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 세포 파쇄물, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 세포 파쇄물로부터 수득한 상등액 또는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 세포내효소(endoenzyme)로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효성분을 포함하는 유기염소계 농약 분해제를 제공한다. 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 배양액은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)를 배지에서 배양시켜 수득한 산물로서, 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주(수탁번호: KACC 92284P)를 포함한다. 상기 배지는 방선균 배양에 사용되는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 GYSM 배지, 흄산 한천 배지(Humic acid agar medium), 베네트 한천 배지(Bennett's agar medium), MM 배지(minimal medium)일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 유기염소계 농약 분해제는 바람직하게는 유효성분인 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P) 또는 이로부터 유래하는 다양한 산물 외에 미생물 제제에 통상적으로 이용되는 성분들을 더 포함하는 조성물 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 유기염소계 농약 분해제는 비타민 C, 항산화제, 황토, 포도당, 재강슬래그, 해조류 등의 부형제 및 효소안정제가 포함될 수 있다. 상기 부형제 및 효소안정제는 본 발명의 목적을 해치지 않는 범위 내에서 당업자에 의해 적절한 비율로 배합될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 유기염소계 농약 분해제는 액상형태, 또는 동결건조, 열풍건조, 감압건조 등을 이용하여 건조된 건조분말형태의 제형으로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 유기염소계 농약 분해제에서 유효성분인 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P) 또는 이로부터 유래하는 다양한 산물의 함량은 크게 제한되지 않으며 예를 들어 유기염소계 농약 분해제 조성물 총 중량을 기준으로 0.1~10 중량%, 바람직하게는 0.5~5 중량%의 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 예는 전술한 유기염소계 농약 분해제를 사용하여 유기염소계 농약 또는 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 토양을 처리하는 것을 특징으로 하는 토양 처리방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 전술한 유기염소계 농약 분해제를 사용하여 유기염소계 농약 또는 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 수계를 처리하는 것을 특징으로 하는 수계 처리방법을 제공한다. 상기 유기염소계 농약의 분해 산물은 유기염소계 농약이 분해되면서 발생하는 중간 산물로서 토양 오염이나 수계 오염을 초래하는 물질을 의미한다. 본 발명의 일 예에 따른 유기염소계 농약은 그 종류가 제한되지 않으며, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 분해능 및 환경오염원으로서의 고독성 등을 고려할 때 엔도설판(endosulfan)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 유기염소계 농약의 분해 산물은 엔도설판(endosulfan) 설페이트, 엔도설판(endosulfan) 다이올 또는 엔도설판(endosulfan) 에테르에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 신규 균주인 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)는 호기성 조건하에서 생육이 양호하고 고독성의 유기염소계 농약인 엔도설판과 그 대사산물인 엔도설판 설페이트에 대한 분해능이 우수한 균주로서, 엔도설판으로 오염된 토양 및 수계의 생물학적 처리에 유용하게 이용할 수 있으며, 엔도설판 및 엔도설판 설페이트와 관련된 환경오염의 처리를 위한 생물제제의 개발 및 다양한 생물학적 환경정화기술(Bioremedation)에 광범위하게 응용할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)는 엔도설판을 분해할 수 있는 능력을 보유함과 동시에, 엔도설판 분해시 생성되는 유독한 중간대사산물인 엔도설판 설페이트도 분해 할 수 있는 능력을 함께 보유함으로써, 엔도설판을 효과적으로 처리할 수 있으며, 분리원이 토양이기 때문에 오염토양에 적용시 토양의 환경변화를 주지 않는 미생물제제이다.

