KR101716435B1

KR101716435B1 - 토양·수질 오염의 개선, 온난화 가스 발생 억제, 및 식물의 기능성을 향상시키는 미생물 자재의 제조 방법

Info

Publication number: KR101716435B1
Application number: KR1020167018334A
Authority: KR
Inventors: 히로쿠니 미야모토; 히로아키 코다마; 히사시 미야모토; 타쿠미 니시우치; 카즈토 이시카와; 카즈오 오가와; 토시유키 이토; 타쿠야 카미타이; 켄시로 오시마; 와타루 스다; 마사히라 핫토리
Original assignee: 닛칸카가쿠 가부시키가이샤; 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 지바 다이가쿠; 가부시키가이샤 미로쿠; 케이요플랜트엔지니어링 가부시키가이샤
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2017-03-14
Also published as: US20160145564A1; KR20150011795A; ES2735052T3; KR20160087395A; CN105722970B; US11118158B2; EP3015543A4; BR112015032569A2; TW201525134A; EP3015543A1; WO2014207927A1; CN105722970A; US20200017821A1; EP3015543B1; TWI683901B

Abstract

본 발명은 식물성 원료와 동물성 원료를 포함하는 발효 원료를 교반해서 발효 원료를 얻는 교반 공정과, 상기 교반 공정에서 얻어진 발효 원료를, 70중량% ~ 90중량%의 수탁 번호: PTA-1773의 미생물 및 30중량% ~ 10중량%의 수탁 번호: NITE BP-1051의 미생물을 이용해서 발효하는 발효 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 자재의 제조방법이다.

Description

토양·수질 오염의 개선, 온난화 가스 발생 억제, 및 식물의 기능성을 향상시키는 미생물 자재의 제조 방법{PRODUCTION METHODS OF MICROBIAL MATERIALS TO IMPROVE SOIL- AND/OR WATER-POLLUTION AND THE FUNCTIONALITY OF THE PLANT WITH SUPPRESSION OF GLOBAL WARMING GAS GENERATION}

본 발명은, 식물성 원료와 동물성 원료를 포함하는 발효 원료를, 복수의 생물종의 호열성 미생물을 포함하는 미생물군을 이용해서 발효시킴으로써 얻어지고, 토양·수질 오염의 개선, 및 온난화 가스 발생 억제하면서, 식물의 기능성 향상, 특히 생체 방어 관련 유전자나 내고온 장해 유전자의 발현, 항산화 성분의 증가에 기여하는 미생물 자재의 제조 방법에 관한 것이다.

최근, 환경 문제는 세계 규모로 심각해지고 있고, 예를 들어, 환경면에서 농업을 파악하면 화학 비료나 미열퇴비가 농지에 살포된 후, 지하수에 침투하는 질산 이온에 의한 오염이나 토양 유래의 온난화 가스인 일산화이질소의 발생이 문제시 되고 있다. 지구온난화의 영향은, 작물 재배를 하는데 있어서는 고온 장해의 원인으로 되고 있어, 병의 발생을 유발하는 환경요인으로도 되고 있다. 또, 세계적인 식량 문제를 배경으로 해서, 작물을 효율적으로 생산하는 기술이 요구되고 있는 가운데, 화학 비료나 농약을 이용한 효율적인 운용은 불가결한 상황이 되고 있지만, 이들 자재는 상기 환경 파괴의 요인으로 되고 있다. 한편에서, 환경과 건강에 친화적인 농업생산기술이 요구되고 있고, 자재나 시설에 있어서의 연구나 정화 기술 등의 다양한 기술 개발이 진척되어 있다(특허문헌 1 내지 3 참조). 특허문헌 1은, 당발효 유기산 수용액과 마그네슘 또는 칼슘과 경우에 따라서 요소를 공존시켜 상기 과제를 해결한 엽면(葉面) 살포제에 관한 것이다. 이 특허문헌 1에서는, 질산 경감능에 관해서는 확인되어 있지만, 그 메커니즘도 불분명해서, 그 밖의 환경 그리고 식물의 기능성에 미치는 영향을 수반하지 않는다. 특허문헌 2는, UV 광원이 파장영역 280 내지 380㎚이고, 또한 파장 312㎚ 부근에 피크를 지니는 것을 특징으로 하는 것이다. 이 특허문헌 2는, 인공광형의 식물공장에 있어서만 적용가능한 최적인 전조(電照) 컨트롤에 관한 지견이며, 또한 그 밖의 식물의 기능성에 부여하는 영향을 수반하지 않는다. 특허문헌 3은, 알코올류를 이용한 질산태질소(窒酸態窒素) 그리고 휘발성 유기 화합물의 저감 방법에 관한 것이다. 이 특허문헌 3은, 토양으로부터의 질산이나 휘발성 유기 화합물의 저감 기술에 관한 것으로, 알코올 등을 이용하므로, 농업 현장에 적용할 수 있는 것은 아니다.

또, 열악한 환경 조건 하에서도 식물이 대처할 수 있는 분자 기전도 밝혀져 있지만 (비특허문헌 1 내지 5 참조), 그 메커니즘을 활용한 기술은 유전자 재조합(즉, 유전자 변형) 기술과 같은 사회에 받아들여지기 어려운 기술(비특허문헌 6 내지 8)로 판단되고 있다. 비특허문헌 1 내지 5는, 내병성, 내고온 장해성에 관한 HSP 관여에 관한 지견이며, 본 발명과 같이, 식물체에의 총체적인 영향 평가 등에 대해서는 확인되어 있지 않다. 또한, 비특허문헌 6 내지 8은, 유전자 재조합 기술에 관한 지견이며, 본 발명과 같이, 유전자 재조합을 수반하는 일 없이, 질산 경감, 항산화 물질의 증량, 생체 방어 기능, 내고온 장해 등의 다면적인 기능을 지니는 기술이라고는 말할 수 없다.

한편에서, 본 발명자들은, 바실러스 브레비스(Bacillus brevis)나 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 써모폴릭 악티노마이세테스(Thermopholic actinomycetes)나, 그들의 근연종 등의 복수의 생물종의 호열성 미생물을 포함하는 미생물군을 이용한 발효 자재의 개발을 행해왔다(특허문헌 4 내지 7 참조).

(선행기술문헌)

(특허문헌)

(특허문헌 1) JP2006-036684 A

(특허문헌 2) JP2008-086272 A

(특허문헌 3) JP2002-370085 A

(특허문헌 4) JP3146305 B

(특허문헌 5) JP3314302 B

(특허문헌 6) JP3385402 B

(특허문헌 7) WO2011099514 A

(비특허문헌)

(비특허문헌 1) Jarosz1 DF and Susan Lindquist1 S. (2010) Hsp90 and Environmental Stress Transform the Adaptive Value of Natural Genetic Variation. Science 330:1820-1824.

(비특허문헌 2) Yule Liu et al. (2004) Molecular Chaperone Hsp90 Associates with Resistance Protein N and Its Signaling Proteins SGT1 and Rar1 to Modulate an Innate Immune Response in Plants. J. Biol. Chem. 279:2101-2108.

(비특허문헌 3) Jae-Heung K et al. (2000) Upregulation of an Arabidopsis RING-H2 gene, XERICO,confers drought tolerance through increased abscisic acidbiosynthesis. The Plant Journal 47:343-355.

(비특허문헌 4) Snyman M and Cronje MJ. (2008) Modulation of heat shock factors accompanies salicylic acid-mediated potentiation of Hsp70 in tomato seedlings. Journal of Experimental Botany 59:2125-2132.

