CN113373094B - 耐寒短杆菌sdb5及其在促进植物生长中的应用 - Google Patents

耐寒短杆菌sdb5及其在促进植物生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及耐寒短杆菌SDB5及其在促进植物生长中的应用，属于微生物应用技术领域。耐寒短杆菌SDB5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.20136，保藏日期：2020年6月24日，分类学名称：Brevibacterium frigoritolerans SDB5。本发明涉及的根部内生细菌耐寒短杆菌SDB5从陕北抗逆性非常强的天然沙地柏根部中成功分离获得，具有耐盐碱且促进植物生长的作用。耐寒短杆菌SDB5耐盐碱性能高且能够显著促进植物生长，使植物根系发达，新生侧根明显增多，并且具有解钾作用，从而为微生物法改良盐碱地且促进植物生长和提高土壤速效钾技术奠定了基础。

Description

耐寒短杆菌SDB5及其在促进植物生长中的应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体来说，涉及耐寒短杆菌SDB5及其在促进植物生长中的应用。
背景技术
目前农业上广泛使用的菌种均有不足之处，如枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌容易发生休眠进而影响使用效果，该类菌制剂的使用效果对施加量依赖性强，大量施加增加了应用成本；丛枝真菌和木霉菌属于真菌，虽然使用效果好，但发酵成本较高，且使用方式较为繁琐。
沙地柏(Sabina vulgaris)以其适应范围广、枝叶茂密、萌芽和萌孽能力强、枝条沙埋或触地后即可萌发不定根等特性，成为沙漠地区重要的固沙树种。沙地柏是干旱、半干旱区优良珍稀的常绿固沙和护坡保土树种，是抗逆性非常强的植物，其耐盐碱、耐贫瘠、耐旱，而且抗病抗虫。近年来，微生物和植物互作机理的研究成为热点，微生物被看作是植物的第二基因组，因此，沙地柏的抗逆性强，除了跟自身的基因优良有关，可能还与其体内存在的大量有益微生物有关。
植物根际促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是生活在植物根圈微域内，对病原菌有拮抗或可促进植物生长的有益根际细菌的统称。根际促生细菌能通过分泌吲哚乙酸等激素，促进植物对营养物质的吸收和提高宿主系统抗性来改善植物生长状况。因此，以沙地柏为对象，筛选环境适应能力强，发酵条件要求低，容易实现低成本高密度发酵；定殖和自我扩繁能力强，用量少，不依赖于施加量，接种成功即可，一次接种，终生有效；来源于灌木，但在单、双子叶植物根际都能定殖发挥功效，宿主范围广，对宿主的适应能力强，促生能力的保持对其宿主环境的依赖性不高的菌种是亟需的。
前期研究中，已经从沙地柏根际分离到一株符合上述要求的PGPR菌玫瑰色考克氏菌SDB9。然而，在土壤生态系统中，很多分类地位不同的微生物可以执行相同的代谢功能，当某种微生物在环境胁迫下时，其作用可被其他物种替代，从而维持生态系统稳定性，因此，植物根系从土壤选择性招募并供养大量微生物。基于以上考虑，本发明继续从沙地柏根际分离有益的PGPR菌，并得到了新的符合筛选要求的菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有耐盐碱条件且耐酸性条件、能够显著促进植物生长尤其是地上部分生长作用的细菌，耐寒短杆菌SDB5能耐受1mol/L的NaCl胁迫，在pH6-pH11的培养基上都能生长，解决了现有技术中存在的微生物菌种适应能力不足问题。
为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
耐寒短杆菌SDB5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.20136，保藏日期：2020年6月24日，分类学名称：Brevibacteriumfrigoritolerans SDB5。
耐寒短杆菌SDB5的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
耐寒短杆菌SDB5的制备方法为：
(1)沙地柏根部表面彻底消毒；
(2)沙地柏根部内生细菌的培养、分离和纯化；
(3)耐盐碱菌的培养、分离和鉴定；
(4)耐盐碱菌SDB5的生长特性观察及生理生化鉴定；
(5)耐盐碱菌SDB5分离株的16S rDNA测序和基因组测序；
(6)耐盐碱菌SDB5的鉴定。