본 발명에서 제공하는 신규 균주인 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등이 토양에 잔존한 유기염소계 농약을 분해하기 위한 구체적인 방법으로, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등과 멸균된 목분을 혼합하여 목분-미생물 담체를 제조하고, 상기 목분-미생물 담체를 사용하여 토양에 잔존한 유기염소계 농약을 분해할 수 있다. 목분(wood flour)은 원목을 파쇄 및 분쇄하여 수득한 것으로 경우에 따라 모래나 고분자(PP, PA 등)이 더 혼합될 수 있다. 상기 목분은 통상적으로 당업계에서 사용하는 것이라면 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등과 혼합성, 균일성을 고려하면 5~20mesh 체를 통과한 목분을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 멸균된 목분은 상기 목분을 멸균하여 수득할 수 있다. 상기 목분을 멸균하는 과정은 당업계에서 사용하는 것이라면 멸균온도나 멸균시간에 대해서 특별히 제한이 있는 것은 아니며 1차 멸균이 이루어진 후, 목분에 있는 잔여 미생물의 포자를 재발아 시키고 2차 멸균을 하는 과정을 통해 상기 멸균된 목분을 수득할 수도 있다. 상기 목분-미생물 담체는 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등으로 제조된 유기염소계 농약 분해제 대 상기 멸균된 목분을 혼합하여 제조할 수 있다. 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등으로 제조된 유기염소계 농약 분해제 대 상기 멸균된 목분의 중량비는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 토양에서 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등이 발아하는 환경을 고려하면 1:0.1 내지 1:3인 것이 바람직하고, 상기 중량비가 1:0.5 내지 1:1.5인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 농도는 특별히 제한되는 것은 아니지만 적어도 1.0×10⁸ cfu/mL 이상의 농도를 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 목분-미생물 담체는 상기 유기염소계 농약 분해제 및 상기 멸균된 목분을 혼합 한 후 상기 유기염소계 농약 분해제가 상기 멸균된 목분에 정착하여 포자를 형성시키는 포자 형성 과정을 포함한 과정을 통해 제조될 수 있으며, 상기 포자 형성 과정은 토양 환경에 맞춰 적당한 기간동안 이루어 질 수 있다. 예를 들면, 60%의 습도 및 30℃의 토양 환경인 경우 상기 유기염소계 농약 분해제 및 상기 멸균된 목분의 혼합물을 약 2주 내지 4주 동안 1.0×10⁶ spore/g이상이 되도록 포자를 형성시킨 후, 상기 목분-미생물 담체로 사용할 수도 있다.

본 발명에서 제공하는 신규 균주인 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등이 수계에 잔존한 유기염소계 농약을 분해하기 위한 구체적인 방법으로, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등과 제올라이트(Zeolite)를 혼합하여 제올라이트-미생물 담체를 제조하고, 상기 제올라이트-미생물 담체를 사용하여 수계에 잔존한 유기염소계 농약을 분해할 수 있다. 제올라이트(Zeolite)는 미세 다공성 알루미늄 규산염 광물로서, 본 발명에서 사용되는 제올라이트는 천연 또는 합성 제올라이트를 포함한다. 상기 제올라이트는 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등을 적절히 충전하여 제올라이트-미생물 담체를 제조할 수 있으면 직경에 특별히 제한이 있는 것은 아니며, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등과 혼합성, 균일성을 고려하면 1~20mm의 직경을 가진 제올라이트를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제올라이트-미생물 담체는 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등으로 제조된 유기염소계 농약 분해제를 상기 제올라이트에 침지하여 제조할 수 있으며, 이들의 중량비 또는 부피비는 특별히 제한되지 않는다. 또한, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 농도는 특별히 제한되는 것은 아니지만 적어도 1.0×10⁸ cfu/mL 이상의 농도를 가지는 것이 바람직하다. 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등과 상기 제올라이트의 혼합물은 상기 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 활성을 향상시키기 위해 호기 조건에서 처리되어 상기 제올라이트-미생물 담체를 제조할 수 있으며, 상기 호기 조건에서 처리되는 상기 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등과 상기 제올라이트의 혼합물은 C:N:P=100:15:1 내지 C:N:P=100:5:1의 비율을 가진 탄소(또는 질소, 인)원으로 인해 상기 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 증식을 촉진시킨 상기 제올라이트-미생물 담체를 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것이 아니다.

1. 유기염소계 농약 분해능이 우수한 균주의 선별

(1) 방선균으로부터 엔도설판(endosulfan)에 대해 내성을 가지는 균주의 선별

방선균 분리원은 경기도 용인시 처인구에 있는 논 및 밭에서 채취한 흙으로 사용하였다. 구체적으로, 채취한 흙 1g을 멸균된 증류수 10mL로 현탁하고, 멸균 증류수로 100배 희석한 후, 희석액 100μL를 취하여 HV 한천 평판 배지(증류수 1L당 1.0g의 Humic acid, 0.5g의 Na2HPO4, 0.71g 의 KCl, 0.05g의 MgSO4·7H2O, 0.01g의 FeSO4·7H2O, 0.02g의 CaCO3, B- Vitamins solution 및 18g의 agar 함유; pH 7.2)에 도포하고 28℃에서 7일 동안 배양하였다. 이후, 방선균 형태 의 콜로니를 선별하고 BN 한천 평판 배지(증류수 1L당 Glucose 10g, Yeast extract 1g, Bacto-peptone 2g, Beef extract 1g, Agar 15-20g 함유; pH 7.2), Distilled water 1 L)에서 순수 분리된 콜로니를 수득한 후 엔도설판(endosulfan) 에 대해 내성을 갖는 균주의 선별 실험에 사용하였다.