(비특허문헌 5) William B. Gurley (2000) HSP101: A Key Component for the Acquisition of Thermotolerance in Plants.The Plant Cell, Vol.12, 457-460.

(비특허문헌 6) Enikeev AG et al. (2010) Tobacco cell cultures transformed by the hsp 101 gene exhibit an increased resistance to potassium fluoride Dokl Biol Sci 430:29-30.

(비특허문헌 7) Montero-Barrientos M et al. (2010) Transgenic expression of the Trichoderma harzianum hsp70 gene increases Arabidopsis resistance to heat and other abiotic stresses. J Plant Physiol 167:659-65.

(비특허문헌 8) Prieto-Dapena P et al. (2006) Improved resistance to controlled deterioration in transgenic seeds. Plant Physiol 142:1102-12.

지금까지의 농업에서는 화학 비료가 사용 과다로 되어, 그 결과로서 지하수에 침투한 질산 오염이나 농지에 증식한 곰팡이에 유래하는 온난화 가스인 일산화이질소의 발생이라고 하는 문제가 있었다. 또한, 지구온난화에 따라서, 작물의 고온 장해나 병의 유발 등이 문제로 되고 있었다. 따라서, 환경에 친화적이고 작물의 품질을 향상시키는 기술이 필요하였다.

본 발명은, 상기 과제를 해결하는 기능성 미생물 자재의 제조방법을 제공하는 것에 있다. 토양이나 수환경(水環境)은 항상 변동하는 요인이 있으므로, 이러한 변동 요인에 대해서는, 단일 균종이 아니라, 복합적인 미생물군에 의해서 다기능적으로 효능을 나타낼 필요가 있다. 예를 들어, 작물을 생육시키는 토양을 예로 들면, 강우 시기에는 토양의 수분 함유율이 많고, 비가 적은 시기에는, 토양이 건조 기미를 보인다. 이들 변동에 따라서, 안정적으로 식물의 기능을 향상시키도록 조절하게끔 복합적으로 대응시킨다.

I. 호열균 발효 산물이 토양, 지하수 오염 그리고 온난화 가스 생산에 미치는 영향

1. 토양 중의 질산 이온 농도를 경감시킨다

2. 상기 반응은 클로람페니콜 등의 항생 물질에 감수성이 높은 미생물<그리고 그 효소>에 의해서 억제된다.

3. 토양으로부터의 탈질반응을 촉진시킨다. 특히, N2O의 생산을 억제하고, N2의 생산을 촉진시킨다. N2O 가스는 CO2의 약 300배의 온난화계수를 지니므로, 그 발생 억제는 중요하다. 이 반응은, 곰팡이 유래의 P450nor에 의해서 촉진되는 것으로 여겨지고 있지만, 본 발명의 발효 산물(그 함유 미생물 NP-1주)은, 곰팡이의 증식을 억제하는 기능을 지니고, 또한 N2 가스를 우선적으로 탈질하는 유전자군이 기능한다.

4. 이상의 반응에 의해서, 결과로서 토양으로부터 지하수에 침투하는 질산에 의한 수질 오염에 관해서도 경감시킨다.

5. 내염성·내알카리성의 박테리아(오셔노바실러스(Oceanobacillus)속, 버시바실러스(Virgibacillus)속)에 의해서, 염농도가 높은(10% 전후) 오염수의 수질정화를 가능하게 한다.

II 호열균 발효 산물이 식물의 기능성에 미치는 영향

1. 호열균의 작용에 의해서, 뿌리의 질산 수송체(transporter)를 활성화하고, 효율적으로 토양 중의 질산을 이용한다.

2. 뿌리털(根毛)을 발달시켜, 옥신의 활성화 등에 의해서, 성장 촉진시킨다

3. 이상의 반응에 의해서, 토양 유래의 질소를 효율적으로 이용해서, 적은 질소량으로 증산이 가능해진다.

4. HSP군에 의한 효소 수복 기능에 의해서, 내열성 식물을 육성한다.

5. 글루타티온 전이효소나 비타민 A, C, E 등의 증가에 의해서 항산화물이 풍부한 작물로 된다

6. LTP나 프로테아제 저해제 등의 활성화에 의한 식물병원균 및 식물해충의 발생을 억제한다.

본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재는, 발효 원료가 약 70중량% 내지 약 80중량%의 식물성 원료와 약 30중량% 내지 약 20중량%의 동물성 원료로 구성되는 것이어도 된다.

또, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재는, 수탁 번호: NITE BP-1051의 미생물을 포함하는 미생물군을 이용해서 발효되는 것에 의해 얻어지는 것일 수 있다. 수탁 번호ATCC PTA-1773인 미생물 등에 의해서, 그 기능성의 안정화를 도모할 수 있다.

게다가, 또, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 포함되는 미생물군은, 10⁸개/g 내지 약 10⁹개/g일 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 이용되는 식물성 원료는, 쌀겨, 보리겨, 밀기울, 콩깻묵, 비지, 술지게미, 소주 지게미, 차 찌꺼기, 커피 찌꺼기, 과실 짜고 남은 찌꺼기, 및 야채 짜고 남은 찌꺼기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 복수종일 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 동물성 원료는, 갑각류, 어류, 갑각류 가공 잔사 및 어류 가공 잔사로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 복수종일 수 있다.

또, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재와 다른 미생물 자재는, 전술한 미생물 자재를 약 1중량% 내지 약 5중량% 함유하는 기능성 자재이다.

또한, 본 발명은, 식물성 원료와 동물성 원료를 교반해서 발효 원료를 얻는 교반 공정, 및, 교반 공정에서 얻어진 발효 원료를, 수탁 번호가 ATCC PTA-1773인 미생물군을 이용해서 발효시키는 발효 공정을 포함하는, 미생물 자재를 제조하는 방법이다.

본 발명에 의해서, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재 중의 유효 미생물군의 안정성이 높은 효소군이, 토양 중의 질산 이온을 지하에 침투시키는 일 없이 질소 가스로서 탈질하고, 그 자극 등을 이용함으로써, 뿌리내림 유도, 및 뿌리에 있어서의 질산 수송체를 활성화시킨다. 이것에 의해서, 적은 영양성분으로도 식물이 생장하여, 식물체 중의 질산 농도가 적어지고, 동시에 항산화 활성이 높은 성분이 증량된다. 다음에, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재 중의 유효 미생물 자체, 및 그들에 의해서 활성화된 토양 중의 유효 미생물군이, 토양, 및 식물에 공생한 형태로, 공기 중의 질소 가스를 고정시키고, 결과로서 식물체 내의 글루탐산이나 아르기닌 농도 등이 증가한다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재 중의 안정성이 높은 미생물의 세포벽 성분 등의 영향으로, 식물 자체의 생체 방어 관련 유전자나 스트레스 내성 유전자군의 발현량이 증가한다. 동시에, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재 중의 미생물에 의해서 분비되는 환상 리포펩타이드나 내열성 효소 등의 영향으로 병원성이 높은 사상균의 증가가 억제되어, 총체적으로 식물의 품질이나 기능이 향상된다. 이러한 작용 기전의 결과로서, 1) 토양, 지하수 오염, 수질 오염, 및 온난화 가스 생산에 미치는 영향으로서, 토양, 수질에 있어서의 질산 오염과 대기중 방출되는 온난화 N2O 가스의 발생 억제가 가능해진다. 또한, 공업 배수에 있어서는, 내염성·내알카리성의 박테리아의 성질 등을 이용함으로써, 지금까지 정화가 어려웠던 고염 농도, 고알카리성 환경의 배수 처리가 가능해진다. 2) 호열균 발효 산물이 식물의 기능성에 미치는 영향으로서는, 저질산화 기능과 고농도의 항산화 물질을 증산시키는 것이 가능하다. 동시에, 작물 중의 효소 수복 기능을 향상시키는 HSP 등에 의해서 고온 장해를 회피하고, LTP나 프로테아제 저해제 등의 효과에 의해서 해충에 대해서 기피성을 높이는 등 환경 스트레스에 대한 생체 방어계가 활성화될 수 있다.

