CN110938582A - 一种可提高细胞增殖活性的培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种可提高细胞增殖活性的培养基，所述培养基是在基础培养基中加入细胞增殖活性组合物溶液配制而成，所述细胞增殖活性组合物由马齿笕提取物和茵陈提取物组成，所述细胞增殖活性组合物溶液是将马齿笕提取物和茵陈提取物溶于磷酸缓冲盐溶液中制备而成。本发明提供的培养基不仅具有刺激细胞增殖的功效，而且在不添加双抗的基础上还能有效减少细胞污染率。

Description

一种可提高细胞增殖活性的培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种可提高细胞增殖活性的培养基。

背景技术

生物体的生理功能及一切生命现象都是以细胞为基本单位而表达的，任何生物现象无不来自细胞的功能，所以生物学的所有领域几乎都与细胞学有关。因此，不论对生物体的遗传、发育以及生理机能的了解，还是对于作为医疗基础的病理学、药理学等以及农业的育种等，对细胞的研究都至关重要。通常在进行生物学研究之前，细胞培养是最先进行的实验操作，虽然细胞培养技术非常基础，但对后续研究起到非常重要的支撑作用。在细胞培养中，细胞培养基是影响细胞生长及增殖的重要因素。

细胞培养基(cell culture medium)是人工模拟动物细胞的体内生长环境，维持体外细胞存活和增殖的营养物质基础，其主要功能是为细胞提供适宜的pH和渗透压，以及细胞本身不能合成的各种营养物质。绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。应用最广泛的培养基是Eearle’s MEM的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。目前市售的培养基主要有DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12等，都是应用最广泛的培养基。

细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态，基础培养基在使用前通常需要添加血清，血清终浓度为5-20％之间。很多实验室在培养基中常规加入抗生素防止细胞污染，最常用的双抗分别是青霉素(常用浓度是25-100U/mL)与链霉素(250-100μg/mL)的组合，但可能会造成细胞生长环境不稳定，对细胞增殖带来不利影响。

专利文献201910902322.8公开了一种简单易制的光合细菌培养基及其制备方法，每升培养基包括以下成分：氮磷钾复合肥1.0-2.0g、食盐或粗盐4.0-8.0g、味精0.3-0.5g、红糖0.1-0.5g、复合维生素B 0.01-0.03g、酒精75-100mL、补充水至1L。所述培养基虽然原料易得，但是对于细胞培养来说营养成分单一，不具有促进细胞增殖的功效。

专利文献201610977137.1公开了一种用于细胞培养的培养基，所述培养基包括基础培养基和非必需氨基酸，具体配方是使用DMEMF12+非必需氨基酸+L-谷氨酰胺，营养更加丰富，为细胞合成各种活性蛋白提供更丰富广泛的来源，提高了蛋白获得量。但是培养基营养丰富并不能说明一定会刺激细胞增殖，有时营养过剩会对细胞增长造成不利影响。

发明内容

为了克服现有技术缺陷，本发明提供一种能提高细胞增殖活性的培养基，所述培养基不仅具有刺激细胞增殖的功效，而且在不添加双抗的基础上还能有效减少细胞污染率。

经过长期试验，发明人发现在培养基中添加一定比例的特定植物的提取物能有效刺激细胞增殖，而且能有效降低细胞污染概率。经过筛选和对比实验，发明人发现马齿笕提取物和茵陈提取物按照一定比例混合后加入培养基中细胞增殖效果最好。

马齿苋作为一种常见的药食两用植物，被广泛的应用在医疗、日化、保健食品中。马齿苋是马齿苋科马齿苋属一年生肉质草本植物，因其叶青、梗赤、花黄、根白、子黑又称为五行草或五行菜。我国药典收载马齿苋地上部分作为药用，具有清热解毒、凉血止血的功效，可以用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒等，富含生物碱、有机酸、萜类、黄酮等成分，其中也含有去甲肾上腺素和多巴胺等激素类成分。目前，马齿苋作为蔬菜在全世界范围内被广泛种植，而且马齿苋提取物因其良好的生物学特性和安全性被广泛开发利用，在许多化妆品中将其作为抗炎舒敏的成分进行添加。

茵陈是菊科植物滨蒿或茵陈蒿，具有清热利湿、退黄功效，用于治疗黄疸、小便不利、湿疮瘙痒、传染性黄疸型肝炎等疾病，药理学研究表明茵陈具有利胆、保护肝功能、解热、抗炎、降血脂、降压、扩冠等作用。茵陈提取物为春季采收的植株地上部分经干燥、提取后的产物。经过对茵陈提取物的质谱分析和标准品比对，茵陈提取物中主要含有有机酸类等成分，包括新绿原酸、3-甲基-4-羟基-肉桂酸、绿原酸、隐绿原酸、异槲皮苷和对羟基苯乙酮。其中，现有研究发现绿原酸和对羟基苯乙酮具有利胆作用。

