KR20200107631A - 신규한 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물생장 촉진 활성 또는 항균 활성을 가지는 신규한 슈도모나스 파라풀바 (Pseudomonas parafulva) PpaJBCS1880 균주 및 이를 이용한 식물생장 촉진용 및 식물병해 방제용 미생물 제제 등에 관한 것이다. 상기 PpaJBCS1880 균주는 인산가용화능 및 사이드로포어 생성능을 갖는 것으로 확인되었는바 친환경 비료로써 이용이 가능하고, 식물에 벼알마름병, 벼흰잎마름병, 및 콩불마름병을 유발하는 식물 병원성 세균인 Burkholderia glumae, Xanthomonas oryzae pv. oryzae 및 Xanthomonas axonopodis pv.　glycines에 대해 항균 활성을 갖는 것으로 확인되었는바 친환경 농약으로써도 이용이 가능하다. 따라서 본 발명은 식물생장 촉진과 항균 효과를 동시에 갖는 상기 PpaJBCS1880 균주를 제공함으로써 화학 농약 및 화학 비료를 동시에 대체할 수 있는 친환경적 농법으로써 다양하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신규한 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주 및 이의 이용{Novel Pseudomonas parafulva PpaJBC1880 strain and uses thereof}

본 발명은 신규한 슈도모나스 파라풀바(Pseudomonas parafulva) PpaJBC1880 균주(수탁번호 KACC 92259P) 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 상기 PpaJBC1880 균주의 식물생장 촉진 효과 및 항균효과를 이용하여 화학비료 및 화학농약을 동시에 대체하고, 친환경 농법에 상기 PpaJBC1880 균주의 이용 등에 관한 것이다.

화학 농약의 오남용에 따라 꿀벌의 붕괴와 같은 환경 생태계의 파괴, 잔류독성으로 인한 인축의 건강에 대한 위해, 내성균의 출현 등으로 인한 약제방제 효과의 저하 등과 같은 문제가 지속적으로 발생하고 있어서 작물병의 친환경적인 방제에 대한 요구가 높다. 바이오기반 작물보호제는 화학합성기반의 작물 보호제에 의해 발생하는 문제점을 해소할 수 있는 대안으로 여겨지며, 이에 따라 세계적으로 미생물 또는 천연물질을 이용하여 작물의 병원균을 방제하기 위해 다양한 미생물을 이용하여 많은 생물농약의 연구·개발 중에 있으며, 일부는 시판되어 관련 미생물농약의 시장도 점차 확대되고 있다. 이와 관련하여 국내 공개특허 제2015-0105546호에서는 식물생장을 촉진하는 엔테로박터 루드위지아이 SJR3 균주를 제시한 바 있다.

작물에 발생하는 세균병은 한번 감염되면 방제가 곤란하고, 급격하게 확산하여 많은 피해를 주는 식물병으로 이에 대한 방제방법의 개발이 절실히 요구되고 있다. 한편, 최근 화학 농약에 대한 안전불감, 환경오염, 잔류성 문제 등과 같은 문제점이 화두가 되고 있어 친환경 농법에 대한 연구가 많이 진행 중이며 농업 유용 미생물을 이용한 친환경 농법의 개발 역시 진행 중에 있다. 이로 인하여 화학 농약 및 비료의 시비량에 따라 구분된 친환경 농산물 품질인증제도가 도입되었고, 이 제도를 시행하는 농가에서는 실제적으로 화학 농약 및 비료의 사용을 줄여 친환경적으로 식물을 재배 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 소비자 역시 LOHAS에 대한 관심이 증대 되어 친환경 농산물 인증을 받은 농산물 수요는 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 상기와 같은 시장의 요구와 추세에 따라 식물병해의 방제뿐만 아니라 동식에 작물의 생장을 촉진하는 복합 기능성 친환경 제제의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

보다 구체적으로, 세균벼알마름병균 (Burkholderia glumae)은 종자 전염성 병해로 벼의 육묘 과정중에 발병이 더욱 조장되게 되며, 벼알의 무게 감소, 발아율 감소 등의 피해를 가져온다. 최근, 온난화 및 잦은 강우 등으로 발병이 증가하고 있는 벼알마름병의 방제를 위해서 oxolinic acid를 이용해 종자소독을 하고 있으나, 저항성 균의 출현 및 비표적 미생물에 대한 피해 등으로 인해 대체 방제법의 개발이 요구되고 있으나, 이에 대한 결과는 부족한 실정이다.

또한, 콩불마름병은 우리나라를 비롯하여 세계적으로 콩 재배기간 중에 온난하고 습한 환경에 노출된는 콩 재배지에서 심각한 피해를 주고 있는 병해이다. 우리나라에서는 매년 10-20% 정도의 수량감소를 가져오고 있으며 (Hong et al., 2011), 다른 재배지역에서는 심각한 수량감소를 초래하기도 한다. 불마름병 방제를 위해 사용되는 약제의 방제효율이 일반적으로 낮고, 강한 바람과 강우에 의한 격발적 발생 및 특히 불마름병균 (Xanthomonas axonopodis pv. glycines)의 약제에 대한 감수성의 차이는 이 병의 방제를 어렵게 하고 있다 (Hong et al. 2010). 이러한 이유로 대체 방제방법의 개발이 절실한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 신규한 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주를 분리하여, 상기 균주에서 벼알마름병, 벼흰잎마름병, 및 콩불마름병 에 대한 방제효과와 벼의 생장촉진 효과를 입증하고, 이의 적정 처리방법을 개발하였다. 따라서 본 발명은 온난화와 잦은 기상이변에 의해 포장에서 발생이 점증하고 있는 세균성 병해의 방제뿐만이 아니라 점점 규모화 되고 있는 벼 육묘장에서의 건전한 벼의 육묘 등에 활용하는 등 광범위한 효과를 발휘하는 미생물제로 활용될 수 있을 것이다.

KR 10-2015-0105546

본 발명은 세계적으로 큰 피해를 주고 있으며, 앞으로 온난화와 기상이변으로 인해 더욱 큰 피해가 예상되는 벼알마름병, 벼흰잎마름병, 및 콩불마름병에 대한 천연항균물질을 생산하여 세균병에 특이적으로 방제효과를 나타냄과 동시에, 벼 등의 생육을 촉진하는 미생물을 분리/동정하여 화학 농약 및 비료를 동시에 대체할 수 있는 친환경 미생물 제제 및 비료를 제공함으로써 농업 현장에 활용할 수 있도록 함을 목적으로 한다.

본 발명자들은 전북 부안지역에서 채집한 벼알에서 분리한 미생물의 genomic DNA(gDNA)를 분석하여 식물병원균에 대한 방제효과가 우수한 슈도모나스 속 Pseudomonas sp.) 미생물을 분리하였고, 상기 미생물의 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과 Pseudomonas parafulva ICMP17674과 99% 이상의 상동성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 슈도모나스 파라풀바 (Pseudomonas parafulva) PpaJBCS1880 균주로 명명하고, 2019년 1월 24일자로 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 기탁하여 수탁번호 KACC 92259P를 부여 받았다.