도 1은 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의한 토양, 식물 및 환경에 미치는 영향을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재를 안정화시켰을 때의 복합 미생물계의 세균문(細菌門: Bacteriomycota)을 나타낸 원 그래프이다.
도 3은 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재의 첨가량 의존적인 식물체 내의 질산 저감 효과를 나타낸 그래프이다. 모델 식물인 애기장대의 체내의 질산 농도의 변화를 나타내고 있다.
도 4는 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재의 첨가량 의존적인 토양 중의 질산 저감 효과를 나타낸 그래프로, 토양 중의 질산 농도의 변화를 나타내고 있다.
도 5는 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의해 재배한 소송채(コマツナ)의 뿌리의 길이를 나타낸 실험 결과의 그래프이다.
도 6은 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의해서 재배한 애기장대의 뿌리에 있어서의 질산 수송체의 발현량을 나타낸 실험 결과의 그래프이다.
도 7은 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의해서, 아세틸렌 블록법을 실시했을 때의 토양 중의 질산 농도의 변화를 나타낸 실험 결과의 그래프이다.
도 8은 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의해서, 아세틸렌 블록법을 실시했을 때의 토양으로부터 생산되어 N2O로서 축적된 농도를 나타낸 실험 결과의 그래프이다.
도 9는 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의해서, 애기장대의 체내에 축적한 암모늄 이온의 농도를 나타낸 실험 결과의 그래프이다.
도 10은 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의해서, 애기장대의 체내에 축적한 글루탐산과 글루타민의 농도를 나타낸 실험 결과의 그래프이다.
도 11은 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의해서, 애기장대의 체내에 축적한 프롤린의 농도를 나타낸 실험 결과의 그래프이다.
도 12는 신규한 패니바실러스(Paenibacillus)의 16SrRNA의 염기서열의 계통수다.

다음에, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해서 설명하지만, 본 발명은 이들 실시형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명은, 식물성 원료와 동물성 원료를 포함하는 발효 원료를, 복수의 생물종의 호열성 미생물을 포함하는 미생물군을 이용해서 발효시킴으로써 얻어져, 토양·수질 오염의 개선 및 온난화 가스 발생을 억제하면서, 식물의 기능성 향상에 기여하는 기능을 지니는 미생물 자재의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 포함되는 미생물군, 및 그 대사 산물은, 해당 미생물 자재를 시비(施肥)한 토양의 미생물 상에 작용하여, 토양에 있어서의 질산환원 반응을 조절하는 동시에, 탈질반응을 조절함으로써, 토양, 지하수, 식물, 대기에의 질소순환 조절을 하는 것으로 여겨진다. 또한, 토양 미생물 상의 변화에 의해서, 식물의 유전자 발현 패턴이 변화되어, 열 충격 단백질(heat shock protein: HSP)이나 항산화 성분 등을 유도하는 것으로 여겨진다.

본 발명에서 이용되는 미생물군은, 복수의 생물종의 호열성 미생물을 포함한다. 구체적인 생물종으로서, 바실러스 브레비스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 써모아밀로보란스(Bacillus thermoamylovorans), 써모폴릭 악티노마이세테스나, 그들의 근연의 종 등을 들 수 있다. 특히, 본 발명에서 이용되는 미생물군은, 수탁 번호: ATCC PTA-1773인 미생물 및 BP-1051인 미생물을 포함하는 것이 바람직하다.

수탁 번호: ATCC PTA-1773의 미생물은, 바실러스 브레비스의 근연의 종인 호열성 세균 C-1, 바실러스 브레비스의 근연의 종인 호열성 세균 C-3 및 바실러스 스테아로써모필러스의 근연의 종인 호열성 세균 CH-4, 호열성 방선균 MH-1, 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans)의 근연의 종인 호열성 또는 내열성 유산균 LM-1, 및 바실러스 코아귤런스의 근연의 종인 호열성 또는 내열성 유산균 LM-2를 포함하는 혼합균이다.

본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재는, 약 10⁸개/g 내지 약 10⁹개/g의 미생물군을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재는, 약 10⁸개/g 내지 약 10⁹개/g의 수탁 번호: ATCC PTA-1773의 미생물 및 약 10⁶개/g 내지 약 10⁷개/g의 수탁 번호: NITE BP-863의 미생물을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 이용되는 미생물 자재는, 10중량% 내지 1중량%의 수탁 번호: NITE BP-1051의 미생물을 포함하는 것이 바람직하다. 해당 세균군으로서는, 호열성 미생물의 바실러스속, 리시니바실러스(Lysinibacillus)속, 버지바실러스속, 아녹시바실러스(Anoxybacillus)속, 패니바실러스속을 들 수 있다. 더욱, 데이노코커스-써무스(Deinococcus-Thermus)문의 메이오써무스(Meiothermus)속, 불카니써무스(Vulcanithermus)속, 써무스(Thermus)속, 오셔노바실러스속 등을 포함하는 호열성 미생물 접종원(Thermophiles inoculum) MIROKU M2K와 공존시킴으로써 미생물 자재가 안정화된다. 이들 미생물군 호열성 미생물 접종원 MIROKU M2K는, 복합균, 그리고 난배양성 때문에 제품평가 기술기반기구에 있어서 수탁 거부되었기 때문에, 가부시키가이샤 미로쿠(株式會社三六九)(오이타켄 키츠키시에 소재)에 있어서 보존되어 있다. 또, 이러한 공존가능한 미생물군으로서는, ATCC에 수탁되어 있는 수탁 번호PTA-1773도 활용할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 식물성 원료란, 야채나 곡물 등의 식물에 유래하는 원료를 말하며, 식품 잔사 등의 저렴한 원료를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 쌀겨, 보리겨, 밀기울, 콩깻묵, 비지, 술지게미, 소주 지게미, 차 찌꺼기, 커피 찌꺼기, 과실 짜고 남은 찌꺼기, 및 야채 짜고 남은 찌꺼기 등을 들 수 있다.

본 발명에서 이용되는 동물성 원료란, 어류나 갑각류 등의 동물에 유래하는 원료를 말한다. 구체적으로는, 갑각류, 어류나 그들의 가공 잔사 등을 들 수 있다.

갑각류로서는, 새우나 게, 소라게 등으로 지칭되는 생물을 이용할 수 있다. 또, 어류로서는, 저인망으로 끌어 올릴 수 있는 바다밑에 사는 물고기나, 어업에 의해 얻어지지만 시장에서는 판매되지 않는 미이용 물고기 등을 이용할 수 있다. 또한, 식품용으로 가공된 갑각류나 어류의 잔사를 이용할 수도 있다.

