KR101815787B1 - 인삼 뿌리썩음병원균 방제효과 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 써린지엔시스 knu-07 균주, 및 이의 이용 - Google Patents

인삼 뿌리썩음병원균 방제효과 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 써린지엔시스 knu-07 균주, 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주를 제공한다. 본 발명에 따른 식물 생장 촉진용 미생물 제제로 활용 가능한 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주는 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진 기능을 가지고 있으므로, 친환경 농법에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인삼 뿌리썩음병원균 방제효과 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 써린지엔시스 KNU-07 균주, 및 이의 이용 {Bacillus thuringiensis KNU-07 strain having antifungal activity against ginseng root rot pathogens plant growth promoting effect, and uses thereof}
본 발명은 인삼 뿌리썩음병원균 방제효과 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 써린지엔시스 KNU-07 균주, 이의 배양물, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
인삼은 전국 각지에서 재배되는 고소득 작물이다. 상기 인삼은 경제성을 고려할 때 5~6년 동안 장기간 재배되어야한다. 이에 따라, 장기간 재배 기간 동안 병해에 노출될 가능성이 높아진다. 특히 뿌리 썩음병, 모잘록 병등 곰팡이에 의해 방생되는 병해가 잘 알려져 있다.
상기 병해에 대응하기 위한 농약으로는 유기질 또는 화학 비료가 있다. 그러나 유기질, 화학비료의 과다사용에 의해 토양의 오염, 연작장해, 토양양분의 불균형, 병해충 발생 등의 많은 문제가 발생되어, 인삼의 품질이 저하되거나, 농가의 소득 저하 등의 부작용이 나타나고 있다. 중요한 식물 영양분인 질소(N)는 이러한 화학 비료의 사용에 의해 공급되어 왔으나, 더 높은 수확량을 유지하기 위한 화학 비료의 과잉 이용은 낮은 투입으로 높은 생산성을 요하는 지속 가능한 농업의 원리에 반하는 문제점이 있고, 또한 환경적인 문제를 초래하고 있다.
이와 같은 문제를 해소하기 위하여 화학비료를 대체할 수 있는 수단으로, 농업환경 및 생태계 부담을 최소화하면서 안전한 먹거리를 해결하는 생물학적 방법이 활발히 연구되고 있으며, 그 대체방안으로 유용 미생물을 이용한 병해 방제 연구가 꾸준히 이루어지고 있다.
이러한 미생물 비료는 염류 집적 등 토양오염의 환경 문제를 일으키지 않는다는 장점이 있으며, 생태계 안전성 유지에 탁월하며 작물생산성을 지속적으로 향상시키는 이점이 있고, 친환경의 지속가능한 농업에 대한 관심이 증가함에 따라, 농업 유용 미생물에 대한 연구가 꾸준히 이루어지고 있다.
현재 상용화되어 있는 농업 유용 미생물은 식물 병원성 미생물에 대한 길항효과, 토양 내 무기 영양분의 가용화, 다양한 식물 생장 촉진 등의 효과를 가지고 있는 미생물 제제가 있으며 현재 사용 가능한 화학 농약 및 비료의 숫자도 줄어들고 있는 실정이므로 이를 대체할 수 있는 미생물 제제 또한 필요한 실정이다. 이와 관련하여 국내 공개특허 제2015-0105546호에서는 식물생장을 촉진하는 엔테로박터 루드위지아이 SJR3 균주를 제시한 바 있다. 그러나, 현재 개발되어 사용되고 유용 미생물은 병원성 곰팡이 길항 현상에 관한 관찰뿐 정확한 미생물의 유전자적 기작과 안전성을 제시 못하는 부분이 존재하였다.
본 발명자들은 화학비료를 대체할 수 있는 인삼 뿌리썩음병 방제 및 친환경 식물 생장 촉진용 미생물 제제를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 KNU-07 균주에 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물의 생장 촉진 효과를 가지는 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주(KCTC 13081BP) 및 이를 이용한 미생물 제제를 제공하는 데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물의 생장 촉진 효과를 가지는 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주(수탁번호 KCTC 13081BP)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 2 내지 6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인삼 병원성 진균에 대한 길항 기능 및 인삼의 생장 촉진 기능 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진용 미생물 제제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진용 미생물 비료를 제공한다.