耐寒短杆菌SDB5为杆状、革兰氏阳性，菌落长时间培养呈白色，从高分辨率扫描镜检照片可看出该菌长约为2667nm，宽约为906.7nm。
耐寒短杆菌SDB5能够在浓度为0-1mol/L的NaCl培养基和pH值为6-11的培养基上能正常生长。盐碱复合胁迫与上述单独胁迫结果类似，说明耐寒短杆菌SDB5具有耐盐碱能力，且在酸性条件下也能生长。
同样的，研究发现耐寒短杆菌SDB5对植物生长特别是地上部分的生长具有显著地促进作用。
耐寒短杆菌SDB5应用于促进植物生长中，其具体方法为：
将耐寒短杆菌SDB5接种于培养基中，于25-30℃培养20-28h，得到培养液，将培养液离心后得到耐寒短杆菌SDB5菌体，将耐寒短杆菌SDB5菌体用水重悬得到耐寒短杆菌SDB5菌液，将耐寒短杆菌SDB5菌液用于植物的浸种、灌根、接种，以促进植物生长。植物定植后，随着根系的生长，耐寒短杆菌SDB5开始进行自己扩繁，在定植40d左右时表现出明显地促进植物生长的作用，具体体现在主要根系发达，地上部分生物量增大。
其中，菌液的使用浓度是比较宽的一个范围，从1×106-1×1010CFU/mL，浓度过高的情况下需要稀释后使用。梯度试验表明只要将耐寒短杆菌SDB5菌液接种于植物的根部，即可发挥促进植物生长的作用，但超高浓度浸种会抑制种子萌发。
优选地，耐寒短杆菌SDB5菌液的使用浓度为1×107CFU/mL。
本发明的有益效果在于：
本发明通过从陕北抗逆性非常强的天然沙地柏根部中成功分离获得耐盐碱且具有促进植物生长作用的根部内生细菌，该菌被鉴定为耐寒短杆菌SDB5，于2020年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.20136，分类学名称：Brevibacterium frigoritolerans SDB5。耐寒短杆菌SDB5耐盐碱且能够显著促进植物生长，使植物根系发达，地上部分生物量增大，从而为微生物法促进植物生长特别是地上部分生长技术奠定了基础。
附图说明
图1A为耐寒短杆菌SDB5的耐盐性分析；
图1B为耐寒短杆菌SDB5的耐碱性分析；
图2为耐寒短杆菌SDB5的革兰氏染色分析结果；
图3为耐寒短杆菌SDB5的高分辨率电镜结果；
图4为玉米CAT活性结果的比较；
图5为玉米脯氨酸含量结果的比较；
图6为玉米叶绿素含量结果的比较；
图7A为中绿8号绿豆地上及地下部分平均干重比较；
图7B为榆绿1号绿豆地上及地下部分平均干重比较；
图7C为小丰2号小豆地上及地下部分平均干重比较；
图7D为中红1号小豆地上及地下部分平均干重比较；
图8为水稻穗长、穗下茎、株高的比较；
图9为水稻穗基直径、茎基直径的比较；
图10为水稻根长的比较；
图11为水稻根面积的比较；
图12为水稻根体积的比较；
图13为水稻穗粒数的比较；
图14为水稻产量的比较。
具体实施方式
下面将对本发明做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
耐寒短杆菌SDB5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.20136，保藏日期：2020年6月24日，分类学名称：Brevibacteriumfrigoritolerans SDB5。
耐寒短杆菌SDB5的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
耐寒短杆菌SDB5的制备方法为：
(1)沙地柏根部表面彻底消毒；
(2)沙地柏根部内生细菌的培养、分离和纯化；
(3)耐盐碱菌的培养、分离和鉴定；
(4)耐盐碱菌SDB5的生长特性观察及生理生化鉴定；
(5)耐盐碱菌SDB5分离株的16S rDNA测序和基因组测序；
(6)耐盐碱菌SDB5的鉴定。
耐寒短杆菌SDB5为杆状、革兰氏阳性，菌落长时间培养呈白色，从高分辨率扫描镜检照片可看出该菌长约为2667nm，宽约为906.7nm。
耐寒短杆菌SDB5应用于促进植物生长中，其具体方法为：
将耐寒短杆菌SDB5接种于培养基中，于28℃培养22h，得到培养液，将培养液离心后得到耐寒短杆菌SDB5菌体，将耐寒短杆菌SDB5菌体用水重悬得到耐寒短杆菌SDB5菌液，将耐寒短杆菌SDB5菌液稀释后用于植物的浸种、灌根、接种。植物定植后，随着根系的生长，耐寒短杆菌SDB5开始进行自己扩繁，在定植40d左右时表现出明显地促进植物生长的作用，具体体现在主要根系发达，地上部分生物量增大。
其中，所述培养基为LB培养基，其组成为：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g NaCl和1000mL蒸馏水，pH为8.0。
耐寒短杆菌SDB5菌液的使用浓度为1×107CFU/mL。
