CN105722970B - 改善土壤和/或水质污染、抑制温暖化气体产生、以及提高植物的功能性的微生物材料和发酵产品的制造方法 - Google Patents

改善土壤和/或水质污染、抑制温暖化气体产生、以及提高植物的功能性的微生物材料和发酵产品的制造方法 Download PDF

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Abstract

提供有益于环境且提高作物品质的功能性微生物材料和发酵产品的制造方法。本发明是关于用于改善水土环境、抑制温暖化气体产生并且提高植物功能性的微生物材料和发酵产品的制造方法的发明，该微生物材料通过使用包含多个生物种的嗜热微生物的微生物群将包含植物性原料和动物性原料的发酵原料发酵而得到，可改善土壤和/或水质污染和抑制温暖化气体产生，并且对植物的功能性提高、特别是生物防御相关基因、耐高温损害基因的表达、抗氧化成分的增加作出贡献。使用具有环境修复功能、针对植物的激发剂功能的微生物群，以不依赖于基因重组的形式进行植物的品质强化。而且，在通常的生产活动中保全和修复自然环境的负荷。

Description

改善土壤和/或水质污染、抑制温暖化气体产生、以及提高植 物的功能性的微生物材料和发酵产品的制造方法
技术领域
本发明涉及微生物材料和发酵产品的制造方法，该微生物材料通过使用包含多个生物种的嗜热微生物的微生物群将包含植物性原料和动物性原料的发酵原料发酵而得到，可改善土壤和/或水质污染及抑制温暖化气体产生，并且对植物的功能性提高、特别是生物防御相关基因、耐高温损害基因的表达、抗氧化成分的增加作出贡献。
背景技术
近年来，环境问题以世界规模变得严重，例如，当从环境方面出发着眼于农业时，在化学肥料、未熟堆肥施用于农地后，由于渗透到地下水中的硝酸离子导致的污染、作为来自土壤的温暖化气体的一氧化二氮的产生被视作问题。地球暖化的影响在作物栽培上成为高温损害的原因，也成为诱发疾病发生的环境因素。而且，以世界性的粮食问题为背景，在要求有效地生产作物的技术中，虽然使用化学肥料、农药的有效的运作成为不可欠缺的情况，但是这些材料成为上述的环境破坏的主要原因。另一方面，寻求有益于环境和健康的农业生产技术，材料、设施的研发、净化技术等各种各样的技术开发正在推进(参照专利文献1～3)。专利文献1涉及叶面喷雾剂，该叶面喷雾剂根据糖发酵有机酸水溶液和镁或钙的情况使尿素共存而解决了所述问题。在该专利文献1中，虽然关于硝酸降低能力被确认，但是其机制不清楚，不伴有其他的对环境和植物的功能性赋予的影响。专利文献2的特征在于，UV光源的波段为280～380nm，且在波长312nm附近具有波峰。该专利文献2是关于仅在人工光型的植物工厂中能适用的最佳的电照控制的知识，另外，不伴有其他的对植物的功能性赋予的影响。专利文献3涉及利用了醇类的硝态氮和挥发性有机化合物的降低方法。该专利文献3涉及来自土壤的硝酸、挥发性有机化合物的降低技术，由于使用醇等，所以不能适用于农业现场。
另外，虽然在恶劣的环境条件下植物也能应对的分子机制也变得清楚(参照非专利文献1～5)，但是利用其机制的技术被认为是如基因重组技术那样难以被社会接受的技术(非专利文献6～8)。非专利文献1～5是关于与抗病性、耐高温损害性有关的HSP参与的知识，关于对植物体的总体的影响评价等未如本发明那样被认可。另外，非专利文献6～8是关于基因重组技术的知识，不能说是如本发明那样的不伴有基因重组、具有硝酸降低、抗氧化物质的增量、生物防御功能、耐高温损害等多方面功能的技术。
另一方面，发明人等进行了如下发酵材料的开发：该发酵材料使用了包含枯草芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热放线菌(Thermopholic actinomycetes)和它们的近源的种等多个生物种的嗜热微生物的微生物群(参照专利文献4～7)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2006-036684号公报
专利文献2：特开2008-086272号公报
专利文献3：特开2002-370085号公报
专利文献4：特许第3146305号公报
专利文献5：特许第3314302号公报
专利文献6：特许第3385402号公报
专利文献7：国际公开WO2011/099514
非专利文献
非专利文献1：Jaroszl DF and Susan Lindquistl S.(2010)Hsp90 andEnvironmental StressTransform the Adaptive Value of Natural GeneticVariation.Science 330：1820-1824.
非专利文献2：Yule Liu et al.(2004)Molecular Chaperone Hsp90Associateswith Resistance Protein N and Its Signaling Proteins SGT1 and Rarlto Modulatean Innate Immune Response in Plants.J.Biol.Chem.279：2101-2108.
非专利文献3：Jae-HeungK et al.(2000)Upregulation of an ArabidopsisRING-H2 gene，XERICO，confersdrought tolerance through increased abscisicacidbiosynthesis.The PlantJournal 47：343-355.
非专利文献4：SnymanM and Cronje MJ.(2008)Modulation of heat shockfactors accompanies salicylicacid-mediated potentiation of Hsp70 in tomatoseedlings.Journal ofExperimental Botany 59：2125-2132.
非专利文献5：WilliamB.Gurley(2000)HSP101：A KeyComponent for theAcquisition of Thermotolerance in Plants.The PlantCell，Vol.12，457-460.
非专利文献6：Enikeev AG et al.(2010)Tobacco cell cultures transformedby the hsp 101 gene exhibit anincreased resistance to potassium fluoride DoklBiol Sci 430：29-30.