检索发现，现有技术中并没有关于马齿笕和茵陈的组合物，或马齿笕和茵陈提取物的组合物用于细胞培养基的披露。

本发明的一个目的是提供一种可提高细胞增殖活性的培养基及其制备方法，本发明另一个目的是提供一种具有细胞增殖活性的组合物。

第一方面，本发明提供一种可提高细胞增殖活性的培养基，所述培养基是在基础培养基中加入细胞增殖活性组合物溶液配制而成，所述细胞增殖活性组合物由马齿笕提取物和茵陈提取物组成，所述马齿笕提取物与茵陈提取物质量比为5-20:1。

优选的，所述马齿笕提取物与茵陈提取物质量比为10-20:1。

优选的，所述细胞增殖活性组合物溶液是将马齿笕提取物和茵陈提取物溶于磷酸缓冲盐溶液中制备而成，其中，马齿笕提取物浓度为0.2-1mg/mL，茵陈提取物浓度为50-200μg/mL。

优选的，所述培养基中细胞增殖活性组合物溶液体积浓度为0.5-5％，更优选的，细胞增殖活性组合物溶液体积浓度为0.5-2％。

本发明所述的基础培养基是在常规培养基基础上加入添加剂制备得到，所述常规培养基为DMEM、RPMI 1640(1640)、MEM、IMDM或DMEM/F12等，所述添加剂选自血清、非必须氨基酸、丙酮酸钠、β-巯基乙醇中的一种或两种以上的组合。

所述血清的主要作用为微生物的生长提供了生长因子的作用，促进细胞的生长，在本发明提供的一个实施例中，所述血清为胎牛血清。

在本发明中，所述基础培养基由1640培养基或DMEM培养基中添加胎牛血清配制而成，在所述基础培养基中，胎牛血清体积浓度为10％。

优选的，所述基础培养基中还包括丙酮酸钠、非必须氨基酸、β-巯基乙醇中的一种或两种以上的组合，其中，丙酮酸钠摩尔浓度为1mM、非必须氨基酸摩尔浓度为0.1mM、β-巯基乙醇摩尔浓度为50μM。

本发明所述的基础培养基中还可以含有双抗，其中，基础培养基中青霉素浓度为100U/mL、链霉素浓度为100μg/mL。

在本发明的一个优选实施方式中，所述基础培养基由DMEM培养基中添加胎牛血清配制而成，胎牛血清体积浓度为10％。

在本发明的一个优选实施方式中，所述基础培养基由1640培养基中添加胎牛血清配制而成，胎牛血清体积浓度为10％。

在本发明的一个优选实施方式中，所述基础培养基由1640培养基中添加胎牛血清、丙酮酸钠、非必须氨基酸、β-巯基乙醇配制而成，胎牛血清体积浓度为10％、丙酮酸钠摩尔浓度为1mM、非必须氨基酸摩尔浓度为0.1mM、β-巯基乙醇摩尔浓度为50μM。

第二方面，本发明提供一种可提高细胞增殖活性的培养基的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备基础培养基，在常规培养基中加入添加剂制备得到，所述添加剂选自血清、非必须氨基酸、丙酮酸钠、β-巯基乙醇中的一种或两种以上的组合；

(2)制备细胞增殖活性组合物溶液，将马齿笕提取物与茵陈提取物按照质量比为5-20:1溶于磷酸缓冲盐溶液中制备而成；

(3)将细胞增殖活性组合物溶液加入基础培养基中，摇匀，所述培养基中细胞增殖活性组合物溶液体积浓度为0.5-5％。

所述步骤(1)中常规培养基为常用的任何一种培养基，可自行配制或通过商业途径购买得到，具体如DMEM、RPMI 1640(1640)、MEM、IMDM或DMEM/F12等。

所述步骤(2)还包括将溶液通过0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌操作。

所述步骤(3)还包括将最终制备的培养基进行高温蒸汽灭菌。

第三方面，本发明提供一种具有细胞增殖活性的组合物，所述组合物由马齿笕提取物和茵陈提取物组成，所述马齿笕提取物与茵陈提取物质量比为5-20:1。

优选的，所述马齿笕提取物与茵陈提取物质量比为10-20:1。

在本发明的最优选实施方式中，所述马齿笕提取物与茵陈提取物质量比为10:1。

第四方面，本发明提供一种具有细胞增殖活性的组合物溶液，所述溶液是将马齿笕提取物和茵陈提取物溶于磷酸缓冲盐溶液中制备而成，其中，马齿笕提取物浓度为0.2-1mg/mL，茵陈提取物浓度为50-200μg/mL。

本发明所述的马