이에, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 식물생장 촉진 및/또는 항균 효과를 갖는 슈도모나스 파라풀바 (Pseudomonas parafulva) PpaJBCS1880 균주(수탁번호 KACC 92259P)를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함할 수 있다.

한편, 미생물에 의해 합성되고 분비되는 사이드로포어(siderophore)는 토양 내의 미네랄 중에서도 식물에 부족하기 쉬운 미량원소인 철(Fe)과 결합하여 식물의 뿌리로 흡수되어 식물의 생장에 이용될 수 있도록 한다. 철은 식물체 내에서 효소 반응, 산소 물질대사 (oxygen metabolism), 전자전달계, 및 DNA와 RNA 합성을 촉진시키는 역할을 수행하는 것으로, 식물체 내로 사이드로포어에 의한 철의 흡수는 식물의 생육에 중요한 역할을 한다.

또한, 인산은 인지질 및 핵산의 중요한 구성성분이기 때문에 질소와 함께 식물의 생장 및 생육에 필수적인 영양소 중 하나이다. 그러나 토양 내 인산은 주로 난용성 인산으로 식물의 이용효율이 낮아 주로 비료 형태로 식물체에 인산을 제공하고 있으나 부영양화 등 환경적 문제가 발생한다는 단점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 벼알에서 분리/동정한 상기 PpaJBCS1880 균주에서 인산가용화능 및 사이드로포어 생성능을 가지고 있음을 실험적으로 확인하였으며, 본 발명의 신규한 균주가 식물의 생장·생육에 도움을 줄 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 다른 구현예로서, 상기 식물생장 촉진 효과는 상기 균주의 인산가용화능 및/또는 사이드로포어 생성능에 의해 달성되는 것일 수 있다.

세균성 벼 알마름병은 1955년 일본에서 처음으로 발생이 확인되어, 일본뿐만아니라 대한민국을 포함한 대만, 태국 등 아시아 지역과 남미지역에서 발명이 보고되고 있는 식물병으로 그 원인균은 Burkholderia glumae로 알려져있다. 주로 벼알에 발생하고 그 배의 발육이 정지되고 쭉정이가 되는 등 수확량 및 품질 등의 감소를 야기한다.

또한, 벼흰잎마름병은 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 에 의해 발생하는 세균성 도관병으로, 세계적으로 광범위하게 발생하며, 특히 동아시아에서 피해가 매우 심각하다. 통상 출수기 전후에 발병하며, 드믈게는 묘판에서도 발병된다. 주로 하엽의 침윤상의 병반이 나타나며 표면에 마른점괴가 형성되어 수 일이 경과되면 급속하게 잎이 말라 죽는 병상을 나타낸다.

또한, 콩 불마름병은　Xanthomonas axonopodis　pv.　glycines에 의해 발병하며 종자 수, 백립중을 감소시켜 수확량의 감소를 일으키거나, 종실 주요 영양성분인 단백질 함량을 낮추는 것으로 보고되었다. 콩 불마름병을 일으키는 병원균은 종자, 이병식물체의 조직에서 월동하며 유묘의 초생엽에서 1차로 발생, 잎을 따라 위쪽으로 확산된다. 특히 고온 다습한 환경조건에서 최대로 발병되며 날씨가 더워져도 병의 진전이 정지되지 않는 고온성 특성을 가지고 있다. 콩 불마름병은 병원성이 강해 전 세계적으로 분포하고 있으며, 우리나라에서는 1970년대 보고된 이후 근래 전국적으로 확산되고 있는 추세이다.

한편, 본 발명자들은 벼알에서 분리/동정한 상기 PpaJBCS1880 균주가 벼알마름병균 (Burkholderia glumae), 벼흰잎마름병균 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 및 콩 불마름병균 (Xanthomonas axonopodis pv.　glycines)의 생장을 저해함을 실험적으로 확인하였다.

통상적으로 Pseudomonas속의 세균은 토양에 광범위하게 생존하며, 식물생육촉진효과 및 항진균력이 있는 경우가 많아 식물에 유익한 활용을 위해 많은 연구가 진행된바 있다. 그러나, 식물생육촉진효과와 항세균력을 보이는 균주는 흔하지 않고, 항세균력을 보이는 균주들도 항균물질에 따라 다양한 항균 스펙트럼을 보인다. 본 발명의 PpaJBCS1880 균주가 지금까지 보고된 바가 없는 전혀 새로운 구조 (C₁₀OH L-Leu - D-Ser - D-aThr - D-Val - L-Leu D-Ser - L-Leu - D-Ser - L-Ile)의 리포펩타이드(lipopeptide)를 생산하는 것으로 분석되었으며, 기존에 보고된 리포펩타이드와 달리 다양한 그람 음성 (Gram -)균에 항균력을 보유하고 있는 것으로 확인되었고, 세균병 방제효과를 실증하였다.

따라서, 본 발명의 또 다른 구현예로서, PpaJBCS1880 균주가 갖는 항균 효과는 벼알마름병균 (Burkholderia glumae), 벼흰잎마름병균 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 및 콩 불마름병균 (Xanthomonas axonopodis pv.　glycines)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병균에 대한 항균력일 수 있다.

한편, 식물은 외부 병원균 및/또는 바이러스에 대항하여 독자적인 방어체계를 가지고 있으며, 그 중에서 살리실산(salicylic acid: SA)은 저항성과 관련된 호르몬인데, 본 발명자들은 상기 PpaJBCS1880 균주에서 살리실산 생산능력을 확인하였는바, 상기 균주가 가지고 있는 항균 효과는 PpaJBCS1880 균주의 병원균의 생장 저하에 따른 항균력 외에도 균주가 생성하는 살리실산에 의해 식물 자체의 면역력 상승을 통해 달성되는 것일 수도 있다.

따라서, 본원발명에서 '항균'은 세균의 생장 억제에 의한 발병의 감소와 전염의 억제 등의 방제효과와 함께 식물 자체의 면역력 상승을 통한 식물병의 발병 자체를 예방하는 의미를 포함한다.

상기에 따라, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식물생장 촉진 및/또는 식물병해 방제용 미생물 제제를 제공할 수 있는 것이고, 상기 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물생장 촉진 및/또는 식물병해 방제 방법을 제공할 수 있는 것이다.