엔도설판(endosulfan)에 대해 내성을 갖는 균주를 선별하기 위하여 minimal medium인 MM 배지에 100 ㎎/L의 엔도설판(endosulfan)을 첨가하여 사용하였다. 증류수 1L당 2g의 KH₂PO₄, 7.5g의 K₂HPO₄, 1g의 NH₄Cl, 0.5g의 NaCl, 0.1g의 MgSO₄·7H₂O, 1㎎의 nicotinic acid, 15g의 agar 및 10mL의 trace element solution(TES)을 첨가하여 pH 6.8의 BSM 배지를 조제하였다. 상기 TES 용액은 증류수 1L당 20㎎의 (NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O, 50㎎의 H₃BO₃, 30㎎의 ZnCl₂, 3㎎의 CoCl₂·6H₂O, 10㎎의 (CH₃COO)2Cu·H₂O 및 20㎎의 FeCl₂·6H₂O를 첨가하여 제조한 것이다. 이후, BSM 배지에 100㎎의 엔도설판(endosulfan; 순도 99.5%) 및 분산제로서 0.5mL의 Tween80을 첨가하여 엔도설판(endosulfan) 함유 배지를 제조하였다. 이후, 엔도설판(endosulfan) 함유 배지와 엔도설판(endosulfan)을 함유하지 않는 배지에 동일하게 방선균을 접종하고 28℃에서 7일 동안 배양하였다. 이후, 엔도설판(endosulfan) 함유 배지에서 생육이 저해되지 않는 균주를 선별하고 다음 실험에 사용하였다.

도 1은 엔도설판(endosulfan)에 대해 내성을 갖는 균주의 선별 실험결과를 나타낸 것이다. 도 1에서 14729, 14730, ..., 16194는 균주 관리번호를 나타낸다.

(2) 엔도설판(endosulfan) 분해능이 우수한 균주의 선별

엔도설판(endosulfan)에 대해 내성을 갖는 균주들 중에서 엔도설판(endosulfan) 분해능이 우수한 균주를 선별하기 위해 먼저 선별된 엔도설판(endosulfan) 내성 균주를 BN agar plate에서 7일 동안 배양하였다. 이후, 생육이 풍부한 부분에서 직경 1㎝의 agar block을 잘라 이를 10 ㎎/L 농도의 엔도설판(endosulfan)이 함유된 MM 배지에 접종하고 28℃의 온도 및 150 rpm의 진탕 조건에서 7일 동안 배양하였다. 이후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상등액을 Ethyl acetate로 추출한 후 추출액에 존재하는 엔도설판(endosulfan)과 이의 여러 가지 분해 산물을 가스크로마토그래피(Shimadzu equipped with 63Ni electron capture detector and DB-5 capillary column [0.25 mm(inside diameter) by 30 m; 0.25 ㎛ film thickness; Agilent, USA])로 분석하였다. 이때, 엔도설판(endosulfan) 내성 균주를 접종하지 않고 배양한 배양액을 대조군으로 하여 엔도설판(endosulfan)의 화학적 분해 요인을 보정하였다.

엔도설판(endosulfan)에 대해 내성을 갖는 균주들 중에서 엔도설판(endosulfan) 분해능이 우수한 균주는 관리번호 14731, 14747, 14850, 14903 균주인 것으로 나타났다. 도 2는 엔도설판(endosulfan) 분해능이 우수한 균주의 선별 실험에서 7일 동안 배양한 관리번호 14731, 14747, 14850, 14903 균주 배양액을 가스크로마토그래피로 분석한 결과 스펙트럼이다. 도 2에서 보이는 바와 같이 7일 동안 배양한 관리번호 14731, 14747, 14850, 14903 균주 배양액에서는 엔도설판(endosulfan)이 대부분 분해되어 미량으로 존재하였다.

도 3은 엔도설판(endosulfan) 선별된 엔도설판(endosulfan)에 대해 내성을 갖는 균주 배양액에 존재하는 엔도설판(endosulfan)과 이의 여러가지 분해산물(metabolite)을 가스크로마토그래피를 이용하여, 배양 시간이 7일 경과되었을 때 분석한 결과이다. 도 3에서 'α'는 엔도설판(endosulfan) α를 의미하고, 'β'는 엔도설판(endosulfan) β를 의미한다.

도 2 및 도 3에서 보이는 바와 같이 14731, 14747, 14850, 14903 균주가 엔도설판(endosulfan) α 및 엔도설판(endosulfan) β의 농도가 가장 낮고, 엔도설판 다이올, 엔도설판 에터 등 중간체가 검출되지 않았다(N.D.).