非专利文献7：Montero-Barrientos M et al.(2010)Transgenic expression oftheTrichoderma harzianum hsp70 gene increases Arabidopsis resistance to heatandother abiotic stresses.J Plant Physiol 167：659-65.
非专利文献8：Prieto-DapenaP et al.(2006)Improved resistance tocontrolled deterioration in transgenicseeds.Plant Physiol 142：1102-12.
发明内容
发明要解决的问题
到目前为止的农业中化学肥料使用过多，结果有如下问题：渗透到地下水中的硝酸污染、产生来自在农地生长的霉菌的温暖化气体一氧化二氮。另外，伴随地球暖化，作物的高温损害、疾病的诱发等成为问题。因此，需要有益于环境且提高作物的品质的技术。
本发明在于提供解决上述问题的功能性微生物材料。因为有土壤、水环境经常变动的因素，所以针对这样的变动因素，需要通过复合的微生物群而不是单一菌种显示多功能性的功效。例如，当以使作物生长的土壤为例时，在降雨的时期，土壤的含水率多，在雨少的时期，土壤变得干燥。根据这些变动，以调节的方式复合地应对，使得稳定地提高植物的功能。
用于解决问题的方案
I嗜热菌发酵产品对土壤、地下水污染以及温暖化气体产生赋予的影响
1.使土壤中的硝酸离子浓度减小
2.该反应被相对于氯霉素等抗生物质敏感性高的微生物<及其酶>抑制。
3.促进从土壤脱氮的反应。特别是，抑制N2O的产生，促进N2的产生。N2O气体具有CO2的约300倍的温暖化系数，所以抑制其产生很重要。认为该反应通过来自霉菌的P450nor促进，但是本发明的发酵产品(其含有微生物NP-1株)具有抑制霉菌的生长的功能，而且使N2气体优先脱氮的基因群发挥作用。
4.通过以上反应，结果是也使涉及从土壤渗透到地下水中的硝酸导致的水质污染减轻。
5.通过耐盐性和/或耐碱性的细菌(海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)属、枝芽孢杆菌(Virgibacillus)属)，能使盐浓度高的(10％左右)污染水的水质净化。
II嗜热菌发酵产品对植物的功能性赋予的影响
1.通过嗜热菌的作用，使根的硝酸盐转运蛋白活化，有效地利用土壤中的硝酸。
2.使根毛发达，通过植物激素的活化等促进成长
3.通过以上反应，能有效地利用来自土壤的氮，以少的氮量就能增产。
4.通过HSP群的酶修复功能培育耐热性植物。
5.由于谷胱甘肽转移酶、维生素A、C、E等的增加，成为抗氧化物丰富的作物
6.抑制由于LTP、蛋白酶抑制酶(protease inhibitor)等的活化导致的植物病原菌和植物害虫的产生。
本发明的功能性材料可以是，发酵原料由约70重量％～约80重量％的植物性原料和约30重量％～约20重量％的动物性原料构成。
另外，本发明的功能性材料能通过使用包含保藏编号：NITE BP-1051的微生物的微生物群进行发酵而得到。通过保藏编号ATCC PTA-1773的微生物等，可实现其功能性的稳定化。
而且，另外，本发明的功能性材料所含的微生物群可以是108个/g～约109个/g。
另外，本发明的功能性材料所使用的植物性原料可以是选自米糠、麦糠、小麦皮、大豆饼、豆腐渣、酒粕、烧酒粕、茶粕、咖啡粕、榨果汁的渣滓以及榨蔬菜汁的渣滓中的1种或多种。另外，本发明所使用的动物性原料可以是选自甲壳类、鱼类、甲壳类加工残余物以及鱼类加工残余物中的1种或多种。
另外，本发明的另一功能性材料是含有约1重量％～约5重量％的上述的功能性材料的功能性材料。
而且，本发明是制造功能性材料的方法，包含：搅拌步骤，搅拌植物性原料和动物性原料得到发酵原料；以及发酵步骤，使用保藏编号为ATCC PTA-1773的微生物群将在搅拌步骤中得到的发酵原料发酵。
发明效果
根据本发明，如图1所示，本发明材料中的有效微生物群的稳定性高的酶群，不会使土壤中的硝酸离子渗透到地下而是作为氮气脱氮，并利用其刺激等，诱导发根并且活化根中的硝酸盐转运蛋白。据此，植物以少的营养成分也可生长，植物体中的硝酸浓度变少，同时抗氧化活性高的成分增量。接着，本材料中的有效微生物自身和通过它们而被活化的土壤中的有效微生物群以在土壤和植物中共生的形式将空气中的氮气固定，结果是植物体内的谷氨酸、精氨酸浓度等增加。而且，由于本材料中的稳定性高的微生物的细胞壁成分等的影响，植物自身的生物防御相关基因、压力抗性基因群的发减量增加。同时，由于通过本材料中的微生物所分泌的环脂肽、耐热性酶等的影响，病原性高的线状菌的增加被抑制，植物的品质、功能总体上提高。作为这样的作用机制的结果，1)作为对土壤、地下水污染、水质污染以及温暖化气体产生赋予的影响，能抑制土壤、水质中的硝酸污染和大气中释放的温暖化N2O气体的产生。另外，在工业排水中，通过利用耐盐性和/或耐碱性的细菌的性质等，能进行到目前为止都难以净化的高盐浓度、高碱性环境的排水处理。2)作为嗜热菌发酵产品对植物的功能性赋予的影响，能使低硝酸化功能和高浓度的抗氧化物质增产。同时，通过将作物中的酶修复功能提高的HSP等避免高温损害，通过LTP、蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor)等的效果，能使对害虫提高驱避性等针对环境压力的生物防御系活化。
附图说明
图1是表示本发明的功能性微生物材料对土壤、植物以及环境赋予的影响的示意图。
图2是表示使本发明的功能性材料稳定化时的复合微生物系的细菌门的圆形图表。
图3是表示依赖本发明的功能性材料的添加量的植物体内的硝酸降低效果的图表。表示作为模型植物的鼠耳芥的体内的硝酸浓度的变化。
图4是表示依赖本发明的功能性材料的添加量的土壤中的硝酸降低效果的图表，表示土壤中的硝酸浓度的变化。
图5是表示通过本发明的功能性材料栽培的油菜的根的长度的实验结果的图表。
图6是表示通过本发明的功能性材料栽培的鼠耳芥的根中的硝酸盐转运蛋白的表达量的实验结果的图表。