아울러 본 발명은 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주는 인삼 뿌리썩음병 방제 효과 및 식물 생장 촉진 기능을 가져, 친환경 농법 미생물 제제로서 사용이 가능하며, 인삼 병원성 진균에 대한 항진균 및 식물생장 촉진 관련 유전자 서열을 밝혀 이를 이용하여 다양한 조건에서 효과적으로 사용 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주를 병원성 진균과 대치배양시 길항 정도를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 염기서열(1,544 bp)을 공시 균주와 비교하여 계통발생학적 모식도로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 염기서열(서열번호 1)을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 API 50 CHB kit를 이용한 에너지원의 산화, 발효 검사 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주를 병원성 진균과 같이 인삼에 90일 간 처리하여 경과를 본 것으로 항진균 활성을 나타내며 생장촉진 활성을 갖는 것을 직접 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 식물생장 촉진능을 발색반응법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 이를 위해 바실러스 속의 공시 균주들을 이용하였으며, 해당 균주들에 비하여 우수한 기능을 하는 것을 보여 주었다.
도 7은 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 병원성 진균에 대한 길항작용과 생장촉진 기능과 관련된 Translation initiation factor 3(서열번호 2), Aminodeoxychorismate Tryptophan synthase alpha chain (EC 4.2.1.20) I(서열번호 3), Anthranilate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.18, 서열번호 4), Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20) II(서열번호 5), Phosphoribosylanthranilate isomerase (EC 5.3.1.24, 서열번호 6)의 유전자 염기 서열을 나타낸 도면이다.
도 8은 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 전체 유전자 서열 지도를 나타낸 도면이다.
도 9는 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 인축에 대한 유해성 검사를 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 건강한 인삼의 내재균으로서 분리한 인삼 뿌리썩음병에 길항하며, 인삼 생장 촉진 기능을 갖는 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 (수탁번호 KCTC13081BP) 균주를 제공한다.
상기 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 서열은 서열번호 1로 표시되는 것이다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 공시 균주인 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) ATCC 10792T 와 가장 높은 유사성을 보이며, 양 균주 간의 전체 유전자 서열을 비교한 결과에서 4%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
이에 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주로 명명하고, 2016년 8월 23일자로 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13081BP를 부여 받았다.
본 발명의 상기 균주는 토양시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 질산을 환원시키고, 글리세롤(Glyserol), 아라비노오스(Arabinose), 글루코스(Glucose), 프럭토스(Fructose), 마노스(Mannose), 및 아라비톨(Arabitol)을 에너지원으로 사용함을 확인하였다.
상기 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주는 인삼 뿌리썩음병을 방제하는 기능과, 인삼의 생장을 촉진하는 기능을 가진다.
상기 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주는 병원성 균주에 대해 길항성을 갖는 것을 특징으로 한다. 병원성 곰팡이에 대한 길항능은 병원성 곰팡이들에 대한 대치 배양 시험에서 확인되었다(도 1).
이와 같이 본 발명의 균주에는 병원성 곰팡이의 방제 효과가 있다는 것을 확인하였고, 이에 따라, 상기 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자 (rDNA)를 확인하였고(서열번호 1, 도 3), 이를 이용한 계통분류학적 모식도를 확인하여 도 2에 나타내었다. 상기 균주의 계통분류학적 모식도는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0 version에서 확인된 것이다.
또한 상기 바실러스 써린엔지스 KNU-07 균주를 병원성 진균과 같이 인삼에 처리한 결과, 항진균 활성을 나타내는 것을 확인하였고(도 5), 공시 균주들에 비하여 우수한 식물생장 촉진능을 가진다는 것을 확인하였다(도 6).
