CN114591869B - 一种耐寒短杆菌sdb5的液体发酵培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基，该专用于耐寒短杆菌SDB5的低成本高密度液体发酵培养基包括：8g/L黄豆粉、2g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L腌制粗盐、1.8g/L MgSO4、1.8g/L K2HPO4和1.2g/LCaCO3。发酵液中耐寒短杆菌SDB5的活菌含量达到3.42×108CFU/mL。耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基有效解决了传统发酵过程中存在的生物量低、发酵周期长、生产成本高等缺点，安全无毒，能够有效提高养分利用效率、显著促进植物生长，可以辅助化肥减量、提高作物产量、改善作物品质，有利于大规模推广应用，使得耐寒短杆菌SDB5菌剂能够作为生物肥料广泛的应用于农业生产中。

Description

一种耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体来说，涉及一种耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基。
背景技术
当今中国耕地土壤存在以下6个方面的问题：(1)耕地质量下降，重金属、农药、劣质化肥污染；(2)土壤干旱、沙化、盐碱化、酸化严重；(3)普遍缺少有机质、中/微量元素；(4)50％以上的氮素损失，磷钾被固定未利用；(5)连茬种植作物，导致土传病害加重；(6)土壤肥力下降，微生物活性差，生产力下降，上述问题严重制约了中国绿色农业和生态农业的发展。
微生物肥料是符合农业绿色要求的投入品，微生物肥料的功能特点与国家可持续农业发展的目标相吻合，是国家战略的必然选择。微生物在农业生产中扮演多重角色，微生物是土壤的造就师，能产生代谢产物，改善土壤团粒结构，减轻土壤板结；微生物是土壤的清洁师，能保证土壤健康，能降解土壤肥料、农药、重金属等污染物，进行分解、转化、固定、转移及新的无害化合成；微生物是土壤的营养师，具有解磷、解钾、固氮的作用，促进土壤中微量元素的释放及螯合，提高肥料利用率；微生物是土壤的养分转化师，能活化土壤有机与无机养分，分解有机物、释放养分、增加养分的有效性；微生物是土壤的治疗师，能分泌抗生素，抑制病源微生物繁殖，防治和减少土传病害，对土壤进行“解毒”和“保健”。国家重视并支持微生物肥料的发展，将其列为生物产业、高新技术产业和战略性新兴产业。
耐寒短杆菌SDB5已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并已获得发明专利授权。保藏编号：CGMCC No.20136，保藏日期：2020年6月24日。耐寒短杆菌SDB5为杆状、革兰氏阳性菌，菌落长时间培养呈白色，具有耐盐碱条件且耐酸性条件，能耐受1mol/L的NaCl胁迫，在pH6-pH11的培养基上都能生长，菌株内IAA(生长素)含量为356.9ng/g，细胞分裂素主要是异戊烯基腺苷(iPR)和异戊烯基腺嘌呤(iP)，其含量分别为2.125ng/g和48.57ng/g，而反式玉米素类细胞分裂素含量很少；耐寒短杆菌SDB5能够显著促进植物生长，使植物根系发达，尤其是地上部分生物量增大。目前，用于培养耐寒短杆菌SDB5的主要是酵母粉、胰蛋白胨、分析纯氯化钠等价格昂贵的材料，生产成本较高且发酵密度较低，不利于相关产品的生产和应用，因此寻找价格低廉且养分含量充足的物料用于发酵生产，并不断提升发酵物中功能菌的数量，是迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中高密度发酵培养基的原料价格较高，传统培养基的发酵密度较低等不足，提供了一种专用于耐寒短杆菌SDB5的低成本高密度液体发酵培养基。
为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
耐寒短杆菌SDB5已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并已获得发明专利授权。保藏编号：CGMCC No.20136，保藏日期：2020年6月24日。
耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基中包括黄豆粉、磷虾粉、酵母膏、腌制粗盐和无机盐。
所述无机盐为MgSO4、K2HPO4和CaCO3。
耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基中包括6-9g/L黄豆粉、1-4g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L腌制粗盐、1.8g/L MgSO4、1.8g/L K2HPO4和1.2g/L CaCO3。
优选地，耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基中包括8g/L黄豆粉、2g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L腌制粗盐、1.8g/L MgSO4、1.8g/L K2HPO4和1.2g/L CaCO3。
本发明的有益效果在于：
本发明采用价格低廉的黄豆粉、磷虾粉、酵母膏作为碳氮源，通过进一步优化培养基中的无机盐组分，缩短发酵周期，使最终发酵液中的活菌含量达到3.42×108CFU/mL，有效解决了传统发酵过程中存在的生物量低、发酵周期长、生产成本高等缺点，便于加工相关产品，有利于大规模推广应用，使得耐寒短杆菌SDB5菌剂能够作为生物肥料广泛的应用于农业生产中。本液体发酵培养基安全无毒，能够有效提高养分利用效率、显著促进植物生长，可以辅助化肥减量、提高作物产量、改善作物品质。
具体实施方式
下面将对本发明做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基中包括黄豆粉、磷虾粉、酵母膏、腌制粗盐和无机盐。其中，无机盐为MgSO4、K2HPO4和CaCO3。
耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基中包括6-9g/L黄豆粉、1-4g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L腌制粗盐、1.8g/L MgSO4、1.8g/L K2HPO4和1.2g/L CaCO3。