图7是表示通过本发明的功能性材料，实施乙炔嵌段法时的土壤中的硝酸浓度的变化的实验结果的图表。
图8是表示通过本发明的功能性材料，从实施乙炔嵌段法时的土壤产生并作为N2O积累的浓度的实验结果的图表。
图9是表示通过本发明的功能性材料，在鼠耳芥的体内积累的铵离子的浓度的实验结果的图表。
图10是表示通过本发明的功能性材料，在鼠耳芥的体内积累的谷氨酸和谷氨酰胺的浓度的实验结果的图表。
图11是表示通过本发明的功能性材料，在鼠耳芥的体内积累的脯氨酸的浓度的实验结果的图表。
图12是新的类芽孢杆菌(Paenibacillus)的16SrRNA的碱基序列的系统树。
具体实施方式
接着，对本发明具体实施方式进行说明，但是本发明并不限定于这些实施方式。
本发明提供功能性微生物材料，其通过使用包含多个生物种的嗜热微生物的微生物群将包含植物性原料和动物性原料的发酵原料发酵而得到，具有改善土壤和/或水质污染以及抑制温暖化气体产生、同时对植物的功能性提高作出贡献的功能。
可认为本发明的功能性材料所含的微生物群及其代谢产物通过对施肥了该功能性材料的土壤的微生物相起作用，调节土壤中的硝酸还原反应并且调节脱氮反应，由此调节土壤、地下水、植物、到大气的氮循环。另外，可认为植物的基因表达模式根据土壤微生物相的变化而变化，诱导热休克蛋白(heat shock protein，HSP)、抗氧化成分等。
本发明中使用的微生物群包含多个生物种的嗜热微生物。作为具体的生物种，可列举枯草芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)、嗜热放线菌(Thermopholicactinomycetes)及其近源的种等。其中，本发明中使用的微生物群优选包含保藏编号：ATCCPTA-1773的微生物和BP-1051的微生物。
保藏编号：ATCC PTA-1773的微生物是包含作为枯草芽孢杆菌(Bacillus brevis)的近源的种的嗜热细菌C-1、作为枯草芽孢杆菌(Bacillus brevis)的近源的种的嗜热细菌C-3、以及作为嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)的近源的种的嗜热细菌CH-4、嗜热放线菌MH-1、作为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的近源的种的嗜热或者耐热乳酸菌LM-1、以及作为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的近源的种的嗜热或者耐热乳酸菌LM-2的混合菌。
优选本发明的功能性材料包含约108个/g～约109个/g的微生物群。另外，进一步优选本发明的功能性材料包含约108个/g～约109个/g的保藏编号：ATCC PTA-1773的微生物和约106个/g～约107个/g的保藏编号：NITE BP-863的微生物。
优选本发明中使用的微生物材料包含10重量％～1重量％的保藏编号：NITE BP-1051的微生物。作为该细菌群，可列举嗜热微生物的芽孢杆菌(Bacillus)属、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)属、枝芽孢杆菌(Virgibacillus)属、厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus)属、类芽孢杆菌(Paenibacillus)属。而且，通过与包含异常球菌-栖热菌(Deinococcus-Thermus)门的亚栖热菌(Meiothermus)属、火山栖热菌(Vulcanithermus)属、栖热菌(Thermus)属、海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)属等的嗜热菌接种物(Thermophilesinoculum)MIROKU M2K共存而使微生物材料稳定化。这些微生物群嗜热菌接种物(Thermophiles inoculum)MIROKU M2K由于复合菌和难培养性而被产品评价技术基盘机构拒绝保藏，所以在株式会社三六九(大分县杵筑市)被保存。此外，作为这样的能共存的微生物群，也能利用保藏于ATCC的保藏编号PTA-1773。
所谓本发明中使用的植物性原料是指来自蔬菜、谷物等植物的原料，能使用食物残渣等廉价的原料。具体地，可列举米糠、麦糠、小麦皮、大豆饼、豆腐渣、酒粕、烧酒粕、茶粕、咖啡粕、榨果汁的渣滓以及榨蔬菜汁的渣滓等。
本发明中使用的动物性原料是指来自鱼类、甲壳类等动物的原料。具体地，可列举甲壳类、鱼类、它们的加工残余物等。
作为甲壳类，能使用被称为虾、螃蟹、寄居蟹等的生物。另外，作为鱼类，能使用被拖网捞上来的底栖鱼、捕鱼得到但是在市场中不能售卖的未利用鱼等。而且，也能使用被加工以用于食品的甲壳类、鱼类的残余物。
优选本发明中使用的发酵原料由约50重量％～约90重量％的植物性原料和约50重量％～约10重量％的动物性原料构成，进一步优选由约70重量％～约80重量％的植物性原料和约30重量％～约20重量％的动物性原料构成。
本发明的功能性材料可改善土壤和/或水质污染和抑制温暖化气体产生，并且能提高植物的功能性。
而且，本发明提供制造上述的功能性微生物材料的方法。制造该功能性材料的方法包含：(a)搅拌步骤，搅拌植物性原料和动物性原料得到发酵原料；以及(b)发酵步骤，使用保藏编号为NITE BP-1051的微生物群将在搅拌步骤中得到的发酵原料发酵。
本发明的(a)搅拌步骤是将上述的植物性原料和上述的动物性原料搅拌、混合而得到各原料大致均匀分散的发酵原料的步骤。在发酵原料没有充分分散的情况下，有可能之后的发酵步骤中的发酵不完全。另外，优选在搅拌前将植物性原料或动物性原料粉碎。是因为通过将原料粉碎可使搅拌变得容易。
本发明的(b)发酵步骤是将在(a)搅拌步骤中得到的发酵原料发酵的步骤。发酵使用保藏编号：NITE BP-1051的微生物群。优选发酵的温度为约20℃～约90℃，进一步优选为约30℃～约50℃。另外，优选发酵时间为约5小时～约24小时，进一步优选为约10小时～约14小时。