상기와 같이 병원성 곰팡이 성장을 억제 시켰고, 해당 길항 능을 통해 인삼 근권 주위에 병원성 곰팡이가 있는 경우에도 기능을 발휘해 인삼의 정상 성장을 돕는 것으로 확인 되었으며, 이들 기능과 관련된 Translation initiation factor 3(서열번호 2), Tryptophan synthase alpha chain (EC 4.2.1.20) I(서열번호 3), Anthranilate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.18)(서열번호 4), Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20) II(서열번호 5), 및 Phosphoribosylanthranilate isomerase (EC 5.3.1.24)(서열번호 6)의 유전자 염기 서열이 밝혀졌다(도 7). 또한, 전체 유전자 염기 서열 분석 결과 인축에 무해할 것으로 판명되었다.
따라서 본 발명은 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진용 미생물 제제/비료를 제공할 수 있는 것이고, 상기 미생물 제제/비료를 처리함으로서, 인삼 뿌리썩음병 방제 및 인삼 생장 촉진 방법을 제공할 수 있는 것이다.
본 발명에서 상기 배양물은 균주를 배양한 보통 한천배지(또는 영양 한천배지; Nutrient agar)배지, TSA(tryptic soy agar) 배지, 표준한천배지(Standard Methods Agar; Plate Count Agar), 유당배지(lactose Broth), BGlB 배지(Brilliant Green lactose Bile Broth), 2배 농도 BGlB 배지, Endo 한천배지(Endo Agar), EMB 한천배지(Eosin methylene blue agar), 보통 배지(또는 영양 배지; Nutrient Broth), 데스옥시콜레이트 유당 한천배지(Desoxycholate lactose Agar) 또는 EC 배지(EC Broth)로부터 분리하여 얻은 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물 제제 조성물은 통상적인 방법으로 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진용으로 제형화할 수 있으며 건조분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제 조성물은 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 바람직하게는 화학비료를 대체하기 위한 식물 생장 촉진 생물비료로 제형화 할 수 있고, 즉 화학 비료 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물비료로 제형화가 가능하다.
본 발명에서 상기 미생물 제제는, 균주 또는 이의 배양물에 계면활성제, 중량제, 영양제등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양, 식물 또는 식물 종자에 처리함으로써 인삼 뿌리썩음병 방제 방법 및 식물 종자의 발아를 촉진하는 방법을 제공한다. 이때, 처리방법에는 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있다. 그 사용량은, 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
본 발명에서, 상기 방법에 따라 처리되는 제제에 함유된 미생물의 유효량은 경작지 면적(㎡) 당 1 내지 1×10100의 미생물 수로 포함될 수 있다. 또한, 상기 방법 중 살포에 의해 처리되는 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10100의 미생물 농도로 포함될 수 있으며, 침지에 의해 처리되는 조성물에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10100의 미생물 농도로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1. 바실러스 써린지엔시스 ( Bacillus thuringiensis ) KNU-07 균주의 분리 및 동정]
1-1. 병원성 진균에 대한 길항능
경상북도 상주시 일대 인삼재배 농가의 토양 및 인삼 시료를 채취하였다. 토양 내지 분쇄한 인삼 절편 1 g을 Saline (0.85% NaCl)에 희석한 후, TSA (Tryptic Soy Agar), LB (Luria-Bertani) agar 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 배양된 균주들 중 인삼 뿌리썩음병 방제용으로 사용 가능한 후보를 찾기 위해 병원성 진균에 대한 대치배양 시험을 실시하였다. 분리한 균들은 병원성 진균인 Cylindrocarpon destructans KACC 41077와 Rhizoctonia solani KACC 40101와 대치 배양을 할 수 있는 plate에 옮겨 저해 환을 형성하는지 여부를 확인했다. 그 결과를 도 1 및 표 1에 나타내었으며, 해당 병원균에 대하여 모두 길항 작용을 나타내는 것으로 확인되었다..
Test microorganisms Growth inhibition
Cylindrocarpon destructans
KACC41077(뿌리썩음병 유발)		 ○
Rhizoctonia solani KACC 40101
(유묘 모잘록병 유발)		 ○
1-2. 분리 균주의 동정
병원성 미생물에 길항능이 우수한 균주로 뿌리썩음병 방제제로 사용 가능한 균주의 동정을 위하여 회수한 균체로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후(Thompson, 1980), 분리한 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의하여 16S rRNA를 증폭하였다. 이 때 사용한 다용도 프라이머(universal primer)는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 각각 사용하였다(Lane 1991). 증폭한 PCR 산물은 PCR 정제 시스템(Solgent, Daejon, Korea)을 이용하여 정제하였다. 정제한 PCR 산물의 전체 염기서열을 분석하기 위한 염기서열분석(sequencing)은 솔젠트(Solgent, Daejon, Korea)에 의뢰하여 실시하였다.