实施例1耐盐碱细菌的分离与鉴定
(1)沙地柏根部表面彻底消毒
将沙地柏根部表面的泥土用自来水冲洗干净，放入超净工作台中，紫外线灭菌20min，用无菌水冲洗3-4次。用75％的乙醇浸泡10min，再依次用无菌水冲洗3次，用3％次氯酸钠浸泡5min，最后再用无菌水冲洗4-5次。保留最后一次冲洗的无菌水，用于消毒检验是否彻底。将最后一次消毒的无菌水均匀涂布在LB培养基平板上，放置在28℃环境里培养3-5天，检查是否有菌落形成。消毒检查结果：若无菌落生成，则表明消毒很彻底。
(2)沙地柏根部内生细菌的培养、分离和纯化
操作在超净工作台中进行，紫外灯灭菌20min，将沙地柏根部用灭菌的手术刀切成小块，置于研钵中进行研磨。研磨成浆状后静置30min，之后用移液枪取其上清液。将上清液依次稀释为10倍、100倍、1000倍三个不同的浓度，并将三个浓度的组织液用涂布法均匀的涂布在LB(10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g NaCl、15g/L琼脂和1000mL蒸馏水，pH为7.0)和TSA(5g/L大豆蛋白胨、15g/L胰蛋白胨、5g/LnaCl、15g/L琼脂和1000mL蒸馏水，pH为7.0)培养基平板上。将培养基倒置放置于28℃的培养箱中，等待培养基平板上长出菌落，根据菌种的形态和颜色，用平板划线的方法分离纯化菌种。如此反复，一直到能够分离纯化出单一的菌落。再放入设置温度为28℃的培养箱中继续培养。
(3)耐盐碱细菌的培养、分离和鉴定
采用滴板实验，将步骤(2)分离得到的所有菌种分别连续稀释为1、10、102三个不同倍数的菌液，滴到不同pH值培养基和不同NaCl浓度的培养基上，观察其生长情况，最终鉴定得到一株能在浓度为1mol/L NaCl培养基和pH值为11的固体LB培养基上生长的细菌SDB5，如图1所示。
(4)耐盐碱菌SDB5的生长特性观察及生理生化鉴定
如图2和图3所示，SDB5菌落为白色革兰氏阳性杆状菌，从高分辨率扫描镜检照片可看出该菌长约为2667nm，宽约为906.7nm，菌落较大，菌落呈圆形凸起，整齐湿润不透明，长时间培养菌落颜色加深变浅黄色。SDB5菌落的最适生长培养基为LB培养基(10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10gNaCl、1000mL蒸馏水，pH8.0)、最适生长温度为28℃，液相质谱测定其激素合成能力结果表明：SDB5菌株内IAA(生长素)含量为356.9ng/g，细胞分裂素主要是异戊烯基腺苷(iPR)和异戊烯基腺嘌呤(iP)，其含量分别为2.125ng/g和48.57ng/g，而反式玉米素类细胞分裂素含量很少。
(5)耐盐碱菌SDB5分离株的16S rDNA测序
将目标菌的菌株划线接种于LB培养基中，于28℃恒温培养箱中培养24h，得到单菌落。
采用细菌16S rDNA通用引物：
27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1942R(5’-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16S rDNA基因序列。反应体系为：10×PCR缓冲液5μL、MgCl2(25mmol/L)2.0μL、dNTP(4mmol/L)、TaqDNA聚合酶1μL、引物各1μL、模板2μL，补充去离子水至50μL。反应条件为：95℃+5min；94℃+30s；50℃+30s；72℃+1min；33个循环，最后72℃保温5min。反应结束后取2μLPCR产物在1％琼脂凝胶上进行电泳，用凝胶成像系统观察扩增产物的电泳结果，16S rDNA的PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。根据测序结果登录NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库，进行BLAST序列比对，结果表明耐寒短杆菌SDB5的16S rDNA的序列与耐寒短杆菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)的同源性最高，因此耐寒短杆菌SDB5被鉴定为耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)。
(6)耐寒短杆菌SDB5的鉴定
耐盐碱菌SDB5被称为耐寒短杆菌SDB5，于2020年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.20136，分类学名称：Brevibacteriumfrigoritolerans SDB5。