(3) 세포 중량 대비 엔도설판(endosulfan) 분해능이 우수한 균주의 선별

세포 중량 대비 엔도설판(endosulfan) 분해능이 우수한 균주의 선별을 위해서, 상기 14731, 14747, 14850, 14903 균주를 3일 동안 배양한 후 배양액을 15분동안 121℃ 조건에서 열처리하여 멸균하고, 멸균 처리한 각 14731, 14747, 14850, 14903 균주 함유 배양액을 수득하였다. 이후, 각 균주의 배양액에 10mg/L 엔도설판(endosulfan)을 첨가하고, 50mL의 BSM 배지에 접종하였다. 28℃, 160rpm에서 7일 후, 세포 중량 및 잔류 엔도설판(endosulfan)의 농도를 가스크로마토그래피로 분석하였고, 상기 14731, 14747, 14850, 14903 균주 1mg 세포에 대한 엔도설판(endosulfan)의 분해능을 분석하였다.

도 4를 참조하면, 엔도설판(endosulfan)에 대해 내성을 갖는 균주 중에서 엔도설판(endosulfan) 분해능이 우수한 균주이면서, 균주 1mg 세포에 엔도설판(endosulfan)의 분해능이 가장 우수한 균주는 관리번호 14903 균주인 것으로 나타났으며, 이의 균주명을 'MJM14903'으로 정하였다.

2. MJM14903 균주의 동정

균주 1mg 세포에 엔도설판(endosulfan)의 분해능이 가장 우수한 MJM14903 균주를 동정하기 위하여 다양한 균학적 성질을 분석하였다.

(1) MJM14903 균주의 계통 분석

미생물 분류 지표인 16S rDNA 유전자를 기준으로 MJM14903 균주의 계통분석을 하였다. MJM14903 균주의 염색체 DNA를 Wizard® Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, USA)를 이용하여 분리하였고 PCR로 16S ribosomal DNA를 증폭하였다. 이 때, PCR primer로 518F(5'- CCAGCAGCCGCGGTAATACG -3') 및 805R(5'- GACTACCAGGGTATCTAATCC -3')을 사용하였다. 증폭된 DNA는 클로닝(cloning)하여 염기서열을 분석하였더니, MJM14903 균주의 16S rDNA 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것으로 나타났다. MJM14903 균주의 16S rDNA을 eztaxon.co.kr에서 표준 균주와 비교하고 MEGA6 program을 이용한 계통분류학적 비교분석을 하였다. 도 5는 MJM14903 균주의 계통분석도이다.

(2) MJM14903 균주의 형태학적 특징

MJM14903 균주의 형태학적 성질을 분석하기 위하여 국제 스트렙토마이세스 프로젝트(ISP)에 따라 특성화 하였다. MJM14903 균주를 ISP1, ISP 2, ISP3, ISP4, IP5, ISP6, ISP7 배지에 도말(streaking)하고 28℃에서 14일 배양한 후 형태학적 모습을 관찰하였다. MJM14903 균주는 ISP1 배지에서 Ivory cream leathery의 기생균사를 형성하였고, ISP2 배지에서 cream leathery의 기생균사를 형성하였으며, ISP3 및 ISP7배지에서 Grayish cream의 기생균사를 형성하였고, ISP4 및 IPS5배지에서는 cream의 기생균사를 형성하였으며, ISP6배지에서 Gray wrinkled의 기생균사를 형성하였다. 또한, MJM14903 균주는 ISP1, ISP3, ISP4 및 ISP5 배지에서 cream의 기저균사를 형성하였고, ISP2 배지에서 Yellow의 기저균사, ISP6 배지에서 Black의 기저균사, ISP7 배지에서 Dark Brown의 기저균사를 형성하였다. MJM1403 균주의 수용성 피그먼트(pigment)는 ISP6 및 ISP7에서 나타났고 나머지 배지에서는 나타나지 않았다. 또한, MJM14903 균주의 생육은 ISP1 내지 ISP7 배지에서 모두 매우 풍부하였으며, MJM14903 균주의 포자형성은 ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP7 배지에서 일어났고 나머지 배지에서는 일어나지 않았다. 아래 표 1은 MJM14903 균주의 형태학적 특징을 나타낸 것이다.