另外，(b)发酵步骤可以在至少两个以上的多个发酵槽中进行。在使用多个发酵槽的情况下，优选在各阶段改变发酵温度。是因为：在各阶段，通过对在各个温度具有喜好性的微生物进行发酵，能得到通过复合发酵反应产生的功能性微生物材料。
[表1]国际保藏微生物群 NITE BP-1051 权利要求7和8
Figure BDA0000892912590000101
表1表示在NITE国际保藏的BP-1051的近源菌种和其序列登记。
[表2]嗜热菌接种物(Thermophiles inoculum)MIROKU M2K(基于16S rDNA序列的解析结果以下菌属的近源菌)
Figure BDA0000892912590000111
Figure BDA0000892912590000121
表2表示属名列表。
实施例
根据实施例进一步详细地说明本发明，但是本发明并不限于这些实施例。
1.功能性微生物材料的生产
用以下所示的方法制作实施例1和实施例2的功能性微生物材料。
(实施例1)
在发酵原料中，作为植物性原料，包含约50重量％的大麦糠、约20重量％的、约10重量％的米糠，而且，作为动物性原料，使用约20重量％的将海产品发酵得到的海产品发酵物，该海产品包含通过拖网网渔得到的虾、螃蟹等甲壳类、底栖鱼等。该海产品发酵物包含约108个/g～约109个/g的微生物群，该微生物群由约70重量％～约90重量％的保藏编号：PTA-1773的微生物和约30重量％～约10重量％的保藏编号：NITE BP-1051的微生物构成。
将上述的植物性原料和动物性原料混合并充分搅拌，在40℃下以14小时的1阶段进行发酵，干燥，得到本发明的功能性养殖饲料。该功能性材料包含约108个/g～约109个/g的微生物群，该微生物群由约90重量％～约99重量％的保藏编号：PTA-1773的微生物和约10重量％～约1重量％的保藏编号：NITE BP-1051的微生物构成。
(实施例2)
在发酵原料中，作为植物性原料，包含约20重量％的废菌床，而且，作为动物性原料，使用约30重量％的包含通过拖网网渔得到的虾、螃蟹等甲壳类、底栖鱼等的海产品。该废菌床包含约108个/g～约109个/g的微生物群，该微生物群由约70重量％～约90重量％的保藏编号：PTA-1773的微生物和约30重量％～约10重量％的保藏编号：NITE BP-1051的微生物构成。
将上述的植物性原料和动物性原料混合并充分搅拌，进行2阶段的发酵。第1阶段的发酵的条件设为，50℃～60℃，4～5小时，第2阶段的发酵的条件设为，30℃～40℃、6～8小时。在第2阶段的发酵后，将被发酵的发酵原料干燥，得到本发明的功能性微生物材料。该功能性微生物材料包含约108个/g～约109个/g的微生物群，该微生物群由约70重量％～约90重量％的保藏编号：PTA-1773的微生物和约30重量％～约10重量％的保藏编号：NITEBP-1051的微生物构成。
2.高盐浓度和/或高碱性的土壤和水环境中的有机物分解活性
在10％的盐度的心浸液(Heart Infusion)培养液等中培养BP-1051和嗜热菌接种物(Thermophiles inoculum)MIROKU M2K，将具有有机物分解能力的菌种选出。
BP-1051所含有的IP-9是标准菌株泛酸枝芽胞杆菌(Virgibacilluspantothenticus)的近源种，但是泛酸枝芽胞杆菌产生具有耐盐的成分四氢嘧啶(ectoine)。此外，已知四氢嘧啶可作为保湿成分。实际上，IP-9在盐度10％以上也具有有机物分解能力。另外，能与复合菌相所含有的深海大洋芽孢杆菌(Oceanobacillusprofundus)的近源种一起培养。已知该菌种也在高盐浓度、高碱浓度下有有机物分解能力，但是实际上，作为嗜热菌接种物MIROKU M2K含有的菌之一，发现了深海大洋芽孢杆菌的近源种。但是，这些菌种作为分离菌株持续地培养在目前是无法进行的。总之，可以说这些菌种的功能对高盐浓度和强碱浓度的土壤和水环境的净化作出了贡献。
3.对土壤、植物体等的硝酸降低化的评价
作为模型植物，使用鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，在作为肥料培土的KUREHA培土(表土5cm)中实施。总之，在以4℃实施一晚春化处理后，在恒温室(23℃)中，在照度10,000勒克斯(Lux)、24小时光照期的条件下每隔1天添加100ml的水分来实施栽培21天。
植物中的硝酸降低效果的图表(图3)。土壤中的硝酸降低的图表(图4)。如图3和图4所示，可确认：依赖于本发明材料的添加浓度，植物体中和土壤中的硝酸浓度降低。如图5和图6所示，可以说这些硝酸不是渗透到地下，而是通过脱氮使其不污染。在水圈中也能确认这样的倾向，排水处理时水中的硝酸离子、铵离子、全氮的浓度也降低的效果被确认。
6.侧根诱导和硝酸盐转运蛋白的表达
关于油菜，在将黑土和红土的比率设为8比2后调整到300g，添加200ml的水后，用铝箔覆盖上部，在阴凉处静置1周。然后，移到自然光进入的室内，播种后添加100ml水。以后每隔2天添加水。另外，关于作为模型植物的鼠耳芥，在作为肥料培土的KUREHA培土中实施。如上所述，在以4℃实施一晚春化处理后，在恒温室(23℃)中，在照度10,000勒克斯、24小时光照期的条件下栽培21天，并添加一定量水分使得不断水。
如图5所示，在使用油菜的实验中，根的发根提高了20％以上。在叶菜类、根菜类、果菜类、果树类的任一种中也可确认这样的倾向。
接着，作为模型植物，使用鼠耳芥，在作为肥料培土的KUREHA培土(表土不足3cm)中实施。总之，以4℃实施48小时春化处理后，在恒温室(23℃)中，在照度10,000勒克斯、24小时光照期的条件下一边保持一定水量一边实施栽培21天。
[表3]鼠耳芥中的高表达基因群之一 权利要求6
Figure BDA0000892912590000151
[表4]鼠耳芥中的高表达基因群之二 权利要求6
Figure BDA0000892912590000152
表3表示在将鼠耳芥用深度5cm的土壤栽培的情况下由于本发明的功能性材料而高表达的基因群。表4表示在将鼠耳芥用深度不足3cm的土壤栽培的情况下由于本发明的功能性材料而高表达的基因群。