상기 미생물 제제는 그 사용 목적에 부합하게 미생물 농약 및/또는 비료의 유효성분으로 포함될 수 있으며, 상기 미생물 제제가 상기 균주를 포함하는 경우 PpaJBCS1880 균주는 10⁷ 내지 10⁸ CFU/ml의 농도로 포함되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 미생물 제제에 포함될 수 있는 상기 균주의 배양물은 균주를 배양한 LB (Luria Bertini) 배지 또는 TS (Trypic Soyt) 배지로부터 분리하여 얻은 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 미생물 제제는 통상적인 방법으로 식물생장 촉진용 또는 항균용으로 제형화할 수 있으며 건조분말 형태 또는 액상형태로 제조할 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제 조성물은 액상으로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 상기 미생물 제제는 균주 또는 이의 배양물에 첨가제, 증량제, 영양제 등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 첨가제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100, 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있고, 증량제 및 영양제로는 skim milk(배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트(bentonite), 덱스트린, 포도당, 전분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 상기 미생물 제제는 토양 또는 식물에 처리함으로써 식물의 생장을 촉진하고 병원균의 생육을 억제하는 방법을 제공한다. 이때, 처리방법에는 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지 등에 의해 행할 수 있으며, 그 사용량은 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

상기 방법에 따라 처리되는 미생물 제제에 함유된 미생물의 유효량은 경작지 면적(㎡) 당 1 내지 1×10¹⁰⁰의 미생물 수로 포함될 수 있다. 또한, 상기 방법 중 살포에 의해 처리되는 미생물 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10¹⁰⁰의 미생물 농도로 포함될 수 있으며, 침지에 의해 처리되는 미생물 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10¹⁰⁰의 미생물 농도로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주는 인산 가용화능 및 사이드로포어 생성능을 갖는 것으로 확인되었는바, 식물생장 촉진을 위한 친환경 비료로써 이용이 가능하다.

또한, 상기 PpaJBCS1880 균주는 벼 생산에 심각한 피해를 주고 있는 벼알마름병 및 벼흰잎마름병의 원인균인 Burkholderia glumae 및 Xanthomonas oryzae pv. oryzae과 콩 불마름병의 원인균인 Xanthomonas axonopodis pv.　glycines의 생장을 저해할 뿐만 아니라 식물 자체의 세균 저항성을 상승시키는 효과가 있는 것으로 확인되었는바, 친환경 농약으로써 이용이 가능하다.

아울러, 본 발명은 상기 PpaJBCS1880 균주의 항균활성에 관여하는 유전자 서열을 밝힘으로써 이를 친환경 농법에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 16S rDNA를 사용한 계통발생학적인 분석결과를 나타낸다.
도 2는 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 서로 다른 농도로 세균벼알마름병을 방제하는 효과를 나타낸다.
도 3 및 4는 본 벼의 발아와 유묘의 생장을 촉진하는 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 효과를 나타낸다.
도 5 및 6은 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주로 벼의 유묘기에 세균벼알마름병의 방제 및 생육촉진 효과를 나타낸다.
도 7은 벼의 생장 (발아, 초장 및 생체중)에 대한 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 영향을 나타낸다.
도 8은 식물 병원균의 생장에 대한 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 항균력의 범위와 특성을 나타낸다. (A) 벼알마름병균 (B. glumae), (B) 콩불마름병균 (X. a. pv. glycines), (C) 잿빛곰팡이병균 (B. cinerea), (D) 깨씨무늬병균 (B. oryzae), (E) 탄저병균 (C. acutatum), (F) 시들병균 (F. oxysporum), (G) 붉은곰팡이병균 (F. graminearum), (H) 키다리병균 (F. moniliforme)
도 9는 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 (A) Siderophore 생성, (B) 인산의 가용화 능력, (C) Protease 활성을 나타낸다.
도 10은 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주에 의한 살리실산의 생성을 나타낸다.
도 11은 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주로부터 얻은 조추출액의 길항력을 나타낸다.
도 12는 따른 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 상등액으로부터 얻은 에틸아세테이트 층의 길항력을 나타낸다.
도 13은 PpaJBCS1880 균주의 항생물질 (펩타이드) 생산에 관여하는 유전자 클러스터 및 생산된 아미노산을 나타내는 것으로, 신규한 펩타이드는 C₁₀OH L-Leu - D-Ser - D-aThr - D-Val - L-Leu D-Ser - L-Leu - D-Ser - L-Ile으로 본 균주에서 최초로 분석된 것이다.
도 14 내지 16은 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 항균력 변화와 콩 불마름병의 방제 효과와의 연관성을 나타낸다.
도 17 및 18은 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 swarming 운동성과 siderophore 생산성이 불마름병의 방제에 미치는 영향을 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예: Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880 균주의 선발 및 동정

(1) 근권미생물의 분리 및 동정

벼 포장에서 근권 토양 또는 벼알을 채취하여 토양 샘플 (5g) 또는 벼알 (1g)을 10배액의 멸균 증류수에 넣고, 180 rpm, 28℃에서 10분간 진탕배양한 후 현탁액을 0.1 mL씩 10진 희석하여 trypic soy agar (TSA)에 도말한 후 24시간 동안 28℃에서 배양하였다. 이 후 자라난 콜로니를 새로운 TSA배지에 배양한 후 20% glycerol이 함유된 LB배지에 넣어 -70℃에 보관하면서 필요에 따라 실험에 사용하였다.

분리한 미생물을 Luria-Bertani (LB)배지에 30℃, 24시간 동안 배양 후 Genomic DNA Prep Kit (Solgent Co. Ltd, Korea)를 이용하여 gDNA를 추출하였으며, 27F (5‘-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)와 1492R (5‘-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) 프라이머를 사용하여 선발 미생물의 16S rDNA 염기서열을 분석 한 후 BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용하여 미생물을 동정하였다.

그 결과 방제효과가 우수하여 선발한 PpaJBCS1880균주는 전북 부안지역에서 채집한 벼알에서 분리되었고 그람 음성균이었으며 (표 1), 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 Pseudomonas 속으로 동정되었다. 한편, 16S rDNA 염기서열로 유연관계를 알아보기 위하여 MEGA5 프로그램을 이용하여 neighbor-joining method로 비교한 결과 Pseudomonas parafulva ICMP17674 (NCBI accession number FJ643465.1)과 유연관계가 높은 것으로 확인되었다 (도 1).

Isolate name	Region	Origin	Gram reaction
PpaJBCS1880	Buan, Jeonbuk	Rice, seeds	-

또한, 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 전체 염기서열을 PacBio 기술과 Illumina sequencing platform을 이용해 해독하였다. PacBio platform을 통해 1,040,368,487 bp의 염기서열이 생산되었는데, 에러 수정 단계를 거쳐 11,167 bp의 평균 길이로 93,159 reads를 읽었으며, 이는 게놈의 약 157배의 coverage 수준이었다. 이를 다시 de novo assembly 하여 SMRT analysis pipeline으로 환형화하고, Pilon으로 교정하여 5,208,480 bp의 단일 contig를 얻었으며, 이때의 N50 값도 5,208,480 bp이었다 (표 2). 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주의 전체 염기에서 GC 함량비율은 63.4%였고, 4,487개의 coding sequences (CDSs)가 존재하였다. rRNA 또는 tRNA를 합성하는 유전자가 각각 20개 및 74개 확인되었다. 한편, 염기서열은 NCBI GenBank (Acc. No. CP031641.1)에 등록하였다.

