RO127514B1 - Tulpina de bacillus subtilis cu activitate de combatere a agenţilor fitopatogeni din sol, stimulare a creşterii plantelor şi biodegradare controlată a materialului vegetal - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la o nouă tulpină de Bacillus subtilis, care este destinată combaterii agenților fitopatogeni din sol, stimulării creșterii plantelor și biodegradării controlate a materialului vegetal în cadrul sistemelor de agricultură conservativă, inclusiv a celor pe bază de muici vegetal, provenit din culturi verzi de protecție.

Sunt cunoscute mai multe tulpini de Bacillus subtilis, care au activitate de combatere a agenților fitopatogeni. WO 2007/043771 se referă la compoziții pentru prevenirea bolilor plantelor, pe baza tulpinilor KCCM 10639 sau KCCM 10640 de Bacillus subtilis, și la un procedeu de aplicare a acestor compoziții. O serie de brevete (US 6060051, US 6103228, US 6291426 și US 6417163) protejează tulpina AQ/QST 713, de Bacillus subtilis (cu număr de depozit NRRL BO-21661), care este înalt producătoare de antibiotice și cu un spectru larg de activitate insecticidă, antifungică și antibacteriană.

De asemenea, au fost descrise, până în prezent, mai multe tulpini de Bacillus subtilis, care au concomitent activitate de combatere a agenților fitopatogeni și de stimulare a creșterii plantelor. Cererea de brevet US 2008/0152684 descrie o tulpină de Bacillus subtilis WG6-14 (cu număr de depozit NRRL B-30954), care prezintă atât activitate de stimulare a creșterii plantelor (datorită producerii de metaboliți volatili, ca, de exemplu, acetoină și 2,3 butandiol), cât și activitate antagonistă față de ciuperci fitopatogene (Pythium aphanidermatum, Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloesporoides, Sclerotium rolfsii) și față de bacterii fitopatogene (Xanthomonas axenopodis pv. citri, X. axenopodis pv. vesicatoria, Xanthomonas oryzae pv. oryzae). Brevetul US7211428B1 expune o tulpină de Bacillus subtilis (număr de depozit MTTC 5130) cu caracteristici de inhibare a creșterii ciupercilor patogene (Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Pythium aphanidermatum, Curvularia andropogonis, Alternaha alternata, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporiodes, Corynespora cassiicola, Thielavia basicola) și care stimulează dezvoltarea plantelor de cultură (de geranium și piretru).

Brevetul RO 125650 B1 se referă la o tulpină de Bacillus subtilis B49b, cu numărul de depozit NCAIM (P) B001360, antagonistă față de ciuperci fitopatogene de sol, care produc ofilirea și căderea răsadurilor: Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Fusariumgraminearum, Fusarium oxisporum f.sp. radicis-lycopersici, Sclerotinia sclerotiorum și Sclerotium bataticola, datorită producerii de antibiotice polipeptidice, iturin și surfactin, și de enzime hidrolitice, protează și lactonază, și care are și o activitate de favorizare a nodulării rădăcinilor de leguminoase, datorită producerii endofite de auxine.

Nu s-au descris până în prezent tulpini de Bacillus subtilis care să aibă concomitent activitate de antagonism față de agenții fitopatogeni din sol, de stimulare a creșterii plantelor și de biodegradare controlată a materialului vegetal. Astfel de tulpini sunt necesare sistemelor de agricultură conservativă. în cadrul acestor sisteme, lucrările mecanice ale solului sunt reduse, iar solul este acoperit cu cel puțin 30% resturi vegetale. Sistemele de agricultură conservativă reduc eroziunea solului și poluarea apelor de suprafață și din pânza freatică, dar au dezavantajul că mențin solul rece, reducând germinația și dezvoltarea plantelor cultivate, și favorizând dezvoltarea agenților dăunători, în special, ciuperci fitopatogene cu spectru larg de acțiune.

în cadrul acestor sisteme de agricultură conservativă, tulpinile de Bacillus subtilis care prezintă concomitent activitate de antagonism față de agenții fitopatogeni din sol, de stimulare a creșterii plantelor și de biodegradare controlată a materialului vegetal, ar contribui la înlăturarea dezavantajului menționat mai sus, pentru că ar inhiba agenții fitopatogeni din sol, ar stimula dezvoltarea plantelor de cultură și ar asigura un management durabil al resturilor vegetale.

Invenția se referă la o tulpină de Bacillus subtilis Usa₂, cu număr de depozit DSMZ 23654, care exercită acțiuni benefice asupra diferitelor plante de cultură, datorită activității de protecție față de ciupercile fitopatogene de sol Fusarium graminearum, Alternaria spp, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium cepivorum, Gaeumannomyces graminis,

RO 127514 Β1

Pythium debaryanum, Verticillium dahliae, Rhizoctonia solarii, Fusarium oxlsporum f. sp. 1 radicis-lycopersici, Sclerotium bataticola, producerii in situ de factori de creștere pentru plante și capacității de degradare controlată a materialului vegetal cu formare de poliamine, 3 compuși care cresc rezistența plantelor la stresurile biotice și abiotice, care se concretizează prin sporuri de producție la floarea-soarelui, realizate în condițiile unui sistem agricol 5 conservativ.

Tulpina de Bacillus subtilis Usa2 (număr de depozit DSMZ 23654) prezintă un spectru 7 larg de acțiune antifungică față de ciupercile de sol fitopatogene, o activitate de stimulare a creșterii plantelor și de biodegradare controlată a materialului vegetal. 9

Tulpina de Bacillus subtilis Usa2 prezintă următoarele avantaje:

- creștere bogată pe mediile uzuale, utilizate pentru creșterea bacililor gram-pozitivi 11 sporulați;

- formarea de spori cu viabilitate îndelungată;13

- capacitatea de a modula formarea consorțiilor microbiene de consens cu alte bacterii utilizate în biopreparate mixte, datorită activității lactonazice prin care influențează 15 semnalele AHL, implicate în realizarea sensibilității de grup;

- spectru larg de acțiune împotriva atacului ciupercilor fitopatogene de sol;17

- stimularea creșterii plantelor de cultură;

- biodegradarea controlată a materialului vegetal, cu formare de compuși care cresc 19 rezistența plantelor la stresurile biotice și abiotice de tipul poliaminelor;

- eliminarea folosirii erbicidelor și a arăturii.21

Prezenta invenție se ilustrează cu exemplul prezentat mai jos.