提取根茎部的mRNA，用RT-PCR解析的结果是，可确认作为硝酸盐转运蛋白群之一的NRT2.1的表达量增加2倍以上的倾向(图6)。另外，对于NRT2.6也可确认增加的倾向。而且，如表3记载的那样，可以说与植物激素有关的基因群的表达量显著增加。而且，如表4记载的那样，可认为类结瘤素蛋白(nodulin like protein)被表达也很重要。近年来，暗示了结瘤素(nodulin)通过作为菌体外成分之一的鞭毛蛋白(flagellin)对根的形成作出了贡献(Planta 234：459-476，2011)。
这样，与促进诱导发根一起，有增强根毛部的硝酸盐转运蛋白和植物激素相关基因群等的表达的效果。另外，如表3所示，调节光反应NPH3家族蛋白(Phototropic-responsive NPH3 family protein)这样的光向性的基因也强烈表达，由此估计光响应性增加。出于这样的复合的因素，可认为即使少的肥料成分也能有效地吸收土壤中的营养成分，能促进植物的生长。关于促进植物生长的效果，不仅这些基因的功能，而且包含嗜热菌接种物MIROKU M2K所含的细菌群中难培养性的芽孢杆菌病菌(Bacillus graminis)的近源种。因为芽孢杆菌病菌是与植物共生的微生物内生菌，所以估计该菌种也能对促进成长作出贡献。
3.抑制温暖化气体一氧化二氮产生的能力的评价
作为模型植物，使用鼠耳芥，在作为肥料培土的KUREHA培土(表土5cm)中实施。总之，在以4℃实施一晚春化处理后，在恒温室(23℃)中，在照度10,000勒克斯、24小时光照期的条件下每隔1天添加100ml的水分来实施栽培21天。
如图6所示，即使在乙炔气氛下，在添加了本发明材料的土壤中，土壤中的硝酸离子浓度也锐减，但是在未添加的土壤中不易降低。因为乙炔阻碍从N2O到N2的反应，所以利用该阻碍反应，能通过气相色层分析检测出N2O。因此，在产生N2O的土壤中，在没有混入乙炔的气氛下也检测出N2O，但是在产生N2的土壤中，仅在混入了乙炔的气氛下能检测出N2O。如图7所示，在添加了本发明材料的土壤中，在没有进行乙炔嵌段的土壤条件下不能检测出N2O。另外，在进行了乙炔嵌段的土壤中能检测出N2O，所以可判明具有使N2优先释放的特性。由此，可以说土壤中的硝酸离子作为N2气体而脱氮。
为了寻找促进这些反应的基因群，作为参考PCR检测出了在作为文献的ThrobackIN et al.(2004)Reassessing PCR primers targeting nirS，nirK and nosZ genes forcommunity surveys of denitrifying bacteria with DGGE.FEMS Microbiol.Ecol.49：401-417所记载的引物序列等。NirK的引物利用5′-GGCGGCGCGCCGCCCGCCCCGCCCCCGTCGCCCGCCTCGATCAGATTGTGGTT-3′作为正向引物(forward primer)，利用5′-ATCATGGTCCTGCCGCG-3′作为反向引物(reverse primer)。另外，NirS的引物利用5′-GGCGGCGCGCCGCCCGCCCCGCCCCCGTCGCCCGACTTCGGATGCGTCTTGA-3′作为正向引物(forward primer)，利用5′-GTCAACGTCAAGGAAACCGG-3′作为反向引物(reverseprimer)。而且，NosZ的引物利用5’-TGGGGNGAYNTBCAYCA-3’作为正向引物(forward primer)，利用5’-GARCARAAGTTIGTRCARTA-3’等作为反向引物(reverse primer)。作为参考文献，利用了Scala DJ and Kerkhof LJ(1998)Nitrous oxide reductase(nosZ)gene-specific PCR primers for detection ofdenitrifiers and three nosZ genes from marine sediments.FEMS MicrobiologyLetters 162：61-68、和Jones，C.M.，Welsh，A.，Throback，I.N.，Dorsch，P.，Bakken L.R.，Hallin，S.(2011)Phenotypic and genotypic heterogeneity among closely relatedsoil-borne N2-and N2O-producing Bacillus isolates harboring the nosZ gene.FEMSMicrobiol.Ecol.76：541-552。PCR的结果是，有可能来自慢生根瘤菌属(Bradyhizobium)属、草螺菌(Herbaspirillum)属、中生根瘤菌(Mesorhizobium)属的脱氮酶基因序列和近源的基因群等在起作用。
[表5]来自本发明材料的脱氮基因群的序列同源性的比较
编号 保藏号 近源种 同源性(％)
S-1 AB686171 慢生根瘤菌属(Bradyhizobium sp.)TSA44 84
S-2 AB686172 草螺菌属(herbaspirillum sp.)TSO20-1 96
S-3 AB686170 中生根瘤菌(mesorhizobium sp.)TSA41b 97
表5表示本发明的功能性材料所含的脱氮系基因群和标准菌株中的脱氮基因群的同源性。
4.关于氮固定的评价
作为模型植物，使用鼠耳芥，在作为肥料培土的KUREHA培土(表土5cm)中实施。总之，在以4℃实施一晚春化处理后，在恒温室(23℃)中，在照度10,000勒克斯、24小时光照期的条件下每隔1天添加100ml的水分实施栽培21天。将水分的添加期间延长数日来调整培土的干燥化(含水率的下降)。
如图8所示，鼠耳芥体内的铵离子浓度有增加的倾向。因为植物体中的硝酸浓度极低，且硝酸还原酶的活性低，所以铵离子的来源是其他因素，可期待来自微生物。此外，已知通过微生物的氮固定是利用固态酶复合体作为催化剂，作为其复合体的因子，包含双氮酶和双氮酶还原酶。而且，通过铁氧还蛋白、黄素氧化还原蛋白等的电子供体，双氮酶还原酶被还原，形成铵离子。