본 발명에서 이용되는 발효 원료는, 약 50중량% 내지 약 90중량%의 식물성 원료와 약 50중량% 내지 약 10중량%의 동물성 원료로 구성되는 것이 바람직하며, 약 70중량% 내지 약 80중량%의 식물성 원료와 약 30중량% 내지 약 20중량%의 동물성 원료로 구성되는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재는, 토양·수질 오염의 개선, 및 온난화 가스 발생을 억제하면서, 식물의 기능성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명의, 전술한 기능성 미생물 자재를 제조하는 방법을 제공한다. 해당 기능성 자재를 제조하는 방법은, (a) 식물성 원료와 동물성 원료를 교반해서 발효 원료를 얻는 교반 공정, 및 (b) 교반 공정에서 얻어진 발효 원료를, 수탁 번호가 NITE BP-1051인 미생물군을 이용해서 발효하는 발효 공정을 포함한다.

본 발명의 (a) 교반 공정은, 전술한 식물성 원료와 전술한 동물성 원료를 교반해서 혼합하고, 각 원료가 거의 균일하게 분산된 발효 원료를 얻는 공정이다. 발효 원료의 분산이 충분히 되지 않고 있을 경우에는, 그 후의 발효 공정에서의 발효가 불완전해질 가능성이 있다. 또 교반 전에 식물성 원료 또는 동물성 원료를 분쇄하는 것이 바람직하다. 원료를 분쇄함으로써 교반이 용이해지기 때문이다.

본 발명의 (b) 발효 공정은, (a) 교반 공정에서 얻어진 발효 원료를 발효되는 공정이다. 발효에는, 수탁 번호: NITE BP-1051의 미생물군이 이용된다. 발효 온도는, 약 20℃ 내지 약 90℃가 바람직하며, 약 30℃ 내지 약 50℃가 더욱 바람직하다. 또한, 발효 시간은 약 5시간 내지 약 24시간이 바람직하며, 약 10시간 내지 약 14시간이 더욱 바람직하다.

또한, (b) 발효 공정은, 적어도 2개 이상의 복수의 발효조에서 행하면 된다. 복수의 발효조를 이용한 경우에는, 각 단계에서 발효 온도를 변화시키는 것이 바람직하다. 각 단계에서는, 각각의 온도에 기호성을 가진 미생물에 의한 발효가 행해지므로, 복합적인 발효 반응에 의해 생산된 기능성 미생물 자재를 얻는 것이 가능하기 때문이다.

국제기탁미생물군 NITE BP-1051 청구항 7과 8
번호	기탁 번호	근연종
IP-95	AB618495	바실러스 루리스(Bacillus ruris) LMG 22866 ^T
IP-2	AB618496	바실러스 바디우스(Bacillus badius) NBRC 15713^T
IP-14	AB618497	바실러스 포티스(Bacillus fortis) LMG 22079T
N-16	AB618492	바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans) ATCC 7050^T
IP-23	AB618498	리시니바실러스 자일라닐리티쿠스(Lysinibacillus xylanilyticus) KCTC 13423^T
IP-9	AB618499	버지바실러스 판토텐티쿠스(Virgibacillus pantothenticus) IAM 11061^T
IP-3	AB618500	아녹시바실러스 캄차켄시스(Anoxybacillus kamchatkensis) DSM149888^T
IP-60	AB618501	패니바실러스 티모넨시스(Paenibacillus timonensis) CIP 108005^T
IP-75	AB618502	패니바실러스 커들라놀리티쿠스(Paenibacillus curdlanolyticus) IFO 15724^T

표 1은 NITE에 국제기탁한 BP-1051의 근연균종과 그 서열 등록을 나타내고 있다.

표 2는 속명 리스트를 나타내고 있다.

[ 실시예 ]

또한, 실시예에 의거해서 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

1. 기능성 미생물 자재의 생산

실시예 1 및 실시예 2의 기능성 미생물 자재를 이하에 나타낸 방법으로 제작하였다.

(실시예 1)

발효 원료에는, 식물성 원료로서, 약 50중량%의 보리겨, 약 20중량%의, 약 10중량%의 쌀겨를 포함하고, 또한 동물성 원료로서, 약 20중량%의, 저인망어업에 의해 얻어진 새우·게 등의 갑각류나 바다 밑에 사는 물고기(底魚) 등을 포함하는 해산물을 발효시켜서 얻어진 해산물 발효물을 이용하였다. 해당 해산물 발효물은 약 10⁸개/g 내지 약 10⁹개/g의 미생물군을 포함하고, 해당 미생물군은 약 70중량% 내지 약 90중량%의 수탁 번호: PTA-1773의 미생물 및 약 30중량% 내지 약 10중량%의 수탁 번호: NITE BP-1051의 미생물로 구성되었다.

상기 식물성 원료 및 동물성 원료를 혼합해서 충분히 교반하고, 40℃에서 14시간의 1단계로 발효시키고, 건조시켜, 본 발명의 기능성 양식 사료를 얻었다. 해당 기능성 자재는 약 10⁸개/g 내지 약 10⁹개/g의 미생물군을 포함하고, 해당 미생물군은 약 90중량% 내지 약 99중량%의 수탁 번호: PTA-1773의 미생물 및 약 10중량% 내지 약 1중량%의 수탁 번호: NITE BP-1051의 미생물로 구성되었다.

(실시예 2)

발효 원료에는, 식물성 원료로서, 약 20중량%의 폐균상(廢菌床)을 포함하고, 또한 동물성 원료로서, 약 30중량%의, 저인망 어업에 의해 얻어진 새우·게 등의 갑각류나 바다 밑에 사는 물고기 등을 포함하는 해산물을 이용하였다. 해당 폐균상은 약 10⁸개/g 내지 약 10⁹개/g의 미생물군을 포함하고, 해당 미생물군은 약 70중량% 내지 약 90중량%의 수탁 번호: PTA-1773의 미생물 및 약 30중량% 내지 약 10중량%의 수탁 번호: NITE BP-1051의 미생물로 구성되었다.

상기 식물성 원료 및 동물성 원료를 혼합해서 충분히 교반하고, 2단계의 발효를 행하였다. 1단계째의 발효의 조건은 50℃ 내지 60℃에서 4 내지 5시간, 2단계째의 발효의 조건은 30℃ 내지 40℃, 6 내지 8시간으로 하였다. 2단계째의 발효 후에, 발효된 발효 원료를 건조시켜, 본 발명의 기능성 미생물 자재를 얻었다. 해당 기능성 미생물 자재는 약 10⁸개/g 내지 약 10⁹개/g의 미생물군을 포함하고, 해당 미생물군은 약 70중량% 내지 약 90중량%의 수탁 번호: PTA-1773의 미생물 및 약 30중량% 내지 약 10중량%의 수탁 번호: NITE BP-1051의 미생물로 구성되었다.

2. 고염 농도·고알카리성의 토양, 및 수환경에 있어서의 유기물 분해 활성

10%의 염분농도에 있어서의 하트 인퓨전 배지(heart infusion medium) 등에 있어서, BP-1051, 및 호열성 미생물 접종원 MIROKU M2K를 배양하고, 유기물 분해능을 지니는 균종을 선별하였다.

