KR102681589B1 - 애시도보락스 씨트룰라이에 길항력을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스 균주 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 애시도보락스 씨트룰라이에 길항력을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스 (Bacillus siamensis) 균주 및 이의 이용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 애시도보락스 씨트룰라이에 길항력을 가지는 신규한 바실러스 시아멘시스 균주 및 이의 이용에 관한 것이다.
Acidovorax citrulli로 인한 과실썩음병을 유발하는 Bacteria Fruit Blotch(BFB)는 그람 음성 박테리아이다. BFB는 육묘기부터 발생해 접목 후 확산되며, 한국을 포함한 모든 수박 생산국가에서 치명적인 피해를 입히는 질병으로 최대 90%의 수율 감소를 가져올 수 있다. 수박 재배 농가들은 노동력 절감 및 효율성을 높이기 위하여 대단위 육묘장에서 단일 품종을 구매하여 사용하고 있는 실정이며, BFB는 한번 발병이 확인되면 즉각 전량 폐기를 하는 상황이기 때문에 대단위 육묘장이나 농가들은 BFB가 발생하면 막대한 손실을 받게 된다.
상기와 같은 식물병의 방제는 통상적으로 유독성 화학물질(농약)에 광범위한 사용에 의존하여 왔다. 이러한 유기합성농약에 의한 방제법은 대상 식물과 그 식물의 생산물뿐만 아니라 토양에도 유동성 화학물질을 처리해야 할 대가 많으므로, 식물 잔류 및 토양잔류 독성 문제를 발생시키며, 이들 중 많은 화합물은 대상 생물 이외의 미생물과 동물에도 독성을 나타내며, 사람에게도 해를 기칠 수 있다고 알려져 있다. 따라서 최근 식물병의 방제 연구중 상당 부분은 환경 친화적인 식물병 방법을 알아내는 것을 목표로 삼고 있으며, 그 중 하나가 식물병원미생물에 길항적인 생물자원을 이용한 생물농약의 개발이다. 길항 미생물이란 다른 종류의 미생물과 함께 배양될 때 그 다른 미생물의 생육을 저지시키는 미생물을 말한다. 길항 미생물은 기생, 포식, 항생 작용 등을 하는 것이 알려져 있다. 예를 들어 한국등록특허 제 10-1260170호에는 “항균활성을 갖는 신균주 슈도모나스 체236 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물”, 또는 한국 등록특허 제 10-1166853호 “식물병 방제용 조성물”등이 있다.
과실썩음병을 일으키는 Acidovorax citrulli을 유독성 화학물질이 아닌 친환경적인 방법으로 방제하는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 본 발명자들은 수박 재배지의 토양 및 식물체로부터 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)에 길항력을 보이는 신규한 균주를 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 수박 재배지의 토양 및 식물체로부터 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)에 길항력을 보이는 신규한 균주를 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다. 이에, 본 발명의 목적은 과실썩음병을 일으키는 Acidovorax citrulli에 길항력을 가지는 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B 균주 (기탁번호 KCTC43347) 및 이를 이용한 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 식물썩음병을 유발하는 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)로 유도되는 식물병에 방제 활성을 갖는, 기탁번호 KCTC43347로 기탁된 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B 균주를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방제용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 균주는 식물의 병원균, 특히 수박에서 썩음병을 일으키는 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)에 대한 길항력이 뛰어나므로 식물병 방제용 조성물 및 방제 방법에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) KW20S-10-9B 및 Acidovorax citrulli의 대치배양을 통하여 길항력을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) KW20S-10-9B의 sequencing을 통한 phylogenetic tree를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) KW20S-10-9B의 sequencing data을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) KW20S-10-9B의 sequencing을 통한 phylogenetic tree를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) KW20S-10-9B의 sequencing data을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 과실썩음병을 일으키는 Acidovorax citrulli을 유독성 화학물질이 아닌 친환경적인 방법으로 방제하는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 본 발명자들은 수박 재배지의 토양 및 식물체로부터 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)에 길항력을 보이는 신규한 균주를 분리 및 동정하였다. 상기 신균주를 사용하여 과실썩음병을 효과적으로 방제할 수 있다.
본 발명은 애시도보락스 씨트룰라이((Acidovorax citrulli)에 길항력을 가지는 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B 균주 (KCTC43347)를 제공할 수 있다.