분석한 염기서열 결과는 NCBI의 BLASTN을 이용하여 비교하였으며, 염기서열의 상동성 및 계통발생학적 모식도(phylogenetic tree)는 Bioedit와 Mega5 프로그램을 통해 인접결합방법(neighbor-joining methods)을 사용하여 분석하였다. 이의 결과를 도 2 및 3에 나타내었다.
분리한 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열의 비교를 통해 기존에 보고된 공시 균주인 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis) ATCC 10792T와 가장 높은 유사도를 보여 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로 속명 확정하였으며, 상기 균주는 기존의 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis) ATCC 10792T과 전체 유전자 서열을 비교 할 수 있는 ANI (average nucleotide identity) 분석을 통해 4% 상이하기 때문에, 바실러스 종에 속하는 신규한 균주로 인정받아, 이를 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KNU-07로 명명하고, 상기 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC13081BP). 또한 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 염기서열을 확인하였다.
[실시예 2. 균주의 형태적 및 생화학적 특성]
본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 당 대사능을 알아보기위해 표 2와 같은 유효성분을 사용하여 균주의 성장 여부를 30℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후 비교하였다. 이의 결과와 도 4와 같은 API 50 CHB 키트의 색깔 변화 및 균주 생육에 따른 혼탁도를 이용하여 음성/양성을 확인한 후 표 2을 작성하였다.
유효성분 결과
Glyserol +
Erythrol -
Arabinose +
Glucose +
Fructose +
Mannose +
Inulin -
Arabitol +
Lyxose -
표 2에 나타낸 바와 같이 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주는 Glyserol, Arabinose, Glucose, Fructose, Mannose, Arabitol을 에너지원으로 사용함을 확인하였다.
[ 실시예 3. 바실러스 써린지엔시스 ( Bacillus thuringiensis ) KNU -07 균주를 이용한 인삼 뿌리썩음병 방제 시험]
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 병원성 진균에 대하여 길항능을 나타내는 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주를 실제 인삼 재배 환경에서 사용 할 수 있을지 판단 하기 위해, 묘삼을 이용한 포트 실험을 실시하였다. 1 년근 묘삼을 이식한 포트에 뿌리썩음병을 유발 하는 진균의 포자 108개를 물 100 mL에 현탁 처리 하여 발병을 유도 하였으며, 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주 50 mL 배양액의 상등액과 균체를 분리 회수 하여 최종 200 mL가 되도록 물에 현탁하여 인삼 포트에 10일 간격으로 처리 하며 90일간 진행 하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었으며, 상기 방법에서 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주 처리시 인삼 뿌리썩음병 방제 효과를 보였으며, 항진균 효과가 없는 대조군 처리구에 비해 월등한 효과를 보였다. 이를 통해 실제 인삼 재배 농가에서도 친환경 제제로서 본 발명의 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07을 사용 할 수 있음을 확인하였다.
[ 실시예 4. 발색법을 이용한 바실러스 써린지엔시스 ( Bacillus thuringiensis ) KNU -07 균주의 식물생장 활성확인]
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주가 인삼 병원성 진균에 대한 길항능과 함께 인삼의 생장 촉진능을 나타내는 것을 확인 하여 발색법을 통해 IAA (auxin) production, Denitrification (NO2) activity, Denitrification (NO3) activity, Siderophore activity, Urease activity, Phosphatase activity를 측정 하였으며, 색이 진할수록 높은 활성을 보인다. 이를 위해 공시 균주인 Bacillus licheniformis KACC 10476, Bacillus megaterium KACC 10482, Bacillus polymyxa KACC 10485, Bacillus subtilis KACC 10854, Bacillus pumilus KACC 10917, Bacillus macerans KACC 11233, Bacillus amyloliquefaciens KACC 12067, Bacillus velezensis KACC 14004 또한 실험군으로 사용 하였으며, 발색 정도의 진하기를 비교한 결과 도 6과 같이 월등한 경과를 보였으며, IAA (auxin) production의 경우 정량 결과 0.4 mM/mL 수준으로 생성함을 확인 하였다.