因此，使用了能将作为双氮酶还原酶的基因的nifH放大的引物寻找原因。作为nifH的引物，将Widmer F，Shaffer BT，Porteous LA and Seidler RJ(1999)Analysis ofnifH Gene Pool Complexity in Soil and Litter at a Douglas Fir Forest Site inthe Oregon Cascade Mountain Range.Appl Environ Microbiol 65：374-380、和Poly，F.，Monrozier，L.J.，Bally，R.(2001)Improvement in the RFLP procedure forstudying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers insoil.Res.Microbiol.152：95-103等作为参考，使用5’-TGCGACCCGAAAGCCGACTC-3’作为正向引物(forward primer)、使用5’-ATGGCCATCATCTCACCGGA-3’等作为反向引物(reverseprimer)来进行检查。
本发明材料中的细菌在包含成为电子供体的琥珀酸的无氮培养液中，能生长的菌种分离。其结果是，包含NITE BP-1051所含的IP-23、IP-60，75近源的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)属、以及类芽孢杆菌(Peanibacillus)属的菌种。而且，如表6和7所示，从BLAST的解析结果判断16SrDNA的序列，包含短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)的近源种的Bacillus sp.36W株、以及短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)和短短芽孢杆菌(B.brevis)的近源种的Brevibacillussp.123株，关于后者，能用上述的引物进行检查，但是也包含用该引物不能检查的。无论哪种，碱基序列都不完全一致，所以可以说是新的菌种或者亚种。另外，暗示了作为复合菌群的形式可相辅相成地发挥氮固定能力。此外，NP-1051包含栗褐芽胞杆菌(Bacillusbadius)的近源种，但是已知褐芽胞杆菌(Bacillus badius)包含与氮代谢有关的基因群，所以可期待通过使其共存来发挥某些作用。此外，如表3记载的那样，在添加了本发明材料的土壤中生长的植物中，衰老相关蛋白质(Senescence-associated protein)(SEN1)的表达量增加，但是近年来，SEN1对于与植物共生的氮固定菌而言是必需的因子的情况被报告的方面(Plant Cell Physiol 2011 in press，http：//pcp.oxfordjournals.org/content/early/2011/11/28/pcp.pcr167.lo ng)非常有趣。
而且，作为该高温发酵产品中的功能性微生物之一的类芽孢杆菌(Paenibacillus)sp.具有作为相对于植物的共生菌而与植物共生的能力。已经进行了国际登记的NITE BP-1051包含类芽孢杆菌(Paenibacillus)sp.，关于这些嗜热植物共生菌，调查了16S rRNA的碱基序列并制作系统树的结果如图12所示，解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)和类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)类似，是即使在50℃也能生长的嗜热细菌。在施用了该高温发酵产品的植物中，这些菌与植物共生，所以估计如下：针对与植物生长的促进控制、生物防御有关的基因群的表达的促进、由于作为微小生物的线虫导致的植物受害等的效果，BP-1051、发酵产品中所含的Paenibacillussp.也参与了。
[表6]
嗜热菌接种物(Thermophiles inoculum)MIROKU M2K中的氮固定菌 权利要求7
芽孢杆菌(Bacillus)sp 36W菌株(短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)的近源种)
GACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGTGTTAGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCAAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCATAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGCAGATGATTGGGGTGAAGTCGTACAAAGGTAGCCCA
[表7]
嗜热菌接种物(Thermophiles inoculum)MIROKU M2K中的氮固定菌 权利要求7
短芽孢杆菌(Brevibacillus sp)123菌株
(短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)和短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)的近源种)