Media	Cultural Characteristics
	Aerial mycelium	Substrate mycelium	Soluble pigment	Growth	Spore forming
Tryptone-yeast extract agar(ISP 1)	Ivory cream leathery	Cream	-	Good	-
Yeast extract-malt extract agar(ISP2)	Cream leatery	Yellow	-	Good	+
Oatmeal agar(ISP3)	Grayish cream	Cream	-	Good	+
Inorganic salt-starch agar(ISP4)	Cream	Cream	-	Good	+
Glycerol-asparagine agar(ISP5)	Cream	Cream	-	Good	+
Peptone-yeast extract iron agar(ISP6)	Gray wrinkled	Black	+	Good	-
Tyrosine agar(ISP7)	Grayish cream	Dark brown	+	Good	+

(3) MJM14903 균주의 탄소원 분해능

MJM14903 균주의 탄소원 분해능을 확인하기 위하여 무기질만 함유하는 최소 배지에 각종 당류를 첨가하고 균주를 접종한 후 생육을 확인하였다. 이 때, Glucose(포도당)를 positive control로 이용하였고, 당을 첨가하지 않은 최소 배지를 negative control로 사용하였다. MJM14903 균주는 탄소원으로 Glucose, L-Arabinose, Galactose 및 D-Mannitol을 가장 잘 이용하였고, Sucrose, Fructose, Maltose, I-Inositol도 이용할 수 있었으며, Cellulose는 이용하지 못하였다. 아래 표 2에 MJM14903 균주의 탄소원 분해능 실험 결과를 정리하였다.

Carbon source	Growth
Glucose(positive control)	+++
H2O(negative control)	-
Arabinose	+++
Galactose	+++
Cellulose	-
Sucrose	++
Maltose	++
Fructose	+
Mannitol	+++
Inositol	+

(4) MJM14903 균주의 효소 활성

MJM14903 균주의 효소 활성을 확인하기 위하여, BN배지에 starch, Casein, Xanthine, Tyrosine 을 각각 1% 첨가하고 균주를 접종한 후 28℃에서 14일 배양하여 콜로니 주변의 투명환 형성 여부를 확인하였다. 그 결과, MJM14903 균주는 Starch, Casein, Tyrosine을 분해할 수 있었으며 Xanthine은 분해하지 못하였다. 아래 표 3에 MJM14903 균주의 효소 활성 실험 결과를 정리하였다.

Media	Decomposition
Starch	+
Xanthine	-
Tyrosine	+
Casein	+

(5) MJM14903 균주의 동정 및 특허기탁

MJM14903 균주의 형태학적 특징, 탄소원 분해능, 효소 활성, 계통 분석 결과를 기초로 MJM14903 균주는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 새로운 종의 균주인 것으로 판정하였다. 본 발명의 발명자들은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주를 2019년 10월 29일 국립농업과학원 미생물 은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC; 주소: 대한민국 전라북도 완구군 이서면 농생명로 166)에 Streptomyces sp. MJM14903의 명칭으로 특허기탁 하여 수탁번호 KACC 92284P를 부여받았다.

3. 살아있는 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) MJM14903 균주와 멸균 처리한 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 엔도설판(endosulfan) 분해능 비교

스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주에 의한 엔도설판(endosulfan)의 분해가 균주의 대사(metabolism)에 의해 발생하는 것인지 확인하기 위해 살아있는 미생물과 열처리로 멸균한 미생물의 엔도설판(endosulfan)의 분해능을 비교하였다. 구체적으로 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주를 3일 동안 배양한 후 배양액을 15분동안 121℃ 조건에서 열처리하여 멸균하였고, 멸균 처리한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 함유 배양액을 수득하였다. 이후, 멸균 처리한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 함유 배양액을 10mg/L 엔도설판(endosulfan)과 함께 50mL의 BSM 배지에 접종하고 28℃, 160rpm에서 7일간 배양한 후, 세포 중량 대비 분해능을 분석였고, 가스크로마토그래피로 세포중량 및 엔도설판(endosulfan)의 잔류 농도를 분석하였다. 또한, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주를 열처리 없이 3일동안 배양한 후 배양액을 10mg/L 엔도설판(endosulfan)과 함께 50mL의 BSM 배지에 접종하고 28℃, 160rpm에서 7일간 배양한 후, 세포 중량 대비 분해능을 분석였고, 가스크로마토그래피로 세포중량 및 엔도설판(endosulfan)의 잔류 농도를 분석하였다.

도 4는 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등 및 멸균 처리된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 세포 중량 대비 엔도설판(endosulfan)의 분해능을 비교한 결과이다. 도 6은 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등 및 멸균 처리된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 세포중량을 비교한 결과이다. 도 7은 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등 및 멸균 처리된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 엔도설판(endosulfan)의 잔류 농도를 비교한 결과이다. 도 4, 도 6 및 도 7에서 HK cell은 멸균 처리한 균주를 나타낸다. 도 4, 도 6 및 도 7에서 보이는 바와 같이 멸균 처리한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주는 엔도설판(endosulfan) 분해능이 없고, 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주만 엔도설판(endosulfan) 분해능을 나타냈다. 이러한 결과로부터 엔도설판(endosulfan)은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 대사(metabolism)에 의해 분해되었다는 것을 확인하였다.