[ 실시예 5. 바실러스 써린지엔시스 ( Bacillus thuringiensis ) KNU -07 균주의 인삼 병원성 진균에 대한 항진균 및 인삼 생장 촉진 활성 유전자 서열 정보 및 전체 유전자 서열의 유해성 검사]
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 인삼 병원성 진균에 대한 길항능과 생장 촉진능을 나타내는 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주의 관련 유전자 서열을 밝히기 위하여 균체로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후 PacBio SMRT sequencing 장비를 이용하여 전체 유전자 서열을 밝혔으며, 도 7과 같이 해당 작용에 관여할 수 있는 역할을 나타내는 Translation initiation factor 3, Tryptophan synthase alpha chain (EC 4.2.1.20) I, Anthranilate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.18), Tryptophan synthase beta chain (EC 4.2.1.20) II, Phosphoribosylanthranilate isomerase (EC 5.3.1.24)의 유전자 염기 서열을 확인 하였다.
완성된 전체 유전자 서열 지도는 도 8에 나타냈었으며, 이를 대상으로 온라인 데이터 베이스 기반은 ClanTox (http://www.clantox.cs.huji.ac.il/)를 통하여 인축에 대한 유해성 검사를 실시 하였으며, 바실러스 써린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주가 보유한 전체 6,293개의 유전자중 toxin-like gene이 3개 발견 되었으나 기능이 없는 putative uncharacterized protein gene으로 최종 인축에 무해한 것으로 판명되었다 (도 9).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13081BP
수탁일자 : 20160823
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Bacillus thuringiensis KNU-07 strain having antifungal activity against ginseng root rot pathogens plant growth promoting effect, and uses thereof <130> MP16-413 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1544 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis KNU-07 16S rRNA gene sequence <400> 1 gtttgatcct ggctcaggat gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgaa 60 tggattaaga gcttgctctt atgaagttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 120 ctgcccataa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggata atattttgaa 180 ctgcatggtt cgaaattgaa aggcggcttc ggctgtcact tatggatgga cccgcgtcgc 240 attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg 300 gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg 360 aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc 420 gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa caagtgctag ttgaataagc tggcaccttg 480 acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540 tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggtggttt cttaagtctg 600 atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag 660 aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatatgg aggaacacca 720 gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact gacactgagg cgcgaaagcg tggggagcaa 780 acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt 840 ttccgccctt tagtgctgaa gttaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggccgca 900 aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960 tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgaaaaccc tagagatagg 1020 gcttctcctt cgggagcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca tcattaagtt 1140 gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200 tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa agagctgcaa 1260 gaccgcgagg tggagctaat ctcataaaac cgttctcagt tcggattgta ggctgcaact 1320 cgcctacatg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1380 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg 1440 gggtaacctt tttggagcca gccgcctaag