CTGCCGGCGTGCCTATACTGCAAGTCGAGCGAGTCTCTTCGGAGGCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTCTCAGACTGGGATAACATAGGGAAACTTATGCTAATACCGGATAGGTTTTTGGATCGCATGATCCAAAAAGAAAAGGCGGCTTTAAGCTGTCACTGGGAGATGGGCCTGCGGCGCATTACCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACAATGCGTACCCGACCTGAAAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAAACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACAAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCACCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGAGCTCAACTCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAAAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCTGTGGTGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGCTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGTTTCATACCTCAATTGCCGCAG
表6表示本发明的功能性材料所含的氮固定菌Bacillus sp 36W株的16SrDNA的序列。表7表示本发明的功能性材料所含的氮固定菌Brevibacillus sp 123株的16SrDNA的序列。
7.氨基酸浓度的调节功能的评价
作为模型植物，使用鼠耳芥，在作为肥料培土的KUREHA培土(表土5cm)中实施。总之，在以4℃实施一晚春化处理后，在恒温室(23℃)中，在照度10,000勒克斯、24小时光照期的条件下每隔1天添加100ml的水分实施栽培21天。通过将水分的添加期间延长数日来调整培土的干燥化(含水率的下降)。
如图10记载的那样，鼠耳芥体内的谷氨酸和谷氨酰胺的浓度在添加了材料的群中显著增加。可确认出被分解成谷氨酸的精氨酸也显著增加的倾向。谷氨酸由铵离子生成，所以也判明了图9的数据不矛盾。一般来讲，来自植物的谷氨酸不仅涉及作物的味道，也是所有的抗氧化酶的表达等极其重要的氨基酸，可以说本发明材料对提高植物的品质和功能性作出了贡献。此外，也已知作为表4的强烈表达基因之一的结瘤素(nodulin)可对谷氨酰胺合成功能作出贡献(Planta 234：459-476，2011)，与本发明的实施例不矛盾。
接着，当栽培土壤的含水率减少10％时，如图11记载的那样，可确认出在材料添加组中脯氨酸显著增加的倾向。植物体中的脯氨酸在干燥时通过吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5Creductase，Pyrroline-5-carboxylate reductase)等的反应而由谷氨酸生成，通过脯氨酸氧化酶(Prolin oxidase)等的反应，转换为谷氨酸，但是在含水率高的条件下，脯氨酸氧化酶(prolin oxidase)的表达成为2倍以上，所以与谷氨酸的浓度的关系没有矛盾。此外，一般来讲，已知脯氨酸是与耐旱性、保湿等有关的氨基酸，所以本发明材料从这样的方面出发也可以说对提高植物的功能性作出贡献。
8.耐高温损害基因和抗疾病反应基因的表达
因为在自然界中植物的生长环境变动，所以在不同的栽培条件下栽培作为模型植物的鼠耳芥，解析了表达基因的模式。作为模型植物使用鼠耳芥，并使用作为肥料培土的KUREHA培土实施。表3是用表土5cm实施的数据，在以4℃实施一晚春化处理后，在恒温室(23℃)中，在照度10,000勒克斯、24小时光照期的条件下每隔1天添加100ml的水分实施栽培21天。另一方面，表4是以表土不足3cm来实施的数据，在以4℃实施一晚春化处理后，在恒温室(23℃)中，在照度10,000勒克斯、24小时光照期的条件下栽培21天，并添加一定量水分使得不断水。在这样的条件下，实施DNA微阵列(与前次PCT申请同样的方法)，网罗性地筛选出模型植物中强烈表达的基因群。
在添加了本发明材料的土壤中生长的鼠耳芥中普遍地强烈表达的基因群在表3和表4中表示出。可确认出其中作为分子伴侣的热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)的表达。作为HSP，HSP70家族、HSP90家族、HSP101家族等的表达量增加。
关于表达量变化的基因中的HSP，任何HSP都是对针对高温压力、各种环境压力的抗性功能作出贡献的因子(Trends Plant Sci 9：，244-252，2004；Science 330：1820-1824，2010；Plant Cell，Vol.12，457-460，2000)。而且，RING-H2基因、XERICO关系到对植物的成长、耐旱性、耐盐性等的控制起作用的重要的植物生长素、脱落酸的生成的控制(PlantJournal 47：343-355，2006)。
此外，关于耐旱性，如图11所示，在添加了本发明材料的土壤中栽培，当转移到使土壤含水率下降10％的条件下时，脯氨酸浓度的增加程度变化的方面非常有趣。
而且，作为与生物防御有关的因子，已知作为HSP的HSP70、HSP90可与SGT1、RAR1一起对抗病性功能作出贡献(Plant Cell 19：4061-4076，2007；J Biol Chem 279：2101-2108，2004；EMBO J 27：2789-2798，2008)。另外，也已知结瘤素(nodulin)是与抗病性有关的基因(Olivares JE et al.(2011)Nodulin 41，a novel late nodulin of common beanwith peptidase activity.BMC Plant Biol 10：134)。而且，衰老相关蛋白质(Senescence-associated protein)(SEN1)的表达通过水杨酸、茉莉酸的信号传递来控制，估计为与抗病性有关的标识基因。此外，水杨酸是针对病毒、细菌等各种各样的病原微生物有抵抗性的因子，茉莉酸虽然与水杨酸拮抗性地工作，但是已知其是针对环境压力的抗性诱导因子。