Exemplu. Tulpina Usa2 de Bacillus subtilis a fost obținută la Institutul de Cercetare- 23 Dezvoltare pentru Protecția Plantelor, București, din rizosfera unei plante de usturoi, provenită din zona de sud a Olteniei. Pentru izolarea bacteriei, s-a utilizat agar nutritiv (peptonă 25 - 5 g/l, extract de carne - 3 g/l, agar - 20 g/l, la 1000 ml apă, pH 6,8...7,2), iar pentru cultivare, s-a utilizat mediul Luria-Bertani, agarizat (LBA: bactotriptona - 10 g/l, extract de drojdie - 27 g/l, NaCI - 10 g/l, agar - 20 g/l, la 1000 ml apă, pH 7,5.), la o temperatură optimă de incubare de 28°C. 29

Această tulpină a fost selectată dintr-o colecție de peste 150 izolate de bacili sporulanți gram-pozitivi. în vederea încadrării taxonomice, tulpina Usa2 a fost caracterizată 31 pe baza unei taxonomii polifazice, respectiv, a combinării caracterelor morfologice (tabelul 1), cu cele fiziologice (tabelul 2) și cu cele moleculare (secvența 16S rADN, tabelul 3). 33

Tabelul 1 35

Morfologia coloniilor de Bacillus subtilis Usa2 pe diferite medii, după cultivare timp de 24 h 37

Mediul utilizat	Morfologia coloniilor tulpinii Usa2
Culoare	Aspect exterior	Dimensiuni (24 h)
Medii gelifiate, semisintetice	Mediu cu decoct de cartof - glucoză agar (CGA)	brune	rugoase, margini neregulate sub formă de filamente	colonii mari
Mediu cu extract de carne (beef extract)	crem	rugoase, centrul proeminent, încrețit, margini neregulate	colonii mari
Mediu cu decoct de fasole	crem-brun	rugoase, margini neregulate	colonii medii
Mediu cu extract de sol	crem-brun	rugoase, margini neregulate	colonii medii

RO 127514 Β1

Tabelul 1 (continuare)

Mediul utilizat	Morfologia coloniilor tulpinii Usa2
Culoare	Aspect exterior	Dimensiuni (24 h)
Medii solide, naturale	Felii de cartof sterile	brun	rugoase, margini neregulate, centru cu rugozități fine	colonii mari
Medii lichide	Mediu cu decoct de cartof - glucoză		peliculă fină la suprafață, rugoasă, turbiditate slabă
Mediu cu extract de carne		peliculă fină la suprafață, rugoasă, turbiditate slabă

Tabelul 2 Caracteristicile fiziologice ale tulpinii Usa2

Testul biochimic	Usa2
Reacția Gram	+
Reacția Voges-Proskauer	+
Hidroliză amidonului	+
Hidroliză gelatinei	+
Reducerea NO3->NO2	+
Creștere anaerobă	-
Catalaza	+
Sursa de carbon:
- malonat	+
- citrat	+
- propionat	-
- tartrat	+
- trehaloză	+
- glucoză	+
Acidifică:
- xiloza	+
- glucoza	+
- arabinoza	±
- manitol	+
- rafinoza	+
- celobioza	+
Toleranta la NaCI 7%	+

Identificarea pe baza secvenței 16S rADN (tabelul 3) s-a realizat prin aplicarea unui protocol de lucru, caracterizat prin următoarele etape: obținerea de culturi pure - colonii izolate, tehnicaînsămânțării prin epuizarea ansei; extracția ADN-ului bacterian; electroforeză în gel pentru detectarea ADN-ului; amplificarea secvenței 16S rADN prin tehnica PCR și electroforeză în gel; purificarea ADN-ului ribozomal; amplificarea enzimatică a acizilor nucleici înainte de secvențializare; precipitarea și uscarea ADN-ului codificând pentru 16sRNA. Secvențierea nucleotidică a fost realizată cu metoda Dye Terminator Cycle Sequencing (Perkin Elmer, 1998), folosind un secvențiator automat de tip ABI PRISM 310 (Perkin Elmer). Secvențele au fost analizate folosind programul CHROMAS 2.33 (Technelysium Pty Ltd). Compararea secvențelor 16S rADN obținute cu secvențele existente în Banca de gene NCBI (Național Center for Biotechnology Information) s-a realizat cu ajutorul programului BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).

RO 127514 Β1

Tabelul 3 1

Identificarea tulpinii pe baza similarității secvenței 16 S rADN cu tulpinile din GenBank

Tulpina	Lungimea secvenței 16S rADN1	Compoziția nucleotidică a secvenței 16S rADN	Identificarea tulpinii2
Usa2	510	GCGGACAGAATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGG CGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAA GACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCG GATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGT GGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCAACGCA TTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAAC GATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGA CGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGI IIICGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGT ACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAAC CAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTG	Bacillus subtilis străin ZHB4 (FJ263016.1) - similaritate: 99,4%

Coroborând toate datele obținute, tulpina Usa2 a fostîncadrată ca aparținând speciei Bacillus subtilis. încadrarea taxonomică a tulpinii Usa2 a fost confirmată de specialiștii de la 21 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen - Centrul german de microorganisme și culturi celulare) și depozitată în vederea brevetării (DSM 23654). 23

Selecția tulpinii usa2 s-a realizat pe baza acțiunii benefice, exercitată asupra diferitelor plante de cultură (grâu, porumb, floarea-soarelui), datorită activității de protecție 25 față de ciupercile fitopatogene de sol (Fusarium graminearum, Alternaria spp, Botrytis tinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium cepivorum, Gaeumannomyces graminis, 27 Pythium debaryanum, Vertitillium dahliae, Rhizoctonia solani, Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici, Sclerotium bataticola), producerii in situ de factori de creștere pentru 29 plante și capacității de degradare controlată a materialului vegetal, cu formare de poliamine, compuși care cresc rezistența plantelor la stresurile biotice și abiotice. 31

Testarea activității antagoniste in vitro a tulpinii Usa2 a fost efectuată pe mediul cu cartof - glucoză - agar (CGA/PDA), utilizându-se metoda culturilor duble. Tulpina Usa2 (dintr-33 o cultură de 24 h de creștere pe mediul LBA) a fost însămânțată în plăci Petri prin strierea cu ansa a unei linii drepte, la o distanță de 3 cm, de o rondea calibrată de miceliu (5 mm)35 dintre cele 11 ciuperci testate. Plăcile Petri astfel însămânțate au fost incubate la 28°C și analizate în ceea ce privește zona de inhibiție (mm) la 72 h.37

Experiența a fost repetată de trei ori. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.

Tabelul 4 Testarea in vitro a activității antagoniste a tulpinii Usa2 de Bacillus subtilis asupra 41 creșterii miceliene a unor ciuperci fitopatogene (zona de inhibiție la 72 h de la incubare la 28 °C) 43

Cod tulpină - încadrare taxonomică	Ciuperca fitopatogenă *
Fg	Alt	Bc	Ss	Sc	Gg	Pdb	Vd	Rs	Forl	Sb
	Zona de inhibi	ie (mm)
Usa, - Bacillus subtilis	+++	+++	+++	+++	+++	++	++	++	++	+++	++

Legenda: +++ = zona de inhibiție > 5 mm; ++ = zona de inhibiție > 3 mm; + = creștere limitată;

*Fg=Fusarium graminearum, Alt=Alternaha spp., Bc=Botrytis cinerea, Ss=Sclerotinia sclerotiorum, Sc=Sclerotium 51 cepivorum, Gg=Gaeumannomycesgraminis, Pdb= Pythium debaryanum, Vd=Verticilliumdahliae, Rs=Rhizoctonia solani, For! =Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici și Sb=Sclerotium bataticola. 53

RO 127514 Β1

Testele efectuate in vitro față de diferite ciuperci fitopatogene au evidențiat un spectru larg de acțiune antifungică, tulpina Usa2 putând fi astfel utilizată pentru protecția diferitelor culturi amplasate în muici bioactiv, provenit din cultura de mazăre/măzăriche de toamnă.

Activitatea biologică in vivo a fost testată în condiții de seră, în ceea ce privește eficacitatea tulpinii Usa2 în combaterea ciupercilor fitopatogene de sol (Rhizoctonia solani, Pythium debaryanum, Fusarium oxisporum, Sclerotinia sclerotiorum și Sclerotium bataticola), care atacă frecvent în stadiul de plantulă și produc pagube.

Operațiunile implicate au constatîn pregătirea inoculului bacterian prin împrospătarea în eprubete (incubate la 27°C, timp de 2...3 zile) pe mediul cartof-glucoză-agar (CGA) și realizarea suspensiilor bacteriene în tampon fosfat cu titrul de 10⁸ ufc/ml. Inoculul fungics-a obținut în plăci Roux, pe un mediu natural, alcătuit din boabe de ovăz dublu sterilizate la 1 atm, timp de 20 min, prin inocularea cu miceliu și incubarea la 27°C, timp de 3...4 zile. Substratul utilizat în seră a constat din 1/2 pământ de grădină + 1/4 mraniță + 1/4 nisip. Acesta a fost amestecat uniform cu inoculul fungic (~ 2 x 10⁶ spori/ kg sol) și apoi distribuit în tăvi din plastic (32/24 cm), cu 48 h înainte de semănat.

Materialul vegetal (achene de floarea-soarelui cv. Favorit) a fost tratat înainte de semănat prin imersie, timp de 20 min, în suspensiile bacteriene al căror titru a fost stabilit la 10⁸ ufc/ml. Inoculul de fitopatogen, aplicat la floarea-soarelui, a constat în complexul R. solarii + F. oxysporum + P. de baryanum (RFP), S. sclerotiorum și S. bataticola.

Experimentul a fost analizat după trei săptămâni de la semănat în ceea ce privește eficacitatea tulpinilor în combaterea ciupercilor fitopatogene. Calculul analizei variantei s-a efectuat cu programul ANOVA.

Calculul eficacității (%) tratamentelor cu microorganisme utile la sămânța de floareasoarelui (cv. Favorit), în prevenirea atacului ciupercilor de sol luate în studiu, a reflectat o foarte bună eficacitate a tulpinii de Bacillus subtilis Usa2, uneori peste etalonul chimic pe bază de tiuram (tabelul 5).

Tabelul 5

Eficacitatea diferitelor tulpini de microorganisme antagoniste în prevenirea atacului unor ciuperci telurice la cultura de floarea-soarelui (cv. Favorit), în condiții de seră

Inocul fungic*	R.F.P.*	S. s.	S.b.
Varianta de tratament	% Plante sănătoase răsărite	Eficacitatea (%)	% Plante sănătoase răsărite	Eficacitate a (%)	% Plante sănătoase răsărite	Eficacitate a (%)
77.3	83	64	90	78	80	60
Td67	80	57	83	62	79	58
Usa2	99	98	97	93	99	98
Bs36	73	43	81	58	77	54
56.1s	75	47	85	67	80	60
Bs 48	71	38	81	58	98	56
Tiradin 70 PU (4 g/kg)	83	64	100	100	100	100
Mt. Netratat	53	-	55	-	50	-

* RFP = R. solarii + F. oxysporum + P. de baryanum; S.s. = S. sclerotiorum; S.s. = S. bataticola.

RO 127514 Β1 în variantele infectate cu complexul RFP, cea mai mare eficacitate (> 50%) s-a obți- 1 nut în cazul tratării semințelor cu tulpinile Usa2, 56.1s și 77.3. Tratamentele chimice cu Tiradin 70 PU (4 g/kg semințe) au avut valori ale eficacității situate între 64 și 100%, cea mai 3 mică eficacitate înregistrându-se în variantele cu solul infectat cu complexul RFP, iar cea mai mare în solul infectat cu S. bataticola și S. sclerotiorum. Tulpinile Usa₂ au avut o eficacitate 5 de combatere a atacului ciupercilor fitopatogene de sol în amestec R. solani + F. oxysporum + P. de baryanum, superioară martorului chimic etalon. 7

Evidențierea producerii de lactonază s-a realizat printr-un experiment în trepte.

Numeroase bacterii gram-negative patogene utilizează acil-homoserin-lactona (AHL), pentru 9 expresia sensibilității de grup (quorum sensing). O enzimă denumită AHL- lactonază, produsă de numeroase tulpini de Bacillus sp., este capabilă să hidrolizeze inelul moleculei 11 de homoserin-lactonă, interferând astfel cu sistemul de comunicare al acestor bacterii (quorum quencing). Tulpina biosenzor de Chromobacterium violaceum CV026 (McCIean et 13 al., 1997) a fost utilizată ca indicator. Testul propriu-zis a constat în inocularea tulpinii Usa₂ în 2 ml de mediu lichid Luria Bertani, în care s-a adăugat C6-hexanoil-homoserin- lactonă 15 (C6-HHL) în concentrație finală de 5 μΜ și incubarea peste noapte la 28°C, cu agitare la 150 rpm. Simultan, același mediu numai cu C6-HHL a fost utilizat ca martor negativ, pentru 17 a vedea dacă mediul induce lactoliza. Testul a fost efectuat pe plăci Petri cu mediul LBA (Luria Bertani cu agar), suplimentat cu 50 pg/ml kanamicină și inoculat în plajă cu CV026, 19 prin distribuția sub formă de plajă a unei cantități de 250 μΙ, dintr-o cultură de 12 h. Pe suprafața plăcii astfel inoculată, au fost efectuate godeuri cu diametrul de 5 mm, în care s-au 21 distribuit 100 μI din supernatantul culturii bacteriene de testat. Plăcile Petri au fost incubate peste noapte la 28°C și, ulterior, analizate pentru prezența/absența halourilor violete. 23 Absența halourilor violete a indicat faptul că tot C6-HHL din mediul de creștere a fost degradat. 25

Tulpina Usa₂ prezintă capacitate foarte ridicată de producere de lactonază, modulând comunicarea la nivel de grup a altor bacterii. Poate fi deci folosită pentru combaterea bacte- 27 riilor fitopatogene care utilizează C6-HHL sau pentru realizarea de consorții microbiene de consens în care este necesară modularea quorum sensing. Următoarea serie de experi- 29 mente a urmărit punerea în evidență a acțiunii de favorizare a creșterii și a dezvoltării vegetale, datorate producerii de fitohormoni in situ, de către microorganismul în discuție. S-a 31 urmărit evidențierea activității fitohormonilor giberelici, produși de bacteriile gram-pozitive sporulate, utile plantelor de cultură, pentru a se verifica calitatea biologică de favorizant de 33 creștere.

Evidențierea și estimarea activității fitohormonilor giberelinici s-au efectuat prin 35 biotestul inducerii α-amilazei din endospermul de orz, cuplat cu tehnica difuziei radiale în gel. Etapele procedurii utilizate au fost: 37

- inducerea biosintezei α-amilazei în endospermul boabelor de orz, de către fitohormonii prezenți în extractele de testat;39

- difuzia radială, în gelul de agar-amidon, a enzimelor sintetizate sub acțiunea fitohormonilor și hidroliza consecutivă a amidonului;41

- evidențierea zonei de acțiune a enzimei prin colorarea substratului. Reactivii folosiți în cadrul acestui test au fost:43

- Gel de agar - amidon. în 100 ml tampon substrat, pH 6,9, diluat cu 100 ml apă, s-au dizolvat la cald 2,5 g agar și 1 g de amidon; s-a fiert până a devenit limpede. Soluția tampon 45 substrat, pH 6,9; 590 mg acetat de sodiu + 1,47 g veronal sodic + 1,4 g NaCI + 780 mg CaCI₂ s-au dizolvat în apă distilată și apoi s-au adăugat 62 ml HCI 0,1 N și s-a adus la un 47 volum final de 250 ml cu apă distilată.

RO 127514 Β1

- Soluție de developare: 45 ml iod 0,1 N cu 55 ml etanol absolut.

- Extract de biopreparat realizat prin osmoză inversă.

- Endosperm de orz: boabele de orz s-au curățat de palee și li s-a înlăturat prin tăiere partea care conține embrionul.

Modul de lucru a implicat următoarele etape:

- depunerea unui gel de agar - amidon, în grosime de 2...3 mm, pe un suport reprezentat de folii de acetat de celuloză sau lamele microscopice;

- practicarea în gel a unor godeuri cu diametrul de 3 mm;

- depunerea în godeuri a endospermului de orz (jumătate de bob fără embrion) și a extractului de testat (mediu de cultură a microorganismului);

- incubarea 72 h la temperatura camerei, în incintă umedă;

- colorarea cu soluție de developare a gelului;

- măsurarea zonei de difuzie.

Fitohormonii giberelinici au fost extrași dintr-un mediu de cultură specific (LB), în care s-a incubat peste noapte o suspensie de 10⁶ ufc/ml bacterii. Extracția s-a realizat prin dializa inversă a amestecului incubat peste noapte. Suspensia bacteriană a fost trecută într-un sac de dializă, care a fost suspendat, timp de 24 h, în acetat de etil (dializă inversă). Biotestul s-a lucrat față de martori de reactivi, rezultat din extracția, prin dializă inversă, a mediului LB. Tulpina Usa₂ a produs, în condițiile date, peste 25 pg echivalenți acid giberelic per ml, la peste 2/3 din nivelul produs de o tulpină etalon de Azosprillum brasiliense Sp001, recunoscută pentru capacitatea ridicată de producere de fitohormoni giberelici.

Printr-o altă serie de experimente, s-a urmărit biotestarea efectului stimulator al tulpinii Usa₂, împreună cu alte tulpini etalon, asupra creșterii unor plantule de floareasoarelui, și a avut, în total, 12 variante, în patru repetiții fiecare. Fiecare repetiție a avut cinci plante, iar fiecare variantă a avut 20 de plante. Tulpinile bacteriene au fost cultivate pe mediu LB lichid, la 28°C, aerat și agitat prin amestecare la 150 rpm, timp de 16 h. Semințele de floarea-soarelui (cv. Favorit) au fost dezinfectate în două etape. Prima dezinfecție a fost realizată în etanol 70%, timp de 30 sec, cu agitare la 60 rpm. După înlăturarea etanolului, semințele au fost clătite de trei ori cu apă distilată sterilă. Cea de-a doua dezinfecție s-a făcut cu soluție de hipoclorit de sodiu 4%, timp de 15 min. Ulterior, au fost realizate clătiri cu apă distilată, din 25 în 25 min, timp de două ore. Semințele au fost inoculate prin imersie în 3 ml suspensie bacteriană în concentrație de 10⁷ ufc/ml în tampon fosfat și 2% carboximetilceluloză, apoi au fost semănate în pungi sterile de creștere Cyg (Mega Internațional). Plantele au fost crescute în condiții controlate (temperatură de 22°C± 0,2°C, iluminare 12 h pe zi, cu 250 umol fotoni nr²s’¹). După semănat și pe toată durata experimentului, pungile au fost umectate cu soluție nutritivă Hoagland 0,25%. Creșterea rădăcinuțelor plantelor de floarea-soarelui a fost analizată la 15 zile de la semănat (tabelul 6).

Tabelul 6

Lungimea totală (mm) a rădăcinilor plantelor de floarea-soarelui (cv. Favorit) la 15 zile de la semănat

Varianta	Lungimea totală a rădăcinii (mm)
Martor neinoculat	184.29	b
WCS 365	219.05	a
B49 b	187.5	b
FL400	174.54	b
Ps 33	173.5	b
56. 1s	184.75	b

RO 127514 Β1

Tabelul 6 (continuare)

Varianta	Lungimea totală a rădăcinii (mm)
Hms1	200.86	ab
Cn s2	214.38	a
Sp s2	181.93	b
Tm s2	187	b
Usa,	225.79	a
77.3	292.6	b
Cp b5	199.28	ab

Tulpina Usa₂ a prezentat cea mai mare capacitate de a stimula dezvoltarea plantelor 11 de floarea-soarelui, asigurată statistic față de martorul neinoculat.

A fost testată și capacitatea tulpinii Usa₂ pentru producerea de enzime cu rol în mine- 13 ralizarea materialului vegetal, determinându-se activitatea celulazică, cea proteazică și cea amilazică. 15

Activitatea celulazică a fost determinată prin însămânțarea pe mediu minimal, fără sursă de carbon, repartizat în plăci Petri, în care s-a adăugat 1% carboximetilceluloză. 17 Acestea au fost incubate la 28°C, timp de cinci zile, după care au fost colorate, timp de 30 min, cu 0,3% roșu de Congo, urmată de clătire cu apă de la robinet și fixarea colorantului 19 prin incubare, timp de 15 min, cu 10% acid acetic. Descompunerea substratului carboximetilceluloză și, deci, producerea de celulază au fost indicate de apariția unei zone clare în jurul 21 creșterii bacteriene. Tulpina Usa₂ produce celulază.

Producerea de amilază s-a pus în evidență prin însămânțarea sub formă de striu pe 23 nutrient agar (NA), suplimentat cu 0,4% amidon solubil. Plăcile au fost incubate la 28°C, timp de 48...72 h, apoi inundate cu o soluție de iod în iodură de potasiu. Zonele clare din jurul 25 creșterii bacteriene, după adăugarea soluției de iod, au indicat descompunerea amidonului din mediu, deci producerea de amilază. Testele au indicat faptul că tulpina Usa₂ produce 27 amilază.

Producerea de proteaze s-a testat pe un mediu minimal mineral, suplimentat cu 29 cazeină 5%. S-au inoculat tulpinile de bacterii de test și plăcile au fost incubate la 28°C, timp de 48...72 h. După incubare, s-au tratat plăcile de agar, au fost fixate cu o soluție de 50% 31 metanol, 10% acid acetic glacial și 40% apă distilată, iar halourile din jurul coloniilor bacteriene au fost colorate cu o soluție de 60 mg/l Coomasie Blue R-250 în acid acetic 10%. 33

Rezultatele au stabilit faptul că tulpina Usa₂ este producătoare de proteaze.

Pentru că rezultatele au evidențiat faptul că tulpina Usa₂ de B. subtilis produce 35 enzime implicate în degradarea materialului vegetal, tulpina a fost testată și pentru capacitatea de mineralizare a substratului organic (prin determinarea respirației, folosind ca 37 substrat material vegetal, și a eliberării de glucide și fosfor solubil din materialul vegetal).

Pentru evidențierea capacității de degradare a materialului vegetal, s-a realizat un 39 experiment prin care s-a urmărit consumul de oxigen și eliberarea diferiților compuși din materialul vegetal tratat cu tulpini de microorganisme. Materialul vegetal (fân de măzăriche 41 păroasă, în cazul bacteriilor sporulate gram-pozitive) a fost măcinat în blender și trecut apoi pe sita de 0,250 mm. S-au ambalat câte 10 g de pulbere în pungi din polietilenă, care s-au 43 sterilizat prin iradiere gamma (la IRASM, IFIN, București). Din pulberea sterilizată, s-au luat aseptic câte 0,1 g, care s-au adus asepticîntr-un Erlenmayer de 50 ml, steril. Peste pulberea 45 fin măcinată, s-au adăugat aseptic 19 ml de tampon fosfat steril. Conținutul a fost omogenizat prin agitare și inoculat apoi cu 1 ml suspensie microbiană, normalizată la 10⁸ ufc/ml. 47 S-a menținut la agitator, timp de 24 h, la temperatura de 28°C, după care s-a trecut aseptic

RO 127514 Β1 într-un vas de respirație Strathox (Strathkelvin Instruments Limited, Glasgow, Marea Britanie). S-au efectuat determinările de respirație/producere de bioxid de carbon, timp de 12 h. După efectuarea determinărilor de respirație, s-a separat prin filtrare supernatantul, în care s-a determinat Carbonul Organic Total (TOC), cu un aparat Formacs HT (Skalar Analytical B.V., Breda Olanda), glucidele reducătoare (cu reactiv DNS) și fosforul solubil total (cu molibdat de amoniu și reactiv clorostanic).

Pentru determinarea capacității de mineralizare a substratului vegetal, au fosttestate șapte tulpini bacteriene: 56.1s; 77.3; 58.2, 77.1s și 82.1s, din probe de sol provenite din Bărăganul de sud; Usa₂ izolat din rizosferă de usturoi (Oltenia de Sud) și Mz. sl, izolat din sol cultivat cu mazăre (Dobrogea de sud) și trei tulpini de Trichoderma: Td67 și Td85, izolate din Bărăganul de Sud, și Tm, izolat din Oltenia de Sud. Probele au fost analizate comparativ cu doi martori, respectiv, martor fără inocul bacterian și martor în care bacteria a fost cultivată în mediul uzual de creștere (Luria Bertani, lichid).

Rezultatele sunt prezentate în tabelul 7. Aceste rezultate demonstrează existența unei activități ridicate de hidroliză a materialului vegetal, de către majoritatea tulpinilor de microorganisme testate (care anterior, în testele de screening, au prezentat activitate celulazică, proteazică și amilazică).

Tabelul 7

Activitatea de degradare a materialului vegetal de către tulpinile de microorganisme testate*

Tulpina	Respirație (mg/1 02 consumați, medie orară)	Conținut de carbon organic total în supernatant (mcg/l)	Glucide solubile (mcg/l)	Fosfor solubil (mcg/l)
56.1s	0,12±0,03c	0,24±0,02c	1,67±0,06c	0,02±0,01c
77.3	1,56±0,32b	3,87± 1,17b	12,24±0,28b	17,87±2,17b
58.2	1,51±0,05b	4,54±1,05b	12,64±0,41b	16,54±1,25b
77.1s	1,54±0,24b	4,54±1,25b	12,64±0,41b	18,42±1,54b
82.1s	1,85±0,18ab	5,87±3,17ab	22,24±0,28ab	27,87±4,17ab
Usa2	2,15±0,04a	7,24±2,52a	29,87±0,36a	35,24±3,52a
Mz.sl	1,62±0,12b	3,24±1,12b	11,87±0,63b	15,24±2,27b
Td67	1,58±0,28b	3,87± 1,72b	12,24±0,28	17,87±3,23b
Td85	2,24±0,14a	7,54±1,25a	27,64±0,81a	36,44±4,07a
Tm	1,87±0,16ab	5,24±2,85ab	16,72±0,74b	15,42±2,23b

‘Valorile urmate de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P>0,05.

Martorul negativ conferă informații în timp real, referitoare la comportamentul unor probe ideale, fără activitate biologică de degradare a substratului vegetal, în condițiile de desfășurare a testului. în această variantă, substratul vegetal nu a fost inoculat cu microorganisme și a fost menținut în condiții identice de incubare cu cele ale probelor test. Acesta oferă informații referitoare la cantitatea maximă de oxigen, care ar putea fi regăsită în probe fără activitate de biodegradare. Martorul pozitiv oferă informații cu privire la capacitatea de dezvoltare a tulpinii analizate, în condițiile unei cultivări pe mediu uzual de creștere. Acest mediu permite multiplicarea microorganismului, datorită unei hrăniri corespunzătoare și în condițiile de incubare oferite pe parcursul desfășurării testului.

Tulpina Usa₂ prezintă o foarte ridicată capacitate de degradare a materialului vegetal, la nivelul ciupercilor din genul Trichoderma, ciuperci larg utilizate pentru accelerarea dezvoltării materialului vegetal.

RO 127514 Β1

A fost testată și capacitatea de producere de poliamine de către bacteriile selecțio- 1 nate. Mecanismul de acțiune prin care mulciul vegetal de leguminoase și, în special, de măzăriche păroasă, își exercită acțiunea de stimulare a creșterii plantelor, este cel de 3 modulare a nivelului de poliamine din plante (compuși cu acțiune de reglare a proceselor metabolice din plante, recunoscuți în ultimul deceniu). Modularea se realizează prin aportul 5 de poliamine endogene și precursori, compuși formați datorită descompunerii materialului vegetal de leguminoase, cu un conținut ridicat de proteine. Bacteriile gram-pozitive sporulate, 7 care sunt cele mai potrivite pentru formarea mulciului bioactiv, sunt deci acele microorganisme care au capacitatea cea mai ridicată de a produce poliamine din materialul vegetal de 9 măzăriche păroasă. S-a lucrat cu pulbere de măzăriche păroasă, obținută conform metodei descrise deja. Din pulberea sterilizată, s-au luat aseptic câte 0,1 g de pulbere de material 11 vegetal, care s-au adus aseptic într-un Erlenmayer de 50 ml, steril. Peste pulberea fin măcinată, s-au adăugat aseptic 19 ml tampon fosfat steril. S-a omogenizat prin agitare și s-a 13 inoculat apoi cu 1 ml suspensie bacteriană, provenită din cultură de 12 h pe mediu LB, normalizată la 10⁸ ufc/ml. S-a menținut la agitator, timp de 72 h, la temperatura de 28°C, 15 după care s-a separat cultura bacteriană prin centrifugare la 5000 x g, pentru 20 min, la 4°C. Supernatantul a fost acidifiat cu acid percloric, până la obținerea unei soluții cu o 17 concentrație finală de 5%. Supernatantul acidifiat a fost derivatizat prin dansilare (Smith și Meeuse, 1996, Garcia-Moruno et al., 2005, Cassan et al., 2009). Poliaminele au fost 19 separate și identificate prin cromatografie în strat subțire, folosind amestecuri cloroformtrietanolamină (9:1) și n-hexan- acetatde etil (2:1), și comparându-le cu valorile compușilor 21 standard dansilați. Plăcile de siliciu au fost observate în lumină UV, spoturile selectate au fost trecute cantitativ de pe placă într-o eprubetă. Din silicagel, s-au eluat poliaminele 23 dansilate cu soluție de metanol-toluen (9:1). Fluorescența a fost măsurată prin spectrofluorimetrie, folosind lumină de excitare de 415 nm și lumină de emisie de 510 nm. 25

Rezultatele au demonstrat faptul că tulpina Usa₂ are cea mai mare capacitate de producere de poliamine (compuși implicați mai ales în răspunsul plantelor la diferite forme 27 de stres) din materialul vegetal de măzăriche păroasă.

Capacitatea sa este mai ridicată decât a tulpinii etalon Az39 de Azospirillum 29 brasiliense, citată în literatura de specialitate, ca fiind producătoare de poliamine. (Cassana et al., 2009, Cadaverine production by Azospirillum brasilense and its role în plant growth 31 promotion and osmotic stress mitigation, Eur. J. Soil Biology 45\ 12-19).

Tulpina Usa₂ a fost analizată în ceea ce privește inocuitatea pe larve de Galleria 33 mellonella, în conformitate cu protocolul descris de Seed et al., în 2008. Pentru aceasta, tulpina Usa₂ de Bacillus subtilis a fost cultivată pe mediul LB la 28°C, cu agitare la 150 rpm, 35 timp de 48 h, după care a fost centrifugată la 4000 rpm, iar sedimentul a fost resuspendat în 10 mM MgSO₄, suplimentat cu 1,2 mg/ml ampicilină. Concentrația inoculului utilizat pentru 37 tratarea larvelor a fost măsurată cu spectrofotometrul la OD 600 (cunoscându-se că OD 600 = 1 reprezintă 10⁸ ufc/ml). Larvele de Galleria mellonella au fost crescute pe mediul 39 Haydak la 30°C. Pentru testul de inocuitate, larvele în ultimul stadiu au fost ținute la 4°C, timp de 5 min, după care au fost injectate cu 5 μΙ suspensie bacteriană, utilizând o seringă 41 Hamilton. Fiecare variantă de diluție a cuprins 30 de larve, iar zece larve au fost utilizate pentru fiecare repetiție. Varianta martor a constat în larve injectate cu 5 μ110 mM MgSO₄ și 43

1,2 mg/ml ampicilină, în scopul analizării efectelor fizice, letale, determinate de injecții. Larvele inoculate au fost menținute apoi pe mediul Haydak la 30°C, în întuneric. La 24, 48 45 și 72 h după infecție, larvele au fost analizate, iar cele moarte au fost numărate. Larvele care nu au prezentat semne vitale la atingerea cu vârful pipetei au fost considerate moarte. 47 Rezultatele au evidențiat faptul că tulpina Usa₂, nici atunci când a fost aplicată nediluată, nu a determinat o mortalitate mai mare de 50%, iar la diluția de 10³ ufc/mL'¹, nu s-a determinat 49 mortalitatea larvelor de Galleria mellonella (tabelul 8).

RO 127514 Β1

Tabelul 8

Mortalitatea larvelor de Galleria mellonella, injectate cu suspensii bacteriene de 10⁶ ufc/ml din tulpinile de testat

Varianta	Repetiția	24 h postinfecție	48 h postinfecție		72 h postinfecție
vii	moarte	vii	moarte	vii	moarte	crisalide
Martor 10 mM MgSO4+ 1,2 mg/ml ampicilină (DO 0,000)	R1	10	0	10	0	10	0	2
R2	10	0	10	0	9	1	1
R3	10	0	10	0	9	1	-
Usa2 106 ufc/ml	R1	10	0	9	1	8	2	-
R2	8	2	8	2	8	2	-
R3	10	0	10	0	9	1	1

Datele din tabelul 8 demonstrează faptul că tulpina testată, Usa₂, nu prezintă practic patogenitate față de larvele de Galleria mellonella, neavând capacitatea de a se multiplica în corpul larvelor și de a produce bacteremii, deși au fost injectate în limfa larvelor. Seriile de experimente întreprinse în scopul verificării activității biologice a tulpinii Usa₂ de Bacillus subtilis au demonstrat prezența unui spectru larg de acțiune antifungică față de diferite ciuperci fitopatogene, o capacitate semnificativă de stimulare a creșterii plantelor și o activitate mărită de producere a unor exohidrolaze, implicate în mineralizarea materialului vegetal. Tulpina Usa₂ nu prezintă patogenitate pentru organisme nețintă.

Toate aceste caracteristici prezintă complementaritate cu tehnologiile agricole conservative, inclusiv cu cele care implică conversia culturilor verzi de protecție în timpul iernii, în muici. în aceste tipuri de tehnologii conservative, sunt reduse lucrările solului și se menține peste 30% din teren acoperit cu resturi vegetale. în aceste condiții, semințele plantelor de cultură germinează mai greu și este creat un cadru favorabil atacului agenților fitopatogeni. Aplicarea tulpinilor cu calități biologice, menționate anterior, peste resturile vegetale de pe sol, compensează aceste dezavantaje ale tehnologiilor agricole, conservative.

Pentru a verifica în practică modul în care caracteristicile favorabile ale tulpinii Usa₂ compensează o serie dintre dezavantajele sistemelor de agricultură conservativă, s-a realizat un experiment de câmp.

Experimentele de cultivare au fost realizate pe un cernoziom cambie, la Amzacea (Dobrogea). Cultura de măzăriche de toamnă (păroasă) Vicia villosa, cv. Welta, a fost semănată direct în miriștea de grâu, la sfârșitul lunii septembrie. S-a folosit o mașină de semănat direct în miriște și s-au semănat, la o densitate de 120...140, boabe germinabile de măzăriche/m², corespunzând unei cantități de 40...45 kg/ha. Adâncimea de semănat a fost de 5...6 cm.

în primăvară, s-a transformat cultura de măzăriche în muici bioactiv, prin tăvălugire și tratare cu 900...1000 litri de suspensie care include un erbicid total pe bază de glifosat, aplicat în doză de 1,25...1,5 kg s.a./ha, și o suspensie de 10⁵ ufc/ml Bacillus subtilis Usa₂. La cinci zile după tratamentul cu bacterii, s-a însămânțat o cultură de floarea-soarelui (cv. Rumbasol Or), la o densitate de 50...55000 semințe germinabile/ha, directîn mulciul vegetal, prin folosirea unei mașini de semănat direct în miriște. în continuare, cultura de floareasoarelui s-a întreținut conform tehnologiei uzuale până la recoltare. S-a lucrat față de o variantă martor intensiv, la care s-a realizat arătură de toamnă adâncă, tratarea cu erbicide premergente și postemergente. De asemenea, s-a folosit și o variantă la care nu s-a realizat bioactivarea mulciului vegetal cu bacterii Usa₂. Fiecare variantă a fost realizată în patru repetiții.

RO 127514 Β1 în stadiul apariției primelor calatidii înflorite în cadrul dezvoltării florii-soarelui, s-a 1 determinat vigoarea plantelor, înălțimea și biomasa aeriană. Vigoarea plantelor s-a diferențiat semnificativ în stadiul apariției primelor calatidii. Pe o scară de la 1 la 9, la sistemul intensiv, 3 vigoarea plantelor a fost de doar 7, în pofida condițiilor climatice foarte favorabile pentru floarea-soarelui, în anul de experimentare. La sistemul în care s-a folosit muici vegetal, 5 vigoarea a crescut la 7,5. La sistemul cu muici bioactivat, tratament al mulciului cu suspensie de bacterii Usa₂, plantele de floarea-soarelui au prezentat o vigoare sporită, de 8,5. înălțimea 7 plantelor nu a fost influențată semnificativ de sistemul tehnologic, dar la mulciul bioactiv(at) cu Usa₂, plantele au acumulat o semnificativ mai multă biomasă. în final, vigoarea suplimen- 9 tară a plantelor de floarea-soarelui, cultivate în muici bioactivat, s-a concretizat într-un spor de producție de aproximativ 10%. Rezultatele experimentului de câmp sunt prezentate în 11 tabelul 9.

Tabelul 9 Influența diferitelor sisteme tehnologice asupra creșterii și producției de floarea-soarelui¹ 15 Amzacea, 2010

Varianta	Vigoarea2 medie a plantelor	Înălțimea plantei2 (cm)	Biomasă aeriană uscată2(g)	Producția kg/ha
Martor intensiv, arat	7	96,6a	8,85a	2820a
Muici vegetal	7,5	98,3a	9,08a	2920a
Muici vegetal bioactivat cu Usa,	8,5	94,5a	9,87b	3270b

¹- Valorile urmate de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P>0,05. 23 ²- Stadiul apariției calatidiilor înflorite, vigoarea 1 - plante mici cu frunze mici; 9 - plante mari cu frunze robuste.

Creșterile de producție s-au realizat în condițiile unui sistem conservativ, în care sunt reduse costurile de producție aferente folosirii erbicidelor și arăturii, iar folosirea unei culturi 27 de protecție de măzăriche în timpul iernii este încurajată prin plățile compensatorii, asociate măsurilor de agromediu. 29

Claims (5)

1 Revendicare

3 Tulpină de Bacillus subtilis, Usa₂, cu număr de depozit DSMZ 23654, caracterizată prin aceea că exercită acțiuni benefice asupra diferitelor plante de cultură, datorită activității

5 de protecție față de ciupercile fitopatogene de sol Fusarium graminearum, Alternaria spp, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium cepivorum, Gaeumannomyces graminis,

7 Pythium debaryanum, Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani, Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici, Sclerotium bataticola, producerii in situ de factori de creștere pentru

9 plante și capacității de degradare controlată a materialului vegetal, cu formare de poliamine, compuși care cresc rezistența plantelor la stresurile biotice și abiotice, care se concretizează 11 prin sporuri de producție la floarea-soarelui, realizate în condițiile unui sistem agricol, conservativ.