4. 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 시간에 따른 엔도설판(endosulfan)의 분해

스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 시간에 따른 엔도설판(endosulfan)의 분해능을 확인하기 위해 시간에 따른 엔도설판(endosulfan)의 농도와 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 바이오매스(biomass)를 측정하였다. 구체적으로 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주를 28℃, 160rpm에서 15일동안 배양한 후 배양액을 10mg/L 엔도설판(endosulfan)과 함께 BSM 배지에 접종하여 160rpm, 28℃에서 15일동안 배양하였다. 배양한지 1, 2, 3, 6, 10, 15일이 지난 후에 균체를 포함한 배양액을 각각 회수하여 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출하였고, 가스크로마토그래피(Shimadzu equipped with 63Ni electron capture detector and DB-5 capillary column [0.25 mm(inside diameter) by 30 m; 0.25 ㎛ film thickness; Agilent, USA])로 분석하였다. 이 때, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 접종액을 넣지 않은 실험구를 대조구(control)으로 하여 실험하여 엔도설판(endosulfan)의 화학적 분해 요인을 보정하였다.

도 8은 각 회수 일자에 대한 엔도설판(endosulfan)의 농도와 바이오매스(biomass)의 양을 나타내었고, 엔도설판(endosulfan)의 여러가지 분해산물의 농도를 나타낸 것이다. 이 때, 'sulfate'는 엔도설판(endosulfan) 설페이트를 나타내고, 'diol'은 엔도설판(endosulfan) 다이올을 나타내고, 'ether'는 엔도설판(endosulfan) 에테르를 나타낸다. 결과는 도 8과 같이 시간에 따라 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 바이오매스가 증가하면서 엔도설판(endosulfan)의 농도는 감소하였으며, 엔도설판(endosulfan) 다이올, 엔도설판(endosulfan) 에테르는 검출되었고, 엔도설판(endosulfan) 설페이트는 거의 검출되지 않았다.

5. 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 엔도설판(endosulfan) 분해 거동

스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양 시 엔도설판(endosulfan)의 분해가 미생물이 가진 자체의 세포내효소(endoenzyme) 작용에 의한 것인지 검증하기 위해 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균체로부터 조효소액을 추출하고 조효소액의 엔도설판(endosulfan) 분해능을 관찰하였다. 또한, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양 시 엔도설판(endosulfan)의 분해가 엔도설판(endosulfan)으로 인한 유도성 발현인지 여부를 검증하기 위해 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양 시 엔도설판(endosulfan)이 있는 배지(induction), 엔도설판(endosulfan)이 없는 배지(non-inducion)를 통해 분해능을 관찰하였다. 구체적으로는, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주를 28℃, 160rpm에서 15일동안 배양한 후 배양액을 수득하고, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 배양액을 10mg/L 엔도설판(endosulfan)이 처리된 1/10BN배지 및 엔도설판(endosulfan)이 처리되지 않은 1/10BN 배지에 각각 접종한 후, 160rpm, 28℃에서 15일동안 배양하였다. 상기 1/10BN 배지는 1.0 g/L glucose, 0.2 g/L Bacto-Peptone, 0.1 g/L yeast extract, 0.1 g/L beef extract으로 구성하였다. 이후, 각 1/10BN 배지에서 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주를 포함한 배양액 50mL를 원심집균하고, 상기 수득한 집균체를 PBS buffer(0.8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na₂HPO₄, 0.48% KH₂PO₄, pH7.0)로 2회 세척한 후, 현탁시켜 배양 세포만을 수득하였다. 이후, 수득한 배양 세포는 초음파 파쇄 후 세포질 속 성분만 얻기 위해 원심분리하여 상등액(조효소액)을 수득한 후, 수득한 상등액 속의 단백질 농도가 1mg/mL가 되도록 상등액의 농도를 PBS buffer로 조절하였다. 단백질 농도가 조절된 각 상등액에 10mg/L 엔도설판(endosulfan)을 첨가하여 30℃에서 6hr을 반응시키고, 그 반응물을 가스크로마토그래피로 잔류 엔도설판(endosulfan)의 농도를 분석하였다.

도 9는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주로부터 얻은 조효소액에 의한 엔도설판(endosulfan)의 분해 거동을 나타낸 것이다. 상기 엔도설판(endosulfan)을 처리한 1/10BN 배지에 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양액을 접종하여 수득한 조효소액 및 상기 엔도설판(endosulfan)을 처리하지 않은 1/10BN 배지에 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양액을 접종하여 수득한 조효소액은 잔류해 있는 엔도설판(endosulfan)의 농도가 감소하였다. 이를 통해 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등이 엔도설판(endosulfan)을 분해하도록 하는 효소는 세포내효소(endoenzyme)인 것을 확인할 수 있다. 또한, 두 조효소액의 엔도설판(endosulfan) 분해능에는 큰 차이가 없었으며, 이를 통해 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등이 엔도설판(endosulfan)을 분해하도록 하는 효소는 엔도설판(endosulfan)으로 인한 유도성 발현이 아니라 항시 발현되는 것을 확인할 수 있다.