BP-1051에 함유되는 IP-9는, 표준균주인 버지바실러스 판토텐티쿠스(Virgibacillus pantothenticus)의 근연종이지만, 버지바실러스 판토텐티쿠스는 염분 저항성을 지니는 성분 엑토인(ectoine)을 생산한다. 또, 엑토인은 보습성분으로서 알려져 있다. 실제로, IP-9는 염분농도 10% 이상에 있어서도 유기물 분해능을 지니고 있었다. 또한, 복합균상에 함유되는 오셔노바실러스 프로펀더스(Oceanobacillus profundus)의 근연종과 공배양하는 것이 가능하다. 해당 균종도 고염 농도, 고알칼리 농도에서 유기물 분해능이 있는 것으로 알려져 있지만, 실제, 호열성 미생물 접종원 MIROKU M2K에 함유하는 균의 하나로서, 오셔노바실러스 프로펀더스의 근연종이 발견되었다. 단, 이들 균종은 단리 균주로서 지속적인 배양은 현시점에서 가능하지 않았다. 어떻든 간에, 이들 균종의 기능은, 고염 농도 및 강알칼리 농도의 토양, 및 수환경의 정화에 기여한다고 말할 수 있다.

3. 토양, 식물체 등에 대한 질산 저감화의 평가

모델 식물로서, 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 이용해서, 비료배토로서 쿠레하(クレハ) 배토(표토 5㎝)에 있어서 실시하였다. 요컨대, 4℃에서 춘화 처리를 밤새 실시한 후, 항온실(23℃)에서, 조도 10,000룩스, 24시간 명기의 조건 하에서 21일간, 100㎖의 수분을 1일 걸러 첨가해서 재배를 실시하였다.

식물에 있어서의 질산 저감 효과의 그래프(도 3). 토양에 있어서의 질산 저감화의 그래프(도 4). 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재의 첨가 농도 의존적으로, 식물체 중 그리고 토양 중의 질산 농도는 저감화되는 것이 확인되었다. 이들 질산은, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 지하에 침투하는 것이 아니라, 탈질함으로써, 오염시키지 못하게 한다고 말할 수 있었다. 이러한 경향은 수권(水圈)에 대해서도 확인할 수 있고, 배수 처리 시의 수중의 질산 이온, 암모늄 이온, 전체 질소의 농도도 경감되는 효과가 확인되었다.

6. 곁뿌리 유도 및 질산 수송체의 발현

소송채는, 흑토와 적토의 비율을 8 대 2로 한 상태에서 300g으로 조정하고, 200㎖의 물을 첨가한 후, 알루미늄박으로 상부를 덮고, 냉암소에서 1주일 정치시켰다. 그 후, 자연광이 들어오는 실내로 옮기고, 파종한 후에, 물을 100㎖ 첨가하였다. 이후, 물은 2일 걸러 첨가하였다. 또한, 모델 식물인 애기장대에 대해서는, 비료배토로서 쿠레하 배토에 있어서 실시하였다. 전술한 바와 같이, 4℃에서 춘화 처리를 밤새 실시한 후, 항온실(23℃)에서, 조도 10,000룩스, 24시간 명기의 조건 하에서 21일간, 수분을 다 없애지 않도록 일정량 첨가해서 재배하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 소송채를 이용한 실험에서, 뿌리의 발근이 20% 이상 상향되었다. 이러한 경향은, 엽채류, 근채류, 과채류, 과수류의 어느 것에 있어서도 확인되었다.

다음에 모델 식물로서, 애기장대를 이용해서, 비료배토로서 쿠레하 배토(표토 3㎝ 미만)에 있어서 실시하였다. 요컨대, 4℃에서 춘화 처리를 48시간 실시한 후, 항온실(23℃)에서, 조도 10,000룩스, 24시간 명기의 조건 하에서 21일간, 일정 수량을 유지하면서 재배를 실시하였다.

표 3은, 애기장대를 심도 5㎝의 토양에서 재배한 경우에, 본 발명의 기능성 자재에 의해 고발현하는 유전자군을 나타내고 있다. 표 4는, 애기장대를 심도 3㎝ 미만의 토양에서 재배한 경우에, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의해 고발현하는 유전자군을 나타내고 있다.

근경부의 mRNA를 추출하고, RT-PCR에서 해석한 결과, 질산 수송체 군의 하나인 NRT2.1의 발현량이, 2배 이상의 증가 경향이 확인되었다(도 6). 또, NRT2.6에 대해서도 증가 경향이 확인되었다. 또한, 표 3에 기재된 바와 같이, 옥신에 관련되는 유전자군의 발현량이 유의하게 증가한다고 말할 수 있었다. 더욱이, 표 4에 기재된 바와 같이, 노듈린 유사 단백질(nodulin like protein)이 발현되는 것도 중요한 것으로 여겨졌다. 최근, 노듈린은, 균체외 성분의 하나인 플라겔린(flagellin)에 의해서, 뿌리의 형성에 기여하고 있는 것이 시사되어 있다(Planta 234:459-476, 2011).

이와 같이, 발근 촉진 유도와 함께, 뿌리털부의 질산 수송체와 옥신 관련 유전자군 등의 발현 증강 효과가 있다. 또, 표 3에 나타낸 바와 같이, 굴광성-반응성 NPH3 계열 단백질(Phototropic-responsive NPH3 family protein)이라고 하는 광굴성을 조절하는 유전자도 강발현(强發現)하므로 광응답성이 증대하는 것으로 상정되었다. 이러한 복합적인 요인 때문에, 적은 비료 성분이라도 효율적으로 토양 중의 영양 성분을 흡수할 수 있어, 식물의 성장 촉진이 가능해지는 것으로 여겨졌다. 식물의 성장 촉진 효과에 대해서는, 이들 유전자의 기능뿐만 아니라, 호열성 미생물 접종원 MIROKU M2K에 포함되는 세균군 중, 난배양성의 바실러스 그라미니스(Bacillus graminis)의 근연종이 포함되어 있다. 바실러스 그라미니스는, 식물과 공생하는 미생물인 내생식물(endophyte)이기 때문에, 해당 균종도 성장 촉진에 기여하고 있을 가능성도 상정된다.

3. 온난화 가스인 일산화이질소의 발생 억제 능력의 평가

모델 식물로서, 애기장대를 이용해서, 비료 배토로서 쿠레하 배토(표토 5㎝)에 있어서 실시하였다. 요컨대, 4℃에서 춘화 처리를 밤새 실시한 후, 항온실(23℃)에서, 조도 10,000룩스, 24시간 명기의 조건 하에서 21일간, 100㎖의 수분을 1일 걸러 첨가해서 재배를 실시하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 아세틸렌 분위기 하에 있어서도, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재를 첨가한 토양에서는, 토양 중의 질산 이온 농도는 격감되지만, 비첨가 토양에서는 감소되기 어려웠다. 아세틸렌은, N2O로부터 N2로의 반응을 저해하므로, 그 저해 반응을 이용해서, N2O를 가스 크로마토그래피로 검출하는 것이 가능하다. 따라서, N2O를 발생시키는 토양에서는, 아세틸렌을 혼입하고 있지 않은 분위기 하에서도, N2O를 검출하는 것으로 되지만, N2를 발생시키는 토양에서는, 아세틸렌을 혼입한 분위기 하에 있어서만, N2O를 검출할 수 있다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재를 첨가한 토양에서는, 아세틸렌 블록되지 않는 토양 조건 하에서 N2O를 검출할 수 없었다. 또한, 아세틸렌 블록된 토양에서는, N2O를 검출할 수 있었기 때문에, N2를 우선적으로 방출하는 특성을 갖고 있다는 것이 밝혀졌다. 이것으로부터, 토양 중의 질산 이온은 N2 가스로서 탈질하고 있다고 말할 수 있었다.