Features	Genome (Chromosome)
Genome size (bp)	5,208,480
GC ratio %	63.4
Gene (coding)	4,641
CDS (coding)	4,487
Coding %	98.74
Average CDS length (nt)	1146
No. of rRNA genes	20
No. of tRNA genes	74
Number of genes with assigned function	4,487

실험예 1: Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880 농도에 따른 세균벼알마름병 방제 효과

(1) 세균벼알마름병균 접종을 통한 이병종자의 준비

벼 종자 (cv. 새누리)를 국립식량과학원 벼맥류부에서 분양을 받아 본 실험에 사용하였다. 먼저, 병든 종자를 만들기 위하여 Fang 등 (2009)의 방법을 약간 변경하여 사용하였는데, 건전한 종자만을 골라 2% sodium hypochlorite를 이용해 2분 동안 표면소독한 후 증류수로 세척하였다. 한편, 세균벼알마름병균 (B. glumae)은 TSB배지에서 180 rpm, 28℃에서 24시간동안 진탕 배양 후 1×10⁸ CFU/mL로 농도를 조절한 다음, carboxymethyl cellulose (CMC)를 0.2%가 되도록 첨가하였다. 여기에 표면소독한 종자를 넣고 (10 g / 100 ml), 25℃, 100 rpm에서 12시간동안 세균벼알마름병균을 접종한 후 상온에서 건조 (12 hr)하여 이병종자로 사용하였다.

(2) Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880 균주의 배양 및 종자처리

Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880 균주를 TSA에 접종하고 28℃에서 24시간동안 배양하여 자란 세포를 이용해 필요한 농도로 조절하여 사용하였다. 위에서 세균벼알마름병균을 접종하여 얻은 이병종자를 PpaJBCS1880현탁액 (0.2%가 되도록 CMC를 첨가)에 넣어 (10 g / 100 ml) 25℃, 100 rpm에서 1시간동안 배양하여 이병종자의 표면에 PpaJBCS1880균이 잘 부착될 수 있도록 처리한 후 1시간동안 상온에서 건조 후 방제효과 등의 검정에 사용하였다.

(3) 처리 농도에 따른 세균벼알마름병 방제 및 생육촉진효과 (roll towel 이용 검정)

PpaJBCS1880균주의 처리 농도별 세균벼알마름병의 방제에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세균벼알름병균을 처리하여 얻은 이병종자에 PpaJBCS1880균주를 1×10⁶, 10⁷, 10⁸ CFU/ml 농도 조절한 후 위에서와 같은 방법으로 처리하였다. 이와같이 농도별로 처리한 종자를 표준 roll towel 검정 방법에 따라 치상하고 (ISTA, 2003), 비닐 팩에 넣은 후 30 ㎖의 증류수를 첨가하여 충분한 수분이 유지되도록 한 다음 30℃ (light/dark, 16/8 hr) 조건에서 배양하였다. 발병율은 파종 14일 후 0 = 무발병, 1 = 연노랑잎, 2 = 심한 황화 및 위축, 3 = 발아후 고사한 유묘, 4 = 발아하지 못한 종자로 구분하여 조사한 후 다음과 같은 식을 이용하여 산출하였다; 발병지수 =(0n₀ + 1n₁ + 3n₂ + 5n₃ + 7n₄)/7N × 100. 이 식에서 n_0-4는 각각의 발병정도 (0~4) 를 보이는 잎의 수를 나타내고, N은 조사한 총유묘의 수를 나타낸다. 한편, 균을 첨가하지 않고 CMC만을 넣은 증류수에 처리한 종자를 대조구로 사용하였다.

PpaJBCS1880균을 10⁷ 또는 10⁸ CFU/ml의 농도로 처리하였을 경우 무처리에 비해 각각 11.1%, 25% 정도의 발아율이 증가하였고, 발병지수는 각각 24.9%, 54.6% 감소하였다 (도 2). 한편, 고농도에서는 발아율이 약간 저해를 받는 경향을 보여, 적절한 농도의 처리도 중요한 것으로 판단된다.

벼의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 소독한 건전 종자에 서로 다른 농도의 PpaJBCS1880균주를 앞에서와 같은 방법으로 접종한 다음 roll paper에 파종하여 배양하면서 배양 3일 후 발아율을 조사하고, 14일 후에 줄기와 뿌리의 길이를 측정하였다. 식물생장촉진 정도는 활력지수 (vigor index)를 이용하여 계산식, 활력지수=[(줄기의 평균 길이 + 뿌리의 평균길이) × 발아율 (%)]로 산출하였다 (Abdul-Baki and Anderson, 1973). 각 실험은 10개의 종자를 이용하여 3반복으로 처리하였으며, 각 실험은 3반복하였다.

PpaJBCS1880 균주의 농도별 생육촉진효과를 조사한 결과 무처리에 비해 10⁸ CFU/ml에서 뿌리와 줄기의 길이는 무처리에 비해 각각 21.2%, 44.5% 증가하였는데, 10⁷ 및 10⁸ CFU/ml의 농도에서 생체중은 각각 12.5% 및 48.0% 증가하였다. 발아율, 뿌리 및 줄기의 신장을 반영한 활력지수는 10⁷ 및 10⁸ CFU/ml의 농도에서 각각 6.8% 및 95.1%가 증가하였다 (도 3 및 도 4).

위에서와 같이 paper towel을 이용한 세균벼알마름병 방제 및 생육촉진효과 검정에서 10⁸ CFU/ml이 최적농도인 것으로 판단되어 이 농도를 기준으로 온실 (폿트) 실험을 진행하였다.

실험예 2: Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880 균주를 이용한 세균벼알마름병 방제 및 생육촉진효과

(1) 온실(폿트)에서의 세균벼알마름병 방제 및 생육촉진효과

효과가 우수하였던 PpaJBCS1880의 농도 (1 × 10⁸ CFU/ml)로 앞에서와 같이 코팅 처리한 종자를 벼 육묘용 상토 (Pungnong, Korea)를 담은 폿트에 파종하였다. 각각의 폿트는 식물 배양룸 (light/dark, 16/8 hr, 25℃)에서 재배하면서, 매일 동일량의 물을 공급하였다. 균을 처리하지 않고 CMC만을 넣은 증류수에 처리한 종자를 무처리 대조구로 사용하였고, benomyl을 처리한 종자를 화학제 대조구로 사용하였다. 파종 14일 후 0 = 무발병, 1 = 연노랑잎, 2 = 심한 황화 및 위축, 3 = 발아후 고사한 유묘, 4 = 발아하지 못한 종자로 구분하여 조사한 후 발병지수로 산출하였다. 처리당 100개의 종자 (50 종자/폿트)를 이용해 2처리로 하여, 3반복으로 실험하였다. 한편, 생육촉진여부는 병원균을 접종하지 않은 종자에 JBLS1880균주를 위와 같이 처리한 다음 파종 30일 후에 뿌리 및 줄기의 길이, 생체중을 조사하고, 활력지수를 계산하였다.

그 결과 무처리와 베노밀을 처리한 구에서의 발병지수는 각각 45.2와 30.4인데 비해, PpaJBCS1880균주를 처리하였을 경우의 발병지수는 25.9로 조사되어, 무처리 및 베노밀 처리구에 비해 42.7% 및 14.8% 정도의 세균벼알마름병 감소효과를 확인할 수 있었다 (도 5 및 6), 이상의 결과로 볼 때 PpaJBCS1880 균주는 베노밀·티람 수화제 보다 세균벼알마름병에 대한 방제효과가 우수한 것으로 판단되어 화학농약을 대체할 수 있는 친환경적인 방제수단으로의 활용이 가능할 것으로 생각된다.