6. 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 토양에서 엔도설판(endosulfan)의 분해

스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등이 토양 환경에서 엔도설판(endosulfan)을 분해 여부를 확인하기 위해 황토를 채취하여 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 배양액과 엔도설판(endosulfan)으로 처리하고 시간에 따른 엔도설판(endosulfan)의 분해능을 관찰하였다. 구체적으로는, 황토를 600μm의 다공을 가진 다공체로 체질하여 큰 입자를 제거하고 121℃에서 30분간 열처리한 뒤, 12시간 동안 냉각시키고 해동시키는 과정을 세번 반복하여 황토에 있는 포자와 미생물을 절멸시켰다. 이후, 상기 사균화된 황토 30g에 600μL 엔도설판(endosulfan)을 처리하고, 혼합기로 혼합한 후 3시간 동안 건조하였다. 건조된 상기 황토를 소분하여 유리 시험관으로 옮긴 후, 1.5×10¹⁰cfu/mL의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주가 현탁된 0.85 % NaCl 용액 0.1mL, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주를 28℃, 160rpm에서 15일동안 배양한 후 배양액 0.1mL 및 증류수 0.3mL를 상기 소분된 황토가 담긴 유리 시험관에 첨가하고 25℃에서 배양하면서 5일마다 추출하여 가스크로마토그래피로 엔도설판(endosulfan)의 분해능을 분석하였다.

도 10은 토양 환경에서 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등의 엔도설판(endosulfan) 분해율(%)을 측정한 것으로, 대조구(control)은 엔도설판(endosulfan)이 거의 분해되지 않은 반면에 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등으로 처리한 실험구(sample)는 토양 환경에서도 시간이 지날수록 엔도설판(endosulfan)의 분해율이 점차 증가하고 있는 것을 확인할 수 있다.

7. 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 농약 처리를 위한 구체적인 방법

스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 등이 토양 또는 수계에잔존하는 엔도설판(endosulfan)을 제거하기 위한 구체적인 예시로서 ⅰ) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양액을 멸균된 목분과 혼합하여 제조한 목분-미생물 담체를 상기 엔도설판(endosulfan)에 오염된 토양에 사용하거나, ⅱ) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양액을 제올라이트(Zeolite)에 침지시켜 제조한 제올라이트-미생물 담체를 상기 엔도설판(endosulfan)에 오염된 수계에 사용하는 방법이 있다.

<제1 실시예>

상기 목분-미생물 담체를 제조하기 위한 멸균된 목분은 5~20mesh 체를 통과한 목분을 약 121℃에서 30분 동안 습열멸균(autoclave) 하고 20~30℃의 온도에서 12시간 방치 한 후, 다시 약 121℃에서 30분 동안 습열멸균(autoclave)하여 목분에 있는 잔여 미생물을 사멸시키고, 이후, 80~100℃의 드라이 오븐(dry oven)에서 약 24시간 동안 열풍건조하여 수득할 수 있다. 상기 과정으로 제조한 멸균된 목분 대 1.0×10⁸cfu/mL 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양액을 1:1의 중량비로 혼합 및 균질화한 후, 60%RH, 30℃에서 약 2주동안 포자를 형성시키면 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 포자가 1.0×10⁶ spore/g 이상인 목분-미생물 담체를 제조할 수 있다.

도 11은 상기 제1 실시예에 따라 제조된 목분-미생물 담체를 60%RH, 30℃에서 15일, 30일 및 45일 동안 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 포자를 형성시켜 포자 형성의 정도를 나타낸 것이다. 60%RH, 30℃은 통상 토양이 가지고 있는 환경으로써, 도 11을 통해 상기 환경에서 약 2주 내지 4주 동안 목분-미생물 담체의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 포자가 지속적으로 존재하여 토양의 유기염소계 농약(구체적으로는 엔도설판(endosulfan))을 분해시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

<제2 실시예>

상기 제올라이트-미생물 담체를 제조하기 위한 제올라이트는 알칼리와 유기 구조체를 사용하여 실리카-알루미나 젤을 천천히 결정화시켜 제조한 직경 1 내지 20mm의 합성 제올라이트를 사용하였다. 이후, 상기 제올라이트에 1.0*10^8cfu/mL 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 배양액을 침지하여 상기 제올라이트-미생물 담체를 제조하였다.