gtgggacaga tgattggggt gaagtcgtaa 1500 caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttct 1544 <210> 2 <211> 501 <212> DNA <213> Translation inhibition factor 3 <400> 2 atgattaacg agcaaattcg tgcacgtgaa gtacgtttag ttggcgcaaa tggcgatcaa 60 cttggaatca agtctcgtaa tgacgcttta gacttagctg caaatcttaa tcttgattta 120 gtattagttg ctccaaatgc gaaaccgcca gtatgccgca ttatggacta cggtaaattc 180 cgctttgagc aacagaagaa agaaaaagag cagcgcaaaa atcaaaaagt aattagcatg 240 aaagaagttc gtttaagtcc aacaattgat gaacacgact ttaacacaaa acttcgtaat 300 gctatcaagt ttttagagaa aggcgacaag gttaaagcgt caattcgctt taaaggacgt 360 gccattactc ataaagaaat cggtcaacgt gttttagatc gcttctcaga agcttgtgct 420 gaagttagta cagttgaatc taagcctaaa atggaaggac gcagtatgtt cttagtttta 480 gcaccgaaaa acgataagta a 501 <210> 3 <211> 777 <212> DNA <213> Tryptophan synthase alpha chain I <400> 3 atggcagtag aaaaaattaa agcagcgttt gaaaatggca agaaagcatt tattccgtac 60 gtaatgggcg gagatggcgg ccttgaaaaa ttaaaagaaa gaattcgttt tctagatgaa 120 gctggagcaa gcatcgttga aattggtatt ccgttttcag atccagtcgc ggacggccca 180 acgattcaaa gagcaggaaa gcgagcgcta gatagcggcg taacattaaa aggcattttt 240 caagcgttag cagaggtaag gaaagaagta caaatgcctt ttgttcttat gacatattta 300 aatccggtac ttgcattcgg aaaagagaga ttcattgaga actgtataga agcaggtgta 360 gacggcatca tcgttccaga cttaccgtat gaagaacaaa atattattgc gtcgttactt 420 cgagaggcaa acattgcgct cattccactc gttaccgtaa cgagtcctat tgaaagaatt 480 gaaaaaatta cgagtgaatc agaagggttc gtttatgctg ttacagtagc gggcgtaacg 540 ggagtacgtc aaaactttaa agaggagatt catagttact tagaaaaagt aaaatcacac 600 gtcaacttac cagtagtcgc tggatttggc atctcaacaa aagaacatgt agaagaaatg 660 gttacaatat gcgacggagt tgtcgttgga agtaagatca ttgagctttt agaaaatgaa 720 aagcaagaag aaatatgtga attaatatat gcaacaaaac aaaaagaaga ggcgtag 777 <210> 4 <211> 834 <212> DNA <213> Anthranilate phosphoribosyltransferase <400> 4 atgaacaact atcttcgtaa attagtggag ggtcaacatt taacagaaga ggaaatgtat 60 aaagcaggac tacttttatt aagtgaaaac atattagaaa gtgaaattgc agctttctta 120 gtcttactga aagcgaaagg tgaaactgca gaagaaatat acggtctcgt tcgagctctt 180 cgcgaaaagg cattgccgtt ttcgaaccat atacaaggag caatggacaa ttgcgggacg 240 ggtggtgatg gtgctcaaac gtttaatatt agcacaacat cagcattcgt actggcagga 300 gcaggtgtaa aggttgcaaa acatggtaat cgtgctgttt ctagtaaaac aggaagtgca 360 gacttattag aagaactagg tgtaaatatt agtagtacgc caaacgaaat tgattattta 420 ctagagcatg taggtattgc atttttattt gcaccagcga tgcatccagc actaaggcgc 480 attatgaaaa taagaaaaga gttaaacgtg ccgacgatct ttaacttaat tggcccttta 540 acaaatccag tgaatttaga aacacaattt gtcggtattt ataaacgaga tatgttatta 600 ccagttgcac aagtattaca aaagttaggc cggaaacaag cgcttgtcgt aaatggaagt 660 ggttttttag atgaagcgtc attacaaggg gaaaatcacg tagtcctttt aaaagataat 720 gaaatagtag aaaagagtat taatccagaa aagtatggtt tttcaagagt gaaaaatgaa 780 gaaattagag ggggaattca aaagaaaatg caaagattac gcttgaagta ttga 834 <210> 5 <211> 1194 <212> DNA <213> Tryptophan synthase beta chain II <400> 5 atgaactacg catatccaga tgaaaaagga cattacggta tatacggagg acgatacgtt 60 ccagaaacgt taatgcaatc tgtactagaa ctagaagaag catataaaga agcgatgcaa 120 gatgaggcat ttcaaaagga attaaatcat tatttaaaaa cgtacgtcgg aagagaaaca 180 ccgctttatt tcgctgaaaa tctgacgaag tattgcggag gtgcaaagat ttatttaaaa 240 cgtgaagatt