한편, PpaJBCS1880 균주를 1×10⁸ CFU/ml농도로 처리하였을 경우 무처리와 베노밀 처리에 비해 초장은 각각 17.4%, 10.0%, 뿌리의 길이는 67.0%, 14.8% 증가하여 활력지수는 각각 211.4%, 6.9% 증가하였으며, 생체중은 각각 49.6%와 1.2% 증가하였다 (도 7). 한편, 분얼수의 증가에도 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보이는데, 이상의 결과는 PpaJBCS1880균주의 처리로 화학농약인 베노밀·티람 처리보다 우수한 세균병의 방제효과뿐만이 아니라 생육촉진효과도 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

실험예 3: Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880의 세균벼알마름병균 및 콩 불마름병균 억제 기작 연구

(1) 벼의 주요 세균 및 진균 병원균에 대한 항균력 검정

PpaJBCS1880 균주의 세균벼알마름병균 (B. glumae)과 흰잎마름병균 (X. o. pv. oryzae) 등에 대한 항균력은 중층접종방법 (dual inoculation technique)을 이용하여 조사하였다. 멸균한 LB 한천배지를 식힌 후 굳기 전에 세균벼알마름병균, 흰잎마름병균 등의 세균 세포를 1×10⁷ CFU/mL 농도로 섞은 후 plate에 분주하였다. 여기에 paper disk를 올려놓고, 그 위에 PpaJBCS1880균주를 접종한 다음 28℃에서 배양하면서 2일 후에 저지원 (inhibition zone)의 크기를 측정하였다.

PpaJBCS1880 균주의 진균성 병원균에 대한 길항력은 대치배양을 통해 검정하였다. 먼저 PDA배지에 7-10일간 배양한 진균성 병원균을 코르크 보러 (8 mm)로 배지와 함께 균사를 떼어내어 PDA 배지의 중앙에 치상한 후 3.5 cm 거리를 두고 배지위에 놀려놓은 paper disk (8 mm)에 PpaJBCS1880 (1×10⁸ CFU/ml)를 10 ul씩 접종하였다. 이를 25℃에서 7-10일간 배양한 후 계산식, RI = (D₀ - D_a)/D₀ × 100 (RI; 상대적 균사 신장 저지정도, D₀; 길항균을 접종하지 않은 배지에서의 균사신장, D_a; 길항균을 접종한 배지에서의 균사신장)으로 균사신장 저지 정도를 측정하였다. 각 실험은 3반복으로 실시하였다.

그 결과 PpaJBCS1880 균주는 세균벼알마름병균 (B. glumae), 흰잎마름병균 (X. o. pv. oryzae)에 대하여 항균력을 보였다. 이는 벼에서 가장 크게 문제시되고 있는 세균병해인 세균벼알마름병과 흰잎마름병에 대한 방제효과를 나타낼 수 있음을 시사하였다. 반면, 깨씨무늬병균 (Bipolaris oryzae), 키다리병균 (Fusarium moniliforme), 도열병균 (Pyricularia grisea), 잎집무늬마름병균 (Rhizoctonia solani) 등의 진균성 곰팡이병균에 대해서는 길항력을 보이지 않았다 (표 3, 도 8). 한편, 이외에도 콩 반점병균 (Pseudomonas cichorii) 및 불마름병균 (Xanthomonas axnopodis pv. glycines)에 대해서도 항균력이 있는 것으로 확인되어, 세균성 병원균에 대해서만 높은 항균력을 보이는 것으로 조사되었다.

Plant pathogenic bacteria and fungi	Inhibition of growth (mm)
Burkholderia glumae (Bacterial grain rot)	22.0
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Bacterial leaf blight)	18.0
Pseudomonas cichorii (Soybean bacterial leaf spot)	15.0
Xanthomonas axnopodis pv. glycines (Soybean bacterial pustule)	20.0
Bipolaris oryzae (Brown spot)	0.0
Fusarium moniliforme (Bakanae disease)	0.0
Fusarium graminearum (Fusarium blight)	0.0
Pyricularia grisea (Blast)	0.0
Rhizoctonia solani (Sheath blight)	0.0

(2) 인산가용화여부, siderophore 및 HCN 생산 검정인산가용화능 조사는 PpaJBCS1880 균주를 LB 한천배지에서 30℃, 24시간 배양 후 PVK 한천배지 [Glucose 1%, (NH₄)₂SO₄ 0.05%, NaCl 0.02%, KCl 0.02%, MgSO₄·7H₂O 0.01%, MnSO₄·7H₂O 0.05%, FeSO₄·7H₂O 0.05%, yeast extract 0.05%, Ca₃(PO₄)₂ 0.5%, agar 15%]에 도말하여 30℃에서 5일간 배양한 후 clear zone의 형성 유·무로 인산가용화 여부를 확인하였다.

선발한 근권미생물이 siderophore를 생성하는지는 CAS (chrome azurol S)배지 [60.5mg CAS를 50ml 증류수에 녹인 다음 10 mM HCI 용액에 용해된 10 ml의 1mM FeCI₃·6H₂O을 넣고 저으면서, 따로 40ml 증류수에 72.0 mg HDTMA (Hexadecyltrimethyl-ammoiumbromide)을 녹인 용액을 함께 첨가하여 멸균한 후 750ml 증류수, 100ml의 10× MM9 salts (60g/L Na₂HPO₄, 0.009g/L KH₂PO₄, 5g/L NaCl), 15g agar, 30.24g pipes, 12ml의 50% NaOH, 30ml의 10% casamino acids 용액, 10ml의 20% glucose, 1ml의 0.2% thiamine·HCl 등을 혼합해 멸균하여 50℃로 식힌 후, 앞서 혼합한 용액을 거품이 나지 않도록 서서히 혼합하여 조제]를 이용하여 조사였다. 먼저, PpaJBCS1880 균주를 CAS 한천배지에 접종하여 30℃에서 3일간 배양한 후 orange halo zone의 형성 여부로 siderophore 생성 유무 확인하였다.

HCN의 생산여부는 Miller and Higgins (1970)의 방법에 따라 실시하였는데, 48시간동안 배양한 균주를 glycine (4.4 g/L)이 첨가된 LB배지에 획선 배양 후 2% sodium carbonate에 0.5% (w/v) picric acid를 첨가한 용액에 filter paper를 적신 후 plate의 뚜껑에 처리하였다. 28℃에서 배양 후 색의 변화를 관찰하였다.

그 결과 PpaJBCS1880균주는 CAS배지에서 orange halo zone을 형성하여 siderophore를 생성하는 것으로 확인되었으며, 인산의 가용화 능력은 있으나, HCN은 생성하지 않는 것으로 조사되었다 (표 4, 도 9). 이상의 결과로 볼 때 siderophore 생산 및 인산염의 가용화에 의한 영양원 공급이 유묘의 생육을 촉진에 기여하였던 것으로 생각된다.