이들 반응을 촉진하는 유전자군의 탐색을 위하여, 문헌[Throback IN et al. (2004) Reassessing PCR primers targeting nirS, nirK and nosZ genes for community surveys of denitrifying bacteria with DGGE. FEMS Microbiol. Ecol.49:401-417]에 기재된 프라이머 서열 등을 참고로 해서 PCR 검출하였다. NirK의 프라이머는, 순방향 프라이머로서 5'-GGCGGCGCGCCGCCCGCCCCGCCCCCGTCGCCCGCCTCGATCAGATTGTGGTT-3', 역방향 프라이머로서 5'-ATCATGGTCCTGCCGCG-3'를 활용하였다. 또, NirS의 프라이머는, 순방향 프라이머로서 5'-GGCGGCGCGCCGCCCGCCCCGCCCCCGTCGCCCGACTTCGGATGCGTCTTGA-3', 역방향 프라이머로서 5'-GTCAACGTCAAGGAAACCGG-3'를 활용하였다. 또한, NosZ의 프라이머는, 순방향 프라이머로서 5'-TGGGGNGAYNTBCAYCA-3', 역방향 프라이머로서는 5'-GARCARAAGTTIGTRCARTA-3'등을 활용하였다.

참고문헌으로서는, Scala DJ and Kerkhof LJ (1998) Nitrous oxide reductase (nosZ) gene-specific PCR primers for detection of denitrifiers and three nosZ genes from marine sediments.FEMS Microbiology Letters 162:61-68, 그리고 Jones, C.M., Welsh, A., Throback, I.N., Dorsch, P., Bakken L.R., Hallin, S.(2011) Phenotypic and genotypic heterogeneity among closely related soil-borne N2- and N2O-producing Bacillus isolates harboring the nosZ gene. FEMS Microbiol. Ecol.76:541-552를 활용하였다. PCR 결과, 브라디히조븀(Bradyhizobium)속, 허바스피릴륨(Herbaspirillum)속, 메조히조븀(Mesorhizobium)속 유래의 탈질효소 유전자 서열과 근연의 유전자군 등이 작용하고 있을 가능성이 있었다.

표 5는 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 포함되어 있는 탈질계 유전자군과, 표준 균주에 있어서의 탈질유전자군의 상동성을 나타내고 있다.

4. 질소 고정에 관한 평가

모델 식물로서, 애기장대를 이용해서, 비료 배토로서 쿠레하 배토(표토 5㎝)에 있어서 실시하였다. 요컨대, 4℃에서 춘화 처리를 밤새 실시한 후, 항온실(23℃)에서, 조도 10,000룩스, 24시간 명기의 조건 하에서 21일간, 100㎖의 수분을 1일 걸러 첨가해서 재배를 실시하였다. 배토의 건조화(수분 함유율의 저하)는, 수분의 첨가 기간을 수일 늘려서 조정하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 애기장대의 체내에 있어서의 암모늄 이온 농도는, 증가하는 경향이 있었다. 식물체 중의 질산 농도는, 매우 낮고, 또한 질산환원 효소의 활성은 낮으므로, 암모늄 이온의 공급원은, 다른 요인이며, 미생물 유래인 것이 기대되었다. 또, 미생물에 의한 질소 고정은, 나이트로게나제 복합체에 의해서 촉매되는 것이 알려져 있고, 그 복합체의 인자로서는, 다이나이트로게나제와 다이나이트로게나제 리덕타제가 포함되어 있다. 또한, 페레독신이나 플라보독신(flavodoxin) 등의 전자 공여체에 의해서, 다이나이트로게나제 리덕타제가 환원되어, 암모늄 이온이 형성된다.

그래서, 다이나이트로게나제 리덕타제의 유전자인 nifH를 증폭시키는 것이 가능한 프라이머를 이용해서, 원인을 탐색하였다. nifH의 프라이머로서는, 문헌[Widmer F, Shaffer BT, Porteous LA and Seidler RJ (1999) Analysis of nifH Gene Pool Complexity in Soil and Litter at a Douglas Fir Forest Site in the Oregon Cascade Mountain Range. Appl Environ Microbiol 65:374-380, 및 Poly, F., Monrozier, L.J., Bally, R.(2001) Improvement in the RFLP procedure for studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in soil. Res. Microbiol.152:95-103] 등을 참고로 해서, 순방향 프라이머로서 5'- TGCGACCCGAAAGCCGACTC-3', 역방향 프라이머로서 5'-ATGGCCATCATCTCACCGGA-3' 등을 이용해서 체크하는 것으로 하였다.

본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재 중의 박테리아는, 전자공여체로 되는 숙신산을 함유하는 무질소 배지에 있어서, 증식 가능한 균종이 단리되었다. 그 결과, NITE BP-1051에 포함되어 있는 IP-23, 그리고 IP-60,75에 근연의 리시니바실러스속, 및 패니바실러스속의 균종이 포함되어 있었다. 또한, 표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 16SrDNA의 서열을 BLAST의 해석 결과로부터 판단하여, 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)와 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis)의 근연종의 바실러스 종 36W주 및 브레비바실러스 초시넨시스(Brevibacillus choshinensis)와 브레비바실러스 브레비스(B. brevis)의 근연종의 브레비스바실러스종 123주가 포함되어 있고, 후자에 대해서는, 전술한 프라이머에서 체크 가능했지만, 이 프라이머에서는 체크할 수 없는 것도 포함되어 있었다. 어느 것에 대해서도 완전히 염기서열이 일치하지 않으므로, 신규한 균종 혹은 아종이라고 할 수 있었다. 또한, 복합 균군의 형식으로서 상승적으로 질소 고정 능력을 발휘하고 있는 것이 시사되었다. 또, NP-1051에는 바실러스 바디우스(Bacillus badius)의 근연종이 포함되어 있지만, 바실러스 바디우스에는, 질소대사에 관련되는 유전자군이 포함되어 있는 것이 알려져 있어, 공존시키는 것에 의해서 어떠한 역할을 하고 있는 것이 기대되었다. 또한, 표 3에 기재한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재를 첨가한 토양에서 생육한 식물에서는, 노화 관련 단백질(Senescence-associated protein)(SEN1)의 발현량이 늘어나지만, 최근, SEN1이 식물과 공생하는 질소 고정균에 있어서 필요한 인자라는 것이 보고되어 있는 점(Plant Cell Physiol 2011 in press, http://pcp.oxfordjournals.org/content/early/2011/11/28/pcp.pcr167.long)은 흥미롭다.

나아가, 해당 고온 발효 산물 중의 기능성 미생물의 하나인 패니바실러스 종은, 식물에 대한 공생균으로서 식물과 공생하는 능력을 지니고 있었다. 국제등록필 NITE BP-1051에 패니바실러스종이 포함되어 있지만, 이들 호열성 식물공생균에 대해서, 16S rRNA의 염기서열을 조사하여, 계통수를 작성한 바, 도 12와 같이, 패니바실러스 아밀로라이티쿠스(Paenibacillus amylolyticus)와 패니바실러스 바시노넨시스(Paenibacillus barcinonensis)와 유사하지만, 50℃에서도 증식 가능한 호열성 세균이었다. 해당 고온 발효 산물을 살포한 식물에서는, 이들 균이 식물과 공생하고 있으므로, 식물의 성장 촉진 제어나 생체 방어에 관련되는 유전자군의 발현의 촉진, 미소 생물인 선충에 의한 식물 피해 등에 대한 효과는, BP-1051이나 발효 산물 중에 함유되어 있는 패니바실러스종도 관여하고 있는 것으로 상정하고 있다.