tgaatcatac aggagctcat aaaattaaca atacaatcgg tcaggcacta 300 cttgcagtgc gaatgggcaa gaaaaaagtt gtcgctgaaa caggagctgg acaacacgga 360 gttgcaacag ctactgtatg tgctcttctc ggattagaat gcgtcatttt tatgggagaa 420 gaagatgtaa gacgtcaaaa attaaatgtg ttccgaatgg aattactcgg agcgaaagta 480 gaaagtgtag cggcaggtag tggtacatta aaagatgcgg taaacgaggc gcttcgttac 540 tgggttgcac atgtgcatga tacgcactac attatgggat ctgttctcgg accacatcca 600 ttcccgcaaa ttgtacgtga tttccaaagt gtaattggaa atgaaacgaa aaaacaatat 660 gaggcgttag aaggaaagtt accagaagca gtcgttgctt gtattggagg tggtagtaat 720 gcaatgggga tgttttatcc gttcgtacac gatgaagaag ttgctcttta cggcgtagaa 780 gcagctggaa aaggcgttca tacagaaaag catgcagcaa ctttaacgaa aggaagcgtc 840 ggtgttttac atggatcaat gatgtatctt ctgcaaaacg aagaaggaca aattcaagaa 900 gcacactcta tttcagcagg acttgattat ccaggtgttg gtccagaaca tagcttgcta 960 aaagatattg gccgcgtttc ttatcattcg ataacagacg aagaagcatt agaagcattt 1020 caattattaa cgaaaaaaga aggcattatc ccggcgctag aaagttcaca tgctgtcgca 1080 tatgcattaa aattagctcc gaaaatgaag gaagatgaag gacttgttat ttgtttatct 1140 ggccgtggtg ataaagatgt agagagtata aaacgttata tggaagaggt gtaa 1194 <210> 6 <211> 615 <212> DNA <213> Phosphoribosylanthranilate isomerase <400> 6 atgaaagtaa aaatttgcgg catcactgat gtggaaacag cgaaaagtgc gtgtgaatat 60 ggcgcagatg cactcggatt tgtttttgcg gaaagtaaac ggaaaatcac tccaaagaga 120 gcgaaagaaa tcattcagga gcttccagcc aacgtgttaa aaatcggtgt tttcgtaaat 180 gaatcagtag aagtgatcca gaaaattgca gatgagtgtg ggttaacaca tgtacaacta 240 catggagatg aagataatta tcaaattaga agattgaata ttccgtctat aaaatcacta 300 ggagtaactt cagaaagtga tatgaaaaat gctcaaacat atgaaacgga ttatatattg 360 tttgatagcc cgaaagaaaa gtttcacgga ggaaatggga agaaattttc atgggaacta 420 cttgtgcata tgccagaaga gttgcgagag aaaacgatat tagctggtgg attaaacgct 480 cttaatatag aagaagcgat tcgaactgtt cggccttata tggtcgatgt gagcagcgga 540 gtagagacag aaggaaagaa agatgtagag aaaataaaac aatttattat aaaagcgaag 600 gagtgttcca aatga 615

Claims (6)

  1. 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물의 생장 촉진 효과를 가지는 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주(KCTC 13081BP)로서,
    상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 유전자를 포함하고,
    상기 인삼 뿌리썩음병은 Cylindrocarpon destructans KACC 41077 또는 Rhizoctonia solani KACC 40101에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KNU-07 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진용 미생물 제제로서, 상기 인삼 뿌리썩음병은 Cylindrocarpon destructans KACC 41077 또는 Rhizoctonia solani KACC 40101에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 미생물 제제.
  5. 제4항의 미생물 제제를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진용 미생물 비료로서, 상기 인삼 뿌리썩음병은 Cylindrocarpon destructans KACC 41077 또는 Rhizoctonia solani KACC 40101에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 미생물 비료.
  6. 제4항의 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병 방제 및 식물 생장 촉진 방법으로서, 상기 인삼 뿌리썩음병은 Cylindrocarpon destructans KACC 41077 또는 Rhizoctonia solani KACC 40101에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 방법.
KR1020160115849A 2016-09-08 2016-09-08 인삼 뿌리썩음병원균 방제효과 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 바실러스 써린지엔시스 knu-07 균주, 및 이의 이용 KR101815787B1 (ko)

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