Mechanism	Production
Siderophore production	+
Phosphate solubilization	(+)
HCN production	-
IAA production	-
Salicylic acid	+
Protease production	+

(3) 식물호몬 IAA 및 salicylic acid 생산 검정

예비 배양한 PpaJBCS1880균을 LB 액체배지 (10 mL)에 2% (v/v) 정도가 되도록 접종한 후 25℃, 180 rpm에서 24시간 배양 후 OD값으로 생육 및 IAA 생성정도를 측정하였다. 생육정도는 OD600, IAA 생산정도는 OD535nm에서 측정하였는데, IAA 생성정도는 각 농도별로 배양한 배양액을 1 ml씩 14000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거한 후 상등액만을 회수 후 상등액과 Salkowski's reagent를 1:4의 비율로 섞은 후 상온에서 20분간 반응 후 535nm에서 흡광도 측정하였다.

Salicylic acid의 생성정도를 조사하기 위해 PpaJBCS1880균주를 casamino acid 액체배지에 24시간 (200 rpm, 28℃, 암) 배양하였다. 이렇게 배양한 100 ul를 25 ml의 새로운 casamino acid 배지에 옮긴 후 동일한 조건에서 36시간 동안 배양하였다. 이를 4000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 얻은 상등액을 ethyl acetate로 추출하였다. 이를 진공상태에서 1/3로 농축한 후 1ml당 5 ul의 2M FeCl₃와 3 ml의 증류수를 첨가한 후 자색 (purple iron-SA complex)으로 변화하는 정도를 527nm의 흡광도로 측정한 후 표준곡선과 비교하였다.

식물의 생장 촉진과 관련된 대표적 auxin인 indole acetic acid (IAA)는 생성하지 않았으나 (data not shown), 저항성과 관련된 호르몬인 salicylic acid는 배양 24시간후 생성되는 것이 확인되었고, 48시간후에는 24시간에 비해 6배이상으로 포화되었다 (표 4, 도 10). 이상의 결과는 항균물질에 의한 직접적인 살균효과이외에도 유묘의 저항성을 증진에 기여하였을 가능성을 시사한다.

(4) Protease 생산 검정

Protease 생산여부는 2% casein을 첨가한 skim milk 한천배지 위에 올려놓은 paper disk에 세균현탁액 (10 μl)를 접종한 후 28℃에서 72시간동안 배양한 후 투명대 (clearing zone)의 형성여부로 생산여부를 확인하였는데, 이는 3반복으로 실험하였다.

그 결과 PpaJBCS1880균주는 casein을 첨가한 배지에서 투명대를 형성하여 protease 활성이 있는 것으로 조사되었는데 (표 4, 도 11), 이는 세균성 병원균에 대한 길항력 발현에 유리하게 영향을 주었을 것으로 생각된다.

(5) PpaJBCS1880 상등액의 항균력 및 protease activity

PpaJBCS1880균주를 배양한 후 상등액만을 취하여 항균력의 발현 여부를 측정하였다. 먼저, 균을 TSB배지에 접종하여 28℃, 180rpm에서 48시간동안 배양한 후 이를 10배량의 새로운 배지에 옮기고 48시간 동안 더 배양하였다. 이 배양액을 13,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 균체를 제거한 후 0.22 um filter paper를 통해 필터링한 후 배양 상등액 (cell free supernatant; CFS)을 얻었다. 이 상등액을 위에서와 같은 방법으로 paper disk에 50 ul을 첨가한 후 길항력을 조사하였다. 한편, 배양 상등액에 ammonium sulphate를 60%가 되도록 첨가한 후 4℃에 밤새 방치한 후 이를 6,000g에서 15분간 원심분리한 다음 100 mM Tris-HCl buffer (pH8.0)를 첨가하여 조추출액 (crude purified compound)을 얻었다.

그 결과 PpaJBCS1880 균주를 배양후 얻은 상등액은 세균벼알마름병균에 대해서 길항력을 보이지 않았으나, 조추출액을 이용할 경우에는 길항력이 있음을 확인하였고, protease 활성도 나타내었다. 이는 PpaJBCS1880균주가 항균물질 또는 protease를 세포외로 분비한다는 것을 의미하고, 이들은 세균병 방제제 개발을 위한 선구물질로의 이용 가능성도 있다 (도 12).

(6) PpaJBCS1880 항균력을 나타내는 유전자 클러스터

PpaJBCS1880균주의 항균물질인 viscosin 유사 리포펩타이드를 코딩하는 것으로 동정된 NRPS 시스템내의 유전자들의 cluster를 MIBiG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster) tool을 이용해 분석하였다 (Medema et al. 2015). 이에 더하여 viscosin 유사 리포펩타이드 NRPS내의 domain은 web 기반 프로그램인 PRISM 3 (Prediction informatics for secondary metabolomes)을 이용해 분석하였다 (Skinnider et al., 2017). 이 분석은 NP.searcher 와 antiSMASH를 통해 재확인하였다. 상동성 유전자와 단백질은 BLAST tools (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용해 동정하였으며, viscosin 유사 리포펩타이드 A, B 및 C의 아미노산 서열간의 다중 시퀀스 비교는 CLC genomic workbench (CLC Bio, Qiagen)를 이용해 실시하였다.

그 결과 항균력 변화 검정 및 유전체 분석을 통해 NRP를 생산하는 유전자 cluster를 두 군데에서 찾아볼 수 있었는데, MIBiG를 이용해 P. parafulva CRS01-1 P. putida NX_1 및 P. entomophila L48와 비교하였다. 본 실험에 사용한 P. parafulva PpaJBCS1880균주의 viscosin 유사 리포펩타이드 A 유전자는 6,354 bp로서 CRS01 (6354 bp), NX-1 (6348 bp) 및 L48 (6339 bp)과 유사하였다. Viscosin 유사 리포펩타이드 B 유전자의 경우 PpaJBCS1880 (12,903 bp), CRS01 (12,903 bp) 및 NX-1 (12,903 bp)에서는 크기다 동일하였고, L48 (25,482 bp)는 약 2배정도로 염기서열이 많았다. Viscosin 유사 리포펩타이드 C 유전자의 경우에도 JBC1880 (11,412 bp), CRS01 (11,412 bp) 및 NX-1 (11,403 bp) 균주에서 유사하였으며, L48 (14,511 bp)는 염기수가 약간 많았다. 한편, luxR 유전자가 viscosin 유사 리포펩타이드 A부위에 존재하며, 전사조절에 관여하는 것을 확인할 수 있었다 (도 13).