作为针对病原体的抗性基因，脂质转移蛋白(LTP，LIPID TRANSFER PROTEIN)(Nature 419：399-403，2002)强烈表达。另外，胰蛋白酶(trypsin)和蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)/Kunitz家族蛋白作为针对各种各样的病原体显示抗性的基因(Molecular Plant 1：482-495，2008)被知道，是与被作为霉菌的伏马毒素B1诱导的细胞死亡拮抗的据抗剂。而且，过氧化氢酶(HPL1，HYDROPEROXIDE LYASE 1)是已知中止蚜虫的活动的(Proc Natl Acad Sci USA 98：8139-8144，2001)的因子，判明了生物合成植物抗毒素的细胞色素(Cytochrome)P450 71B15、推定的(putative)(CYP71B15)也强烈表达。P45071B15是已知生成吲哚胺(Camalexin)这样的植物抗毒素的细胞色素酶(Plant Cell 8：2235-2244，1996)。已知吲哚胺(Camalexin)抑制病原性的线状菌、细菌的生长。这样的酶通过环境压力、激发剂被诱导(Plant Cell 10：359-370，1998)，所以估计其发挥基于本发明材料的土壤环境的变化、作为激发剂的功能。
而且，即使病原菌感染，作为控制植物体的细胞死亡的因子被知道的天冬氨酰蛋白酶(Aspartyl protease)(EMBO J.2004February 25；23(4)：980-988；EMBO reports 6：282-288)也能强烈表达。
这样，很多生物防御相关基因群的表达被诱导，但是可以说作为可参与那些转录调节的基因群被知道的WRKY家族转录因子(Plant Mol Biol 51：21-37，2003)各种强烈表达也不矛盾。而且，表4所记载的谷氧还蛋白家族蛋白质(Glutaredoxin family protein)、谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase)与抗氧化活性有关，同时有维生素C、维生素E也增加的倾向，所以可以说改善了植物体中的抗氧化活性。
此外，为了本发明材料的稳定化而使用的PTA-1773、嗜热菌接种物(Thermophiles-inoculum)M2K(拒绝保藏)包含几丁质分解酶、抗霉活性高的脂肽，所以在施用于试验现场时，能使土壤和植物体或者水圈中的线状菌的存在比率一次性降低。
因此，在农业领域使用本发明材料的情况下，作为植物体外的生长环境使病原线状菌的存在比率降低后，使植物体内的生物防御基因群活化，所以能从生物内外两方面进行环境控制。
保藏编号
ATCC PTA-1773
NITE BP-1051
Figure BDA0000892912590000251
Figure IDA0000892912650000011
Figure IDA0000892912650000021
Figure IDA0000892912650000031
Figure IDA0000892912650000041
Figure IDA0000892912650000051
Figure IDA0000892912650000061

Claims (5)

1.一种微生物材料在改善土壤和/或水质污染、抑制温暖化气体产生以及提高植物的功能性中的应用，上述微生物材料在高盐浓度和/或高碱性的土壤和水环境中保持有机物分解活性，
使土壤或者水环境、植物体中的硝酸浓度降低，减轻地下水污染或者排水负荷，
促进植物的侧根诱导和硝酸盐转运蛋白的表达活性，
减少来自土壤的温暖化气体一氧化二氮的产生，促进脱氮，并且通过使氮固定而对植物的生长作出贡献，
使植物中的谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸的浓度增加，在干燥时使脯氨酸的浓度增加，
上述微生物材料的发酵原料由70重量％～80重量％的植物性原料和30重量％～20重量％的动物性原料构成，
上述微生物材料包含保藏编号为ATCC PTA-1773和保藏编号为NITE BP-1051的微生物群，
将上述微生物材料添加到土壤中。
2.一种微生物材料在提高植物的功能性中的应用，上述微生物材料在植物中诱导针对高温损害、耐旱性、抗氧化活性、植物病原微生物、害虫的抵抗性功能成分的表达，
上述微生物材料的发酵原料由70重量％～80重量％的植物性原料和30重量％～20重量％的动物性原料构成，
上述微生物材料包含保藏编号为ATCC PTA-1773和保藏编号为NITE BP-1051的微生物群，
将植物栽培到添加有上述微生物材料的土壤中。
3.一种改善土壤和/或水质污染、抑制温暖化气体产生以及提高植物的功能性的方法，其特征在于，将发酵产品添加到土壤中，
上述发酵产品的制造方法包含：搅拌步骤，搅拌70重量％～80重量％的植物性原料和30重量％～20重量％的动物性原料从而得到发酵原料；以及发酵步骤，用保藏编号为ATCCPTA-1773和保藏编号为NITE BP-1051的微生物群，对在上述搅拌步骤中得到的上述发酵原料进行发酵。
4.一种微生物材料在提高植物的功能性中的应用，上述微生物材料对植物的生长作出贡献，诱导植物的生物防御基因群的表达，
上述微生物材料的发酵原料由70重量％～80重量％的植物性原料和30重量％～20重量％的动物性原料构成，
上述微生物材料包含保藏编号为ATCC PTA-1773和保藏编号为NITE BP-1051的微生物群，
将植物栽培到添加有上述微生物材料的土壤中。
5.一种提高植物的功能性的方法，其特征在于，将植物栽培到添加有微生物材料的土壤中，
上述微生物材料的制造方法包含：搅拌步骤，搅拌70重量％～80重量％的植物性原料和30重量％～20重量％的动物性原料从而得到发酵原料；以及发酵步骤，用保藏编号为ATCC PTA-1773和保藏编号为NITE BP-1051的微生物群，对在上述搅拌步骤中得到的上述发酵原料进行发酵。
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