实施例2耐寒短杆菌SDB5在盐碱胁迫下提高玉米抗氧化能力
为了验证耐寒短杆菌SDB5对单子叶植物的促进生长的作用，本实施例利用玉米郑单958品种为试验材料，挑选约200粒颗粒饱满、无病虫害、无损伤、并且大小相差不大的玉米种子，用自来水冲洗已挑选好的玉米种子2-4次，将洗干净的玉米种子于清水中浸泡6小时，而后置于28℃培养箱中发芽，并准备上口径为11cm、高为14cm的装有蛭石花盆若干个，将处理完成后的玉米种子种于其中，按每盆约8-10粒种子进行播种，然后放入生长室中进行培养。待玉米种子长出第二片真叶时，需要间除长势不良的幼苗，最终使每盆中保留3株玉米幼苗。在玉米幼苗高5cm时，利用150ml浓度为1×107CFU/mL的耐寒短杆菌SDB5菌液进行灌根处理形成试验组(SDB5)，对照组(CK)浇灌自来水。待玉米生长60天后进行碳酸钠模拟盐碱胁迫三次，三次的浓度分别是0.025mol/L、0.05mol/L和0.1mol/L，每盆浇150ml，三次盐碱胁迫间隔时间为1周，接下来对玉米形态和抗氧化生理指标进行观察和测定。结果如图4、图5和图6所示：SDB5处理组玉米CAT活性显著高于对照组，提高了220％；SDB5处理组玉米MDA含量稍微低于对照组，但差异并不显著；SDB5处理组玉米SOD和POD活性稍微高于对照组，但差异并不显著；SDB5处理组玉米脯氨酸含量显著高于对照组玉米，提高了60％；SDB5处理组玉米叶绿素含量显著高于对照组玉米，提高了100％。
实施例3耐寒短杆菌SDB5在大田试验条件下促进植物生长
如图7所示，在陕西省榆林市红石峡试验基地进行了绿豆(中绿8号和榆绿1号)和红小豆(小丰2号和中红1号)试验：
随机区组排列，分两个处理，每个处理3个重复小区，小区面积为10m2(2m×5m)，株距0.2m，行距0.5m，每行20株。绿豆和小豆在幼苗三叶一心时期时用浓度为1×107CFU/mL的耐寒短杆菌SDB5菌液进行灌根处理，结果表明：SDB5处理绿豆及小豆的地上和地下部分干重都有增加，中绿8号、榆绿1号、小丰2号和中红1号的地上部分与对照相比差异极显著；小丰2号的地下部分与对照差异显著。
表1绿豆产量构成因素
Figure GDA0003207016390000101
由表1可计算得到绿豆对照的亩产为156kg，耐寒短杆菌SDB5的亩产为171.6kg，耐寒短杆菌SDB5处理绿豆产量比对照CK亩产增加了15.6kg，增产10.1％，差异极显著。
表2小豆产量构成因素
Figure GDA0003207016390000102
由表2可计算得到小豆对照CK的亩产为140kg；耐寒短杆菌SDB5处理组的亩产为162.6kg，耐寒短杆菌SDB5处理红小豆产量比对照CK亩产增加了22.6kg，增产12％，差异极显著。
在宁夏回族自治区银川市兵沟黄河大桥盐碱地进行了水稻(吉宏6号)试验：
水稻采用上述相同浓度的耐寒短杆菌SDB5菌液浸种1小时，然后进行催芽，直接播种。水稻成熟后，分析结果表明：如图8所示，耐寒短杆菌SDB5处理组与对照组相比较，水稻株高增加3.8％，穗长增加12.4％，穗下茎增加3.9％；如图9所示，茎基直径增加约为2.9％，穗基直径增加约为48％，处理组水稻穗基直径，穗长、株高与对照组差异显著，穗下茎长、茎基直径差异不显著。
试验组与对照组的根系进行比较，肉眼可以清楚的观察到试验组水稻的根部侧根数量明显增多，根长增加，根系体积增大。随后用根系扫描仪进行扫描处理，处理后的数据用Win RHIZO PRO 2009软件进行分析，结果如图10-14所示，耐寒短杆菌SDB5处理组的根长、根表面积、根体积与对照组相比差异极显著，其中，根长增加43％，增加最多。与对照相比，耐寒短杆菌SDB5处理组穗粒数增加24％，差异显著；处理组单位平方米产量(带颖壳重)为0.958kg，对照组的水稻产量(带颖壳重)为0.784kg，结合亩穗数，千粒重，穗粒数计算，处理组水稻亩产量约为638kg，对照组水稻亩产量约为522kg，处理组比对照组增产18.2％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，这些具体实施方式都是基于本发明整体构思下的不同实现方式，而且本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 榆林市中泰农业科技有限公司；榆林学院
<120> 耐寒短杆菌SDB5及其在促进植物生长中的应用
<130> 2021.07.09
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
tggagcatgc tatacatgca agtcgagcga atcgatggga gcttgctccc tgagattagc 60