Viscosin 유사 리포펩타이드 B NRP 유전자를 PRISM 3를 통해 분석하고, NP.searcher와 antiSMASH 프로그램을 통해 재확인한 결과, viscosin 유사 리포펩타이드 A는 condensation 및 epimerization domain을 각각 1개씩 가지고 있었으며, thiolation domain은 두 개였고, adenylation domain은 leucine이나 serine 특이적인 부착부위를 가지고 있었는데, 이는 다른 Pseudomonas 속과 유사한 경향이었다. Viscosin 유사 리포펩타이드 B는 pimerization 및 thiolation domains이 각각 4개씩 있었으며, adenylation domain은 threonine, valine, leucine 및 serine에 특이적인 부착부위를 가지고 있었고, 이는 NX-1균주와 유사하였다. Viscosin 유사 리포펩타이드 C는 2개의 epimerization domain, 1개의 condensation domain, 3개의 thiolation domain 및 두 개의 two thioesterase가 있었는데, adenylation domain은 leucine, serine 및 isoleucine 특이적이었다 (도 13). 이에 따라 예상되는 리포 펩타이드의 일차 구조는 9개의 아미노산으로 구성된 C₁₀OH L-Leu - D-Ser - D-aThr - D-Val - L-Leu D-Ser - L-Leu - D-Ser - L-Ile이었다.

실험예 4: Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880의 처리에 의한 콩 불마름병의 방제와 이에 대한 항균력과 swarming motility의 영향

(1) Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880균주의 항균력 변화와 콩 불마름병 방제효과

PpaJBCS1880 균주를 이용한 돌연변이 라이브러리는 트랜스포존 T8 (ISlacZ/hah-tc)과 이의 전달 플라스미드를 가진 pIT2 (pLG99)를 이용해 제작하였다 (Jacobs et al., 2003). 그 후 PpaJBCS1880 균주의 세균벼알마름병균 (B. glumae)과 콩불마름병균 (Xanthomonas axnopodis pv. glycines)에 대한 항균력은 중층접종방법 (overlay inoculation technique)을 이용하여 조사하였다. 멸균한 LB 한천배지를 식힌 후 굳기 전에 세균벼알마름병균과 불마름병균을 1×10⁷ CFU/ml 농도로 섞은 후 plate에 분주하였다. 여기에 paper disk (8 mm)를 올려놓고, 그 위에 PpaJBCS1880균주를 접종한 다음 28℃에서 배양하면서 2일 후에 저지원 (inhibition zone)의 크기를 측정하였다. 실험은 3개씩 2반복으로 실시하였다.

한편, 콩 불마름병 방제효과 검정을 위해서 콩 종자 (대광)를 원예용 상토 (Sanglim, Korea)를 담은 폿트 (1 seedling/pot)에 파종한 후 식물생장룸 (light/dark, 16/8 hr, 28^°C)에서 배양하면서, 주기적으로 처리별로 동일량의 수분을 공급하였고, 재배 4-5주 후 방제효과 검정에 사용하였다. P. parafulva PpaJBCS1880균주는 28^°C, 250 rpm에서 배양한 후 4,000 g에서 15분간 원심분리하여 균체만을 획득한 다음 0.05 M phosphate buffer (pH 6.5) 또는 증류수에 필요한 농도로 희석하여 사용하였다. 앞서 재배한 콩 식물체에서 채취한 잎에 배양한 PpaJBCS1880 돌연변이 균주를 1×10⁷ CFU/ml가 되도록 조절한 후 분무하여 접종하였다. 이후 약 1시간 후에 병원균 X. a. pv. glycines를 5×10⁷ CFU/ml농도가 되도록 조절한 후 여기에 분무처리하였다. 페트리디쉬에 증류수를 적신 여과지를 깔고 균을 처리한 잎을 올려 놓은 다음 페트리디시를 16/8hr (light/dark)의 광조건, 25^°C, 95% RH에 보관하면서, 처리 5-7일 후에 발병면적을 조사하였다. 발병률은 계산식: [∑(엽수X₁×1 + X₂×3 + X₃×5 + X₄×7 + X₅×9)/조사한 총엽수]×100으로 산출하였고, 본 식에서 X₀=무병징, X₁= 5% 병발생 면적 (Infected Leaf Area; ILA); X₂=6-10% ILA, X₃=11-25% ILA, X₄=26-50% ILA, X₅=51-100% ILA였다.

제작한 총 7,392개의 돌연변이 개체중 야생형과 다른 항균력을 보이는 32개의 균주를 선발하였다. 이들 균주는 앞에서 말하였듯이 항균력이 81%이상 심하게 저하된 균은 7 (21.9%)균주이었으며, 80%~51%이상 감소된 균은 6 (18.8%)균주, 50%~21%정도 감소한 균은 13 (40.6%)균주, 5%~20% 정도로 약간 감소한 균은 6 (18.8%)균주였다. 예를들어, 야생형(PpaJBCS1880)에 비해 항균력이 80% 이상 감소한 돌연변이 균주에는 Tn02-F2, Tn13-A5, Tn13-H12, Tn17-E2, Tn44-C1 및 Tn59-H8 등이 있었고, 약 50~21% 감소한 균주에는 Tn03-F4, Tn20-G9 및 Tn43-F2 등이 있었으며, 20%이하로 감소한 균주에는 Tn24-G11 및 Tn74-F12 등 이었다 (도 14, 도 15). 한편, 이들 돌연변이 균주는 항세균과 관련된 유전자들의 특성을 연구하는데 중요한 소재로 이용 될 수 있을 것으로 판단된다.

항균력의 변화에 따른 생물방제효과의 변화를 조사하기 위하여, 콩 식물체로부터 채취한 잎을 이용하여 야생형 P. parafulva PpaJBCS1880균주와 돌연변이 균주들간의 콩 불마름병 방제효과를 비교 조사하였다. 일반적으로 항균력이 감소하면 생물방제효과도 저하되는 경향이었다 (Fig. 0, Fig. 0). 야생형 균주의 콩 불마름병 방제효과는 88.9%였으나, viscosin 유사 리포펩타이드 B NRPS 유전자가 돌연변이된 균주 즉 Tn13-H12 (22.2%) Tn17-E2 (37.0%), Tn59-H9(29.6%)의 균주에서는 방제효과가 급격히 감소하였다. 이외에도 Tn03-F4 (66.7%), Tn44-C1 (51.9%) 등에서도 방제효과가 감소하였으나, viscosin 유사 리포펩타이드가 돌연변이된 것에 비해서는 생물방제에 대한 영향이 낮았다 (도 14, 도 16).

(2) Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880균주의 운동력 및 siderophore 생산 변화와 콩 불마름병 방제효과

돌연변이 균주의 swarming 운동성 변화여부는 0.5% 한천(agar)을 함유한 10% LB 배지에 배양 후 야생형과 비교 조사하였다. 재현성이 높은 swarming 배지를 만들기 위해서 먼저 사용하기 하루 전에 10% LB 배지를 멸균하여 Petri-dish에 부은 후 클린벤치에 놓고 1시간동안 표면을 건조시켰다. 이를 상온에 보관하여 사용할 경우에는 1시간 전에 다시 표면을 건조시킨 후 모든 처리에 대해 동일하게 사용하였다. 한편, 각각의 돌연변이주를 LB배지에 접종하여 16시간 동안 배양한 다음 이쑤시개를 이용해 단일 콜로니를 swarming 배지에 접종하였다. Swarming 패턴과 정도는 30^°C에서 24시간 배양하면서 야생형의 패턴과 비교하였고, 실험은 3반복으로 실시하였다.