상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명자들은 상기 수득된 신균한 균주를 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B라 명명하고, 2021년 08월 11일자로 KCTC에 기탁하여 기탁번호 KCTC43347를 부여 받았다.
본 발명의 상기 균주는 수박재배지 토양 및 식물체(잎, 꽃, 뿌리)의 시료로터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 이에 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B 균주의 16s rRNA를 암호화 하고 있는 유전자를 확인하였다 (서열번호 1; 도 3). 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B의 sequencing을 통한 계통수(phylogenetic tree)를 확인한 결과, 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis)인 것을 확인하였다 (도 2).
상기 애시도보락스 씨트룰라이((Acidovorax citrulli)는 식물병을 일으킬 수 있으며, 특히 수박 과일썩음병(bacterial fruit blotch)을 일으킬 수 있다.
본 발명의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B 균주 KCTC43347는 식물병을 방제하는 기능을 가지고, 이에 식물병에 대한 억제 효과가 있다.
본 발명자들은 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B 균주 (KCTC82920) 및 수박 과일 썩음병을 유발하는 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)를 대치 배양하여 길항력을 확인한 결과, 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B 균주가 수박 썩음병을 일으키는 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)를 억제하는 것을 확인하였다 (도 1).
본 발명은 또한 상기 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 식물병 방지용 조성물을 처리함으로써 식물병을 방제하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 식물병은 수박 과일썩음병(bacterial fruit blotch)일 수 있으며, 상기 식물병은 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)에 의 유발될 수 있다.
본 발명의 식물병 방지용 조성물은 수박, 오이, 멜론, 참외 및 호박으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 박과 식물에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 수박일 수 있으나, 상기 식물의 종류에 제한되지 않고 사용이 가능하다.
본 발명에서 배양물은 균주를 배양한 보통 한천배지(또는 영양 한천배지: Nutrient agar)배지, TSA(Tryptic soy agar) 배지, 표준한천배지(Standard Methods Agar; Plate Count Agar), 유당배지(lactose B개소), BGIB 배지 (Brilliant Green Bile B개소), 2배 농도 BGIB 배지, Endo 한천 배지 (Endo Agar) EMB 한천배지(Eosin methylene blue agar), 보통 배지(또는 영양 배지; Nutrient Broth), 데스옥시콜레이트 유당 한천배지(Desoxycholate lactose Agar) 또는 EC 배지(EC Broth)로부터 분리하여 얻은 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물 제제 조성물은 통상적인 방법으로 식물병 방제용으로 제형화할 수 있으며 건조 분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제 조성물은 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
본 발명에서 상기 미생물 제제는, 균주 또는 이의 배양물에 계면활성제, 중량제, 영양제등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린 (kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양, 식물 또는 식물 종자에 처리함으로써 식물병 방제 방법을 제공한다. 이때, 처리방법에는 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있다. 그 사용량은, 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
상기 식물은 수박, 오이, 멜론, 참외 및 호박으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 박과 식물일 수 있으며, 바람직하게는 수박일 수 있으며, 바람직하게는 수박일 수 있으나, 상기 식물의 종류에 제한되지 않고 사용이 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 수박재배지 토양 및 식물체(잎, 꽃, 뿌리) 수집
전국의 주요 수박 재배지의 토양환경으로부터 토양 및 식물체 샘플을 수집하였다. 채집 지역은 강원, 경기, 충남, 충북, 경북, 경남, 전북, 전남 8개 도에서 수집하였으며, 각 지역은 GPS 위치를 기록하였다. 토양 샘플은 수박 근권부의 토양을 Auger를 이용하여 지표로부터 15cm 안쪽의 토양을 수집하였다. 식물체(잎, 꽃, 뿌리)의 경우 토양을 수집하는 농가의 수박 식물체를 같이 수집하였다. 토양은 균일하게 혼합 후 2mm 체로 걸러 균질화하여 200g을 eppendorf tube에 나누어 담았으며, 식물체의 경우 일부를 eppendorf tube에 담아 -80℃ 냉동고에 보존하여 DNA 추출에 사용하였다. 또한, 수집된 식물체 및 토양(3일간 음지에서 풍건) 샘플로부터 미생물을 분리한다.