표 6은, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 포함되어 있는, 질소 고정균 바실러스종 36W주의 16SrDNA의 서열을 나타내고 있다. 표 7은, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 포함되어 있는, 질소 고정균 브레비바실러스종 123주의 16SrDNA의 서열을 나타내고 있다.

삭제

7. 아미노산 농도의 조절 기능의 평가

모델 식물로서, 애기장대를 이용해서, 비료 배토로서 쿠레하 배토(표토 5㎝)에 있어서 실시하였다. 요컨대, 4℃에서 춘화 처리를 밤새 실시한 후, 항온실(23℃)에서, 조도 10,000룩스, 24시간 명기의 조건 하에서 21일간, 100ml의 수분을 1일 걸러 첨가해서 재배를 실시하였다. 배토의 건조화(수분 함유율의 저하)는, 수분의 첨가 기간을 수일 늘려서 조정하였다.

도 10에 기재한 바와 같이, 애기장대의 체내에 있어서의 글루탐산 및 글루타민의 농도는, 자재를 첨가한 군에서 유의하게 증가하였다. 글루탐산에 분해되는 아르기닌도 현저하게 증가하는 경향이 확인되었다. 글루탐산은, 암모늄 이온으로 생성되는 것이므로, 도 9의 데이터는 모순되지 않는 것도 판명되었다. 일반적으로, 식물 유래의 글루탐산은 작물의 감칠맛에 관여할 뿐만 아니라, 모든 항산화 효소의 발현 등 극히 중요한 아미노산으로서, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재가 식물의 품질과 기능성 향상에 기여한다고 말할 수 있었다. 또한, 표 4의 강발현 유전자의 하나인 노듈린은, 글루타민 합성 기능에 기여하는 것도 알려져 있어(Planta 234:459-476, 2011), 본 발명에 의한 실시예와 모순되지 않는다.

다음에, 재배 토양의 수분 함유율이 10% 감소하면, 도 11에 기재한 바와 같이, 자재 첨가군에서 프롤린이 현저하게 증가하는 경향이 확인되었다. 식물체 중의 프롤린은, 건조 시에 P5C 리덕타제(Pyrroline-5-carboxylate reductase) 등의 반응에 의해서, 글루탐산으로부터 생성되어, 프롤린 옥시다제 등의 반응에 의해서, 글루탐산으로서 변환되지만, 수분 함유율이 높은 조건 하에서는, 프롤린 옥시다제의 발현이 2배 이상이 되므로, 글루탐산의 농도와의 관계에서 모순이 없었다. 또한, 일반적으로, 프롤린은 건조 내성이나 보습 등에 관여하는 아미노산인 것이 알려져 있으므로, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재는 이러한 점에서도 식물의 기능성의 향상에 기여한다고 말할 수 있었다.

8. 내고온 장해 유전자 및 내병해 응답 유전자의 발현

자연계에서는 식물의 생육 환경이 변동하므로, 다른 재배 조건에서 모델 식물인 애기장대를 재배하고, 발현 유전자의 패턴을 해석하였다. 모델 식물로서, 애기장대를 이용해서, 비료 배토로서 쿠레하 배토를 이용해서 실시하였다. 표 3은 표토 5㎝에서 실시한 데이터이며, 4℃에서 춘화 처리를 밤새 실시한 후, 항온실(23℃)에서, 조도 10,000룩스, 24시간 명기의 조건 하에서 21일간, 100㎖의 수분을 1일 걸러 첨가해서 재배를 실시하였다. 한편, 표 4는, 표토 3㎝ 미만에서 실시한 데이터이며, 4℃에서 춘화 처리를 밤새 실시한 후, 항온실(23℃)에서, 조도 10,000룩스, 24시간 명기의 조건 하에서 21일간, 수분을 다 없애지 않도록 일정량 첨가해서 재배하였다. 이러한 조건 하에서, DNA 마이크로어레이(전회 PCT 출원과 마찬가지 방법)를 실시하고, 모델 식물에 강발현하는 유전자군을 망라적으로 스크리닝하였다.

본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재를 첨가한 토양에서 생육한 애기장대에서 보편적으로 강발현하는 유전자군은, 표 3 및 표 4로 나타내었다. 그 중에서도 분자 샤페론(chaperon)인 열 충격 단백질(HSP)의 발현이 확인되었다. HSP로서는, HSP70 계열, HSP90 계열, HSP101 계열 등의 발현량이 증가하였다.

발현량이 변화되는 유전자 중, HSP에 관해서는, 어느 쪽의 HSP도 고온 스트레스나 각종 환경 스트레스에 대한 내성 기능에 기여하는 인자이다(Trends Plant Sci 9: ,244-252, 2004; Science 330:1820-1824, 2010; Plant Cell, Vol.12, 457-460, 2000). 또한, RING-H2 유전자인 XERICO는, 식물의 성장이나 내건조성, 내염성 등의 제어에 작용하는 중요한 식물 호르몬, 아부시스산의 생성의 제어에 관련되어 있다(Plant Journal 47:343-355, 2006).

또, 내건조성에 대해서는, 도 11에 나타낸 바와 같이 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재를 첨가한 토양에서 재배하여, 토양 수분 함유율을 10% 저하시킨 조건 하로 이행하면, 프롤린 농도의 증가 정도가 변화된다고 하는 점이 흥미롭다.

또한, 생체 방어에 관련된 인자로서는, HSP로서 HSP70이나 HSP90이, SGT1이나 RAR1과 함께, 내병성 기능에 기여하는 것이 알려져 있다(Plant Cell 19:4061-4076, 2007; J Biol Chem 279:2101-2108, 2004; EMBO J 27:2789-2798, 2008). 또, 노듈린도 내병성에 관한 유전자인 것도 알려져 있다(Olivares JE et al. (2011) Nodulin 41, a novel late nodulin of common bean with peptidase activity. BMC Plant Biol 10:134). 또한, 노화 관련 단백질(SEN1)의 발현은 살리실산이나 재스몬산의 신호 전달에 의해서 제어되고 있어, 내병성에 관한 마커 유전자로 상정되어 있다. 또, 살리실산은, 바이러스나 박테리아 등의 다양한 병원성 미생물에 대한 저항성에 관여하는 인자이며, 재스몬산은 살리실산과 경쟁적으로 작용하지만, 환경 스트레스에 대한 내성유도 인자인 것이 알려져 있다.

병원체에 대한 내성 유전자로서는, LTP(LIPID TRANSFER PROTEIN)(Nature 419:399-403, 2002)이 강발현된다. 또한, 트립신 및 프로테아제 저해제/쿠니츠 계열 단백질은, 다양한 병원체에 대하여 내성을 나타내는 유전자(Molecular Plant 1:482-495, 2008)로서 알려져, 곰팡이독인 후모니신 B1에 의해서 유도되는 세포사와 경쟁하는 길항제이다. 또한, HPL1(HYDROPEROXIDE LYASE 1)은, 진디의 활동을 정지시키는(Proc Natl Acad Sci USA 98:8139-8144, 2001) 것이 알려져 있는 인자이며, 파이토알렉신(phytoalexin)을 생합성하는 사이토크롬 P450 71B15, 추정상(putative)(CYP71B15)도 강발현하는 것이 밝혀졌다. P450 71B15는, 카멜렉신(Camalexin)이라는 파이토알렉신을 생성하는 것이 알려져 있는 사이토크롬 효소이다(Plant Cell 8:2235-2244, 1996). 카멜렉신은, 병원성의 사상균이나 박테리아의 증식을 억제하는 것이 알려져 있다. 이러한 효소는, 환경 스트레스나 유출자(elicitor)에 의해 유도되는 것(Plant Cell 10:359-370, 1998)으로, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재에 의한 토양환경의 변화나 유출자로서의 기능을 담당하고 있는 것으로 상정되었다.