이들 균주 중 viscosin 유사 리포펩타이드 NRPS 유전자가 돌연변이된 균주 들 즉 Tn13-H12 (27.5%), Tn17-E2 (29.6%) 및 Tn59-H8 (22.7%) 등에서는 swarming 운동성이 급격히 감소하였으며, 이외에도 proline/betaine transporter 유전자에 돌연변이가 생긴 Tn02-F2 (17.1%) 균주 및 membrane protein에 돌연변이가 생긴 Tn44-C1(2.2%) 등에서 swarming motility가 감소된 것을 확인할 수 있었다 (도 17, 도 18). 이러한 결과를 토대로 swarming motility와 생물방제와의 상관관계를 분석한 결과 두 인자 사이에는 상관계수 r=0.76 (p=0.0001)으로 정의 상관을 보였다. 이러한 결과는 처리하고자 하는 세균의 항균력이 생물방제에 상당한 영향을 미치는 것으로 판단된다.

또한, Siderophore 생산을 정성적으로 조사하였는데 각각의 돌연변이 균주를 LB 액체배지에서 예비배양한 다음 iron-free succinic acid 액체배지에 OD600= 0.1이 되도록 3 ml을 첨가한 다음 30^°C, 200 rpm에서 24시간 배양하였다. 이를 5,000×g, 4°C에서 15분간 원심분리하여 96 well plate에 100 μl를 첨가하고, chrome azole S용액을 같은 양 첨가하였다. 이를 20분간 배양한 후에 630 nm에서의 흡광도를 측정하여 Payne (1993)의 계산식 즉 siderophore 생산도 (%) = [(Ar-As]/Ar] × 100으로 계산하였는데, 여기서 Ar은 대조 (CAS 용액과 접종하지 않은 배양액) 흡광도, As는 샘플(CAS 영액과 상등액)의 흡광도로 조사하였고, 3반복으로 실험하였다.

Viscosin 유사 리포펩타이드 NRPS 유전자가 돌연변이된 균주 들 즉 Tn13-H12 (58.5%), Tn17-E2 (57.9%), Tn59-H8 (61.9%) 등에서는 siderophore 생산성이 야생형 대비 20% 이상 감소하고, Proline/betaine transporter에 돌연변이가 생간 균주 Tn02-F2 (55.1%), Aconitate hydratase A에 돌연변이가 생간 Tn43-F2 (56.1%) 등에서 감소하였으나, Tn03-F4 (103.4%), Tn13-A5 (100.6%), Tn24-G11 (102.0%), Tn74-F12 (98.6%) 등에서는 야생형과 유사한 정도의 생산량을 보였다 (도 17). 이러한 결과를 토대로 siderophore 생산성과 생물방제와의 상관관계를 분석한 결과 두 인자 사이에는 상관계수 r=0.75 (p=0.0001)으로 정의 상관이 인정되었다. 이러한 결과는 처리하고자 하는 세균의 항균력이 생물방제에 상당한 영향을 미치는 것으로 판단된다.

본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

농업생명공학연구원 KACC92259 20190124

<110> CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel Pseudomonas parafulva PpaJBC1880 strain and uses thereof <130> DHP19-157 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1538 <212> RNA <213> Pseudomonas parafulva PpaJBCS1880 16S rRNA <400> 1 gaactgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 60 gtcgagcgga tgagaggagc ttgcttctcg attcagcggc ggacgggtga gtaatgccta 120 ggaatctgcc tggtagtggg ggacaacgtt tcgaaaggaa cgctaatacc gcatacgtcc 180 tacgggagaa agcaggggac cttcgggcct tgcgctatca gatgagccta ggtcggatta 240 gctagttggt gaggtaatgg ctcaccaagg cgacgatccg taactggtct gagaggatga 300 tcagtcacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360 ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc atgccgcgtg tgtgaagaag gtcttcggat 420 tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggt tgtagattaa tactctgcaa ttttgacgtt 480 accgacagaa taagcaccgg ctaactctgt gccagcagcc gcggtaatac agagggtgca 540 agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcgcgtaggt ggtttgttaa gttggatgtg 600 aaagccccgg gctcaacctg ggaactgcat ccaaaactgg caagctagag tacggtagag 660 ggtggtggaa tttcctgtgt agcggtgaaa tgcgtagata taggaaggaa caccagtggc 720 gaaggcgacc acctggactg atactgacac tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 780 attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtcaac tagccgttgg aatccttgag 840 attttagtgg cgcagctaac gcattaagtt gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta 900 aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960 caacgcgaag aaccttacca ggccttgaca tgcagagaac tttccagaga tggattggtg 1020 ccttcgggag ctctgacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080 gggttaagtc ccgtaacgag cgcaaccctt gtccttagtt accagcacgt tatggtgggc 1140 actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1200 ggcccttacg gcctgggcta cacacgtgct acaatggtcg gtacagaggg ttgccaagcc 1260 gcgaggtgga gctaatctca caaaaccgat cgtagtccgg atcgcagtct gcaactcgac 1320 tgcgtgaagt cggaatcgct agtaatcgcg aatcagaatg tcgcggtgaa tacgttcccg 1380 ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaccagaag tagctagtct 1440 aaccttcggg gggacggtta ccacggtgtg attcatgact ggggtgaagt cgtaacaagg 1500 tagccgtagg ggaacctgcg gctggatcac ctccttaa 1538

Claims (11)

1. 식물생장 촉진 또는 항균 효과를 갖는 슈도모나스 파라풀바 (Pseudomonas parafulva) PpaJBCS1880 균주(수탁번호 KACC 92259P).
2. 제1항에 있어서,
   상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주.
3. 제1항에 있어서,
   상기 식물생장 촉진 효과는 상기 균주의 인산가용화능 또는 사이드로포어(siderophore) 생성능에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는, 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주.
4. 제1항에 있어서,
   상기 항균 효과는 벼 알마름병균 (Burkholderia glumae), 벼흰잎마름병균 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 및 콩 불마름병균 (Xanthomonas axonopodis pv.　glycines)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병균에 대한 항균력인 것을 특징으로 하는, 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주.
5. 제1항에 있어서,
   상기 항균 효과는 상기 균주의 살리실산(salicylic acid) 생성능 또는 프로테아제(protease) 생산능에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는, 슈도모나스 파라풀바 PpaJBCS1880 균주.
6. 제1항의 슈도모나스 파라풀바 (Pseudomonas parafulva) PpaJBCS1880 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물병해 방제용 미생물 제제.
7. 제6항의 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병해 방제 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 식물병해는 세균성 벼 알마름병, 벼흰잎마름병, 및 콩 불마름병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 식물병해 방제 방법.
9. 제1항의 슈도모나스 파라풀바 (Pseudomonas parafulva) PpaJBCS1880 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물생장 촉진용 미생물 제제.
10. 제9항의 미생물 제제를 포함하는, 식물생장 촉진용 미생물 비료.
11. 제9항의 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물생장 촉진 방법.

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