실시예 2. 수박재배지 토양 및 식물체(잎, 꽃, 뿌리)의 미생물 분리
수박 재배지에서 수집한 토양 및 식물체(잎, 꽃, 뿌리) 내·외부에 서식하는 미생물을 각각 분리하였다. (i) 토양서식 미생물의 경우 근권 토양 시료 1g을 멸균수 9ml에 넣고 15분간 정치한 후, 상등액을 Serial dilution으로 희석하여 TSA, YPD 배지에 30㎕씩 접종 도말 후, 25~28℃에서 3일간 배양하여 배양된 Colony 모양 및 색 등의 형태적 특성에 따라 미생물을 분리하였다. (ii) 식물체 지상부 외부(잎, 꽃)와 뿌리에 서식하는 미생물의 경우 각각의 식물체 조직을 세척하고, 막자사발에서 분쇄 후 TSA, YPD 배지에 30㎕씩 도말하여 형태적으로 다른 세균을 순수 분리하였다. 최종 분리된 미생물들은 20% Glycerol stock을 만들어 -80℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
실시예 3. 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)에 대한 길항미생물 선발
토양에서 분리한 1,074개 종의 세균을 3개의 BFB 균을 대상으로 길항성 검정을 실시하였다. 길항성 검정은 Diffusion method를 이용하여 검정하였다. 선발된 3개의 BFB 균을 Tryptic Soy Agar (TSA) 배지 위에 각각 250㎕씩 분주하여 도말 하였다. BFB 균을 도말한 배지 위에 8㎜ Paper disk 10장을 일정한 간격으로 배치한 후 Paper disk에서 1,071개 세균을 각각 액체 배양하여 30㎕씩 접종하여 28℃에서 배양한 후 클린존을 형성하는 균을 1차 적으로 선발하였다. 각각의 실험은 3반복 수행하였다.
실시예 4. Sequencing을 통한 동정
상기 실시예 3에서 분리한 균주를 동정하기 위해 16S rDNA 염기서열 분석을 하였다. 16S rDNA 염기서열 분석을 위하여 ABI사의 BigDye Terminators v3.1 Kit(by Applied Biosystems,FosterCity, CA, USA)와 Capillary electrophoresis system의 ABI 3730xl Genetic Analyzer를 사용하였으며, 2종의 프라이머 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’), 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3’)를 사용하였다(Reysenbach 등 1992). 16S rDNA sequence는 DNASTAR program(DNASTAR,Inc.,USA)을 이용하여 CLUSTAL W와 CLUSTAL X program (Thompson등1997)로 다중정렬하였으며, 관계된 기준주(type strain)들의 서열은 Genbank로부터 획득하여 BioEditprogram (Hall,1999)을 이용하여 편집하였고 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 검색프로그램을 통해 염기서열의 상동성을 분석하였다. 그 결과 상기 최종 선발한 길항 미생물이 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis; MW922730) KW20S-10-9B 균주임을 확인하였다.
<110> Kangwon University-Industry Cooperation Foundation
<120> Novel Bacillus siamensis against Acidovorax citrulli and use
thereof
<130> 2021-090
<160> 1
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<210> 1
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bacillus siamensis strain KW20S-10-9B 16S ribosomal RNA gene
<400> 1
tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt 60
gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 120
ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ctgaaccgca tggttcagac 180
ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 240
aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300
gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 360
acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct 420
gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag 480
aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540
ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg 600
gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 660
ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 720
ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 780
ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg 840
ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960
gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg 1020
gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1140
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200
cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag 1260
ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1320
ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380
caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttatgg 1440
agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt ctacaaaggg gg 1492
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- 바실러스 시아멘시스 (Bacillus siamensis) KW20S-10-9B 균주 (KCTC43347), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)에 의해 유발되는 수박 과일썩음병(bacterial fruit blotch) 방제용 조성물.
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- 제 5항의 식물병 방제용 조성물을 포함하는, 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)에 의해 유발되는 수박 과일썩음병(bacterial fruit blotch) 방제용 비료.
- 제 5항의 식물병 방제용 조성물을 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 애시도보락스 씨트룰라이(Acidovorax citrulli)에 의해 유발되는 수박 과일썩음병(bacterial fruit blotch)을 방제하는 방법.
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