또한, 일단, 병원균이 감염되어도, 식물체의 세포사를 방지하는 인자로서 알려져 있는 아스파틸 프로테아제(EMBO J. 2004 February 25;23(4):980-988; EMBO reports 6:282-288)도 강발현될 수 있다.

이와 같이, 많은 생체 방어 관련 유전자군의 발현이 유도되지만, 그들의 전사조절에 관여할 수 있는 유전자군으로서 알려져 있는 WRKY 집단 전사 인자(Plant Mol Biol 51:21-37,2003)가 각종 강발현하고 있는 것도 모순되지 않는다고 말할 수 있었다. 또한, 표 4에 기재된 글루타레독신 계열 단백질, 글루타티온 S-전이효소는, 항산화 활성에 관여하고 있어, 동시에 비타민 C나 비타민 E도 증가하는 경향이 있으므로, 식물체 중의 항산화 활성이 개선된다고 말할 수 있었다.

또, 본 발명의 자재의 안정화를 위하여 이용하는 PTA-1773이나 호열성 미생물 접종원 M2K(기탁 거부분)에는, 키틴질 분해효소나 항곰팡이 활성이 높은 리포펩타이드가 함유되어 있으므로, 시험 현장에 살포할 때에는, 토양, 그리고 식물체, 혹은 수권에 있어서의 사상균의 존재 비율을 일차적으로 감소시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 미생물 자재를 농업 분야에서 이용한 경우에는, 식물체외의 생육 환경으로서 병원성 사상균의 존재 비율을 낮춘 상태에서, 식물체내의 생체 방어 유전자군을 활성화시키므로, 생체내외 양면으로부터의 환경 컨트롤을 하는 것이 가능하다.

독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁센터

NITEBP1051

20110118

미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection Center)

ATCCPTA1773

20000501

SEQUENCE LISTING <110> JAPAN ECO-SCIENCE CO.，LTD. NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION CHIBA UNIVERSITY MIROKU CO.，LTD. KEIYO PLANT ENGINEERING CO.，LTD <120> MICROBIAL MATERIALS TO IMPROVE SOIL- AND/OR WATER-POLLUTION AND THE FUNCTIONALITY OF THE PLANT WITH SUPPRESSION OF GLOBAL WARMING GAS GENERATION, AND THEIR PRODUCTION METHODS WITH FERMENTATION PROCESS <130> JEP14183KR <140> PCT/JP2013/67907 <141> 2013-06-28 <160> 10 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to detect NirK mRNA <400> 1 ggcggcgcgc cgcccgcccc gcccccgtcg cccgcctcga tcagattgtg gtt 53 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to detect NirK mRNA <400> 2 atcatggtcc tgccgcg 17 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to detect NirS mRNA <400> 3 ggcggcgcgc cgcccgcccc gcccccgtcg cccgacttcg gatgcgtctt ga 52 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to detect NirS mRNA <400> 4 gtcaacgtca aggaaaccgg 20 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to detect NosZ mRNA <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 tggggngayn tbcayca 17 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to detect NosZ mRNA <400> 6 garcaraagt tgtrcarta 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer to detect NifH mRNA <400> 7 tgcgacccga aagccgactc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to detect NifH mRNA <400> 8 atggccatca tctcaccgga 20 <210> 9 <211> 1449 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Related species of Bacillus pumilus or Bacillus safensis <400> 9 gacagaaggg agcttgctcc cggatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 60 ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggagcta ataccggata gttccttgaa 120 ccgcatggtt caaggatgaa agacggtttc ggctgtcact tacagatgga cccgcggcgc 180 attagctagt tggtggggta atggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg 240 gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg 300 aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc 360 ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtgcgag agtaactgct cgcaccttga 420 cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 480 ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga 540 tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctgggaaact tgagtgcaga 600 agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 660 tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa 720 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctagtgt taggggtttc 780 cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga 840 ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900 aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaaccctag agatagggct 960 ttcccttcgg ggacagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg 1080 cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1140 tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gctgcaagac 1200 cgcaaggttt agccaatccc ataaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga 1260 ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1320 gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgc aacacccgaa gtcggtgagg 1380 taacctttat ggagccagcc gccgaaggtg gggcagatga ttggggtgaa gtcgtacaaa 1440 ggtagccca 1449 <210> 10 <211> 820 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Related species of Brevibacillus choshinensis or Brevibacillus brevis <400> 10 ctgccggcgt gcctatactg caagtcgagc gagtctcttc ggaggctagc ggcggacggg 60 tgagtaacac gtaggcaacc tgcctctcag actgggataa catagggaaa cttatgctaa 120 taccggatag gtttttggat cgcatgatcc aaaaagaaaa ggcggcttta agctgtcact 180 gggagatggg cctgcggcgc attacctagt tggtggggta atggcctacc aaggcgacaa 240 tgcgtacccg acctgaaagg gtgaccggcc acactgggac tgaaacacgg cccaaactcc 300 tacgggaggc agcagtaggg aattttccac aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg 360 cgtgaacgat gaaggtcttc ggattgtaaa gttctgttgt tagggacaaa caagtaccgt 420 tcgaataggg cggtaccttg acggtacctg acgagaaagc cacggctaac tacgtgccac 480 cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgcgcg 540 caggcggcta tgtaagtctg gtgttaaagc ccggagctca actccggttc gcatcggaaa 600 ctgtgtagct tgagtgcaaa agaggaaagc ggtattccac gtgtagcggt gaaatgcgta 660 gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc ggctttctgg tctgtaactg acgctgaggc 720 gcgaaagctg tggtggagca aacaggatta gataccctgc tagtccacgc cgtaaacgat 780 gagtgctagg tgttggggtt tcatacctca attgccgcag 820

Claims

토양 혹은 수환경, 식물체 중의 질산 수송체의 발현 활성을 촉진시키고, 탈질 촉진하는 동시에, 질소고정시킴으로써 식물의 생육에 기여하고, 식물 중의 글루타민 또는 글루탐산 또는 아르기닌의 농도를 증가시키고, 건조 시에는 프롤린의 농도를 증가시켜, 식물 중에 있어서, 건조 내성, 해충에 대한 저항성 기능 성분의 발현을 유도하는 기능을 지니는, 미생물 자재의 제조방법으로서,
식물성 원료와 동물성 원료를 포함하는 발효 원료를 교반해서 발효 원료를 얻는 교반 공정과, 상기 교반 공정에서 얻어진 발효 원료를 총 미생물 중 70중량% ~ 90중량%의 수탁 번호: PTA-1773의 미생물 및 30중량% ~ 10중량%의 수탁 번호: NITE BP-1051의 미생물로 발효하는 발효 공정을 포함하고,
상기 발효 공정은 총 2단계 발효로 구성되고, 상기 총 2단계 발효는 50℃ 내지 60℃에서 4 내지 5시간의 1단계째 발효와, 30℃ 내지 40℃에서 6 내지 8시간의 2단계째 발효를 포함하는, 미생물 자재의 제조방법.