도 12는 상기 제2 실시예에 따라 제조된 제올라이트-미생물 담체가 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 수계에 투입되고, 산소가 충분히 공급되는 호기 조건에서 C:N:P=100:15:1, C:N:P=100:10:1 및 C:N:P=100:5:1인 촉진제(stimulant)를 투입하여 얻은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 세포 건조 중량을 나타낸 것이다. 도 12를 통해 수계 및 호기 조건에서 제올라이트-미생물 담체가 촉진제를 통해 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주의 충분한 세포 형성이 이루어져 수계의 유기염소계 농약(구체적으로는 엔도설판(endosulfan))을 분해시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

국립농업과학원 KACC92284P 20191029

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> Novel Streptomyces sp. capable of degrading organochlorine pesticide in soil and use of the same <130> ZDP-19-0446 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1464 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16S rDNA of Streptomyces sp. MJM14903 <400> 1 tatggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaaccac 60 ttcggtgggg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc cttcactctg 120 ggacaagccc tggaaacggg gtctaatacc ggatatcact tccactcgca tgggtggggg 180 tcgaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg tgaggtaatg 240 gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga 300 gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc 360 ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag 420 ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg tgccagcagc 480 cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg 540 cggtctgtcg cgtcggatgt gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca ttcgatacgg 600 gcagactaga gtgtggtagg ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat 660 atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc attactgacg ctgaggagcg 720 aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acggtgggaa 780 ctaggtgttg gcgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa gttccccgcc 840 tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcagc 900 ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacaccg 960 gaaagcatta gagatagtgc cccccttgtg gtcggtgtac aggtggtgca tggctgtcgt 1020 cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgttctgtgt 1080 tgccagcatg cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga ctgccggggt caactcggag 1140 gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca cacgtgctac 1200 aatggccggt acaaagagct gcgaaaccgt gaggtggagc gaatctcaaa aagccggtct 1260 cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagttgctag taatcgcaga 1320 tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga 1380 aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggaggagctg tcgaagtggg 1440 actggcgatt ggacgaagtc gtac 1464

Claims (18)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 살아있는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 배양액, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 세포 파쇄물 또는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)의 세포 파쇄물로부터 수득한 상등액으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효성분을 포함하는 유기염소계 농약 분해제로서,
   상기 유기염소계 농약은 엔도설판(Endosulfan)인 것을 특징으로 하는 유기염소계 농약 분해제.
   
5. 삭제
6. 제4항에 있어서,
   상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) MJM14903 균주 (수탁번호: KACC 92284P)는 16S rDNA로 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유기염소계 농약 분해제.
   
7. 제4항 또는 제6항의 유기염소계 농약 분해제를 사용하여 유기염소계 농약 또는 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 토양을 처리하는 방법으로서,
   상기 유기염소계 농약은 엔도설판(Endosulfan)이고,
   상기 유기염소계 농약의 분해 산물은 엔도설판(endosulfan) 설페이트인 것을 특징으로 하는 토양 처리방법.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 제7항에 있어서,
    상기 유기염소계 농약 분해제와 멸균된 목분을 혼합하여 제조된 목분-미생물 담체를 사용하여 유기염소계 농약 또는 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 토양을 처리하는 것을 특징으로 하는 토양 처리방법.
    
12. 제 11항에 있어서,
    상기 목분-미생물 담체는, 상기 유기염소계 농약 분해제 대 상기 멸균된 목분의 중량비가 1:0.1 내지 1:3으로 혼합되는 혼합 과정 및 상기 유기염소계 농약 분해제가 상기 멸균된 목분에 정착하여 포자를 형성시키는 포자 형성 과정을 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 토양 처리방법.
    
13. 제4항 또는 제6항의 유기염소계 농약 분해제를 사용하여 유기염소계 농약 또는 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 수계를 처리하는 방법으로서,
    상기 유기염소계 농약은 엔도설판(Endosulfan)이고,
    상기 유기염소계 농약의 분해 산물은 엔도설판(endosulfan) 설페이트인 것을 특징으로 하는 수계 처리방법.
    
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 제13항에 있어서,
    상기 유기염소계 농약 분해제를 제올라이트(Zeolite)에 침지시켜 제조한 제올라이트-미생물 담체를 사용하여 유기염소계 농약 또는 유기염소계 농약의 분해 산물이 함유된 수계를 처리하는 것을 특징으로 하는 수계 처리방법.
    
18. 제17항에 있어서,
    상기 제올라이트의 직경은 1 내지 20mm인 것을 특징으로 하는 수계 처리방법.
    

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