优选地，耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基中包括8g/L黄豆粉、2g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L腌制粗盐、1.8g/L MgSO4、1.8g/L K2HPO4和1.2g/L CaCO3。
实施例1：耐寒短杆菌SDB5的培养基优化
将酵母提取物置换为酵母膏、NaCl置换为腌制粗盐(主要成分为氯化钠)，在此基础之上，进行单因素替换实验。本实验以LB培养基为对照组，其成分为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl。
1.1单因素影响
(1)腌制粗盐代替分析纯氯化钠实验
实验组：蛋白胨培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L粗盐。细菌培养条件一致。利用分光光度计对不同培养时间的菌液进行OD600值测定，检测菌液中菌体含量，以此判断细菌生长情况，实验结果如表1所示。
表1不同培养时间菌液OD600值
由表1得知，实验组的生长曲线略高于对照组，表明实验组的细菌活性更好，培养基成分替换的效果表明实验思路可行，由于后面的替换培养基成分会产生较多的沉淀，考虑到会影响紫外分光光度计的透光率，将实验改为滴板实验来反应细菌生长速度。
(2)滴板实验
各个滴板实验的培养基成分组成如表2所示。由实验结果得知，黄豆粉培养基与磷虾粉培养基上的SDB5菌落面积最大，表明二者的培育效果并不低于LB培养基。因此，单因素影响目标菌株生长最大的为黄豆粉与磷虾粉，在此基础之上，再将二者进行比例实验。
表2各培养基成分表(单位：g/L)
(3)黄豆粉、磷虾粉比例实验
黄豆粉、磷虾粉在培养基中的比例如表3所示。由滴板实验结果得知，B号实验组的菌落大于其余实验组的菌落，效果较为显著，初步可以判断为黄豆粉与虾粉比例为4∶1时，效果最好。由48h后的滴板实验结果得知，B号实验组的效果为最优。综上得出结论，根据B号实验组的组合培养的菌落面积最大，最适宜SDB5菌生长。最适宜SDB5菌生长的培养基成分为：8g/L黄豆粉、2g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L粗盐。在此基础之上，再加入无机盐进行实验，确定最终配方。
表3黄豆粉磷虾粉比例实验设计表(单位：g/L)
1.2无机盐影响
拟加入MgSO4、K2HPO4、KH2PO4和CaCO3进行实验，配制培养基的比例如表4所示。由滴板实验结果得知，加入无机盐后的功能菌株菌落均大于对照组，可以说明，无机盐对SDB5菌的影响较大。由48h后的滴板实验结果得知，除KH2PO4外，MgSO4、K2HPO4和CaCO3均对目标菌株产生显著影响。通过无机盐实验观察72h后，可以得出对SDB5菌效果最好的无机盐为：MgSO4、K2HPO4和CaCO3，加入这三种无机盐的菌落显著增大，生长情况良好。在此基础之上，进行正交设计，得出最适宜的无机盐比例，进而确定最终的培养基配方。
表4无机盐成分实验设计表(单位：g/L)
1.3无机盐正交设计
用正交实验进一步优化培养基配方。以MgSO4、K2HPO4和CaCO3为三因素，每个因素设置三个水平，设计L9(33)的正交实验，如表5和表6所示。
由表6中的R值得知，影响SDB9活菌数最大的无机盐为MgSO4，其次是CaCO3，最后是K2HPO4。综上，SDB5培养基最优无机盐组合为9号实验，即：8g/L黄豆粉、2g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L粗盐、1.8g/LMgSO4、1.8g/L K2HPO4和1.2g/L CaCO3。
表5无机盐正交实验设计表(单位：g/L)
表6 SDB5无机盐正交实验分析表
实施例2：氯化钠去除实验
在最适宜SDB5菌的培养基中去除粗盐，直接加入无机盐进行对比实验，如表7所示。对照组为LB培养基(编号为4)，在平板计数实验结果表中展示结果，如表8所示。由表8得知，NaCl对于SDB5菌有显著影响，不可直接由无机盐代替，否则会减弱菌株的生长能力，进而降低发酵液中的菌体含量。
表7平板计数实验设计表(单位：g/L)
表8平板计数实验结果表
实施例3：最佳培养基组成及平板计数实验
综合以上实验结果可知，最适合耐寒短杆菌SDB5的专用低成本高密度液体发酵培养基的成分为：8g/L黄豆粉、2g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L腌制粗盐、1.8g/L MgSO4、1.8g/L K2HPO4和1.2g/L CaCO3。利用该培养基进行了发酵实验，对照组为LB培养基，发酵条件一致。结果表明：对照组发酵液中的耐寒短杆菌SDB5活菌含量为0.8×108CFU/mL，而最优培养基发酵液中的耐寒短杆菌SDB5活菌含量为3.42×108CFU/mL，最优培养基的发酵效果比对照组提高约4.3倍，效果良好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，这些具体实施方式都是基于本发明整体构思下的不同实现方式，而且本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基，其特征在于：
所述液体发酵培养基中包括黄豆粉、磷虾粉、酵母膏、腌制粗盐和无机盐；
所述液体发酵培养基中包括6-9g/L黄豆粉、1-4g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L腌制粗盐、1.8g/L MgSO4、1.8g/L K2HPO4和1.2g/L CaCO3；
所述耐寒短杆菌SDB5已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.20136，保藏日期：2020年6月24日。
2.根据权利要求1所述的耐寒短杆菌SDB5的液体发酵培养基，其特征在于：
所述液体发酵培养基中包括8g/L黄豆粉、2g/L磷虾粉、5g/L酵母膏、10g/L腌制粗盐、1.8g/L MgSO4、1.8g/L K2HPO4和1.2g/L CaCO3。
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