ggcggacggg tgagtaacac gtgggcaacc tgcctataag actgggataa cttcgggaaa 120
ccggagctaa taccggatac gttcttttct cgcatgagag aagatggaaa gacggtttac 180
gctgtcactt atagatgggc ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca 240
aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360
gcaacgccgc gtgaacgaag aaggccttcg ggtcgtaaag ttctgttgtt agggaagaac 420
aagtaccaga gtaactgctg gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540
agcgcgcgca ggtggttcct taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt 600
cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccaag tgtagcggtg 660
aaatgcgtag agatttggag gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgtaactga 720
cactgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780
aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta gtgctgcagc taacgcatta 840
agcactccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960
gacatcctct gacaacccta gagatagggc tttccccttc gggggacaga gtgacaggtg 1020
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa 1140
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200
tgctacaatg gatggtacaa agggctgcaa acctgcgaag gtaagcgaat cccataaagc 1260
cattctcagt tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg aagccggaat cgctagtaat 1320
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt catggagcca gccgcctaag 1440
gtggaccg 1448

Claims (6)

1.耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)SDB5，其特征在于：
耐寒短杆菌SDB5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.20136，保藏日期：2020年6月24日。
2.权利要求1所述的耐寒短杆菌SDB5在促进植物生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的耐寒短杆菌SDB5的应用，其特征在于：
所述耐寒短杆菌SDB5的菌液具有促进植物生长和提高植物抗氧化的能力。
4.根据权利要求3所述的耐寒短杆菌SDB5的应用，其特征在于：
所述耐寒短杆菌SDB5的菌液具有促进植物地上部分生长的能力。
5.根据权利要求2所述的耐寒短杆菌SDB5的应用，其特征在于：
将所述耐寒短杆菌SDB5接种于培养基中，于25-30℃培养20-28h，得到培养液，将所述培养液离心后得到耐寒短杆菌SDB5菌体，将耐寒短杆菌SDB5菌体用水重悬得到耐寒短杆菌SDB5菌液，将耐寒短杆菌SDB5菌液用于植物的浸种、灌根、接种，以促进植物生长。
6.根据权利要求2所述的耐寒短杆菌SDB5的应用，其特征在于：
所述耐寒短杆菌SDB5的菌液的使用浓度为1×106-1×1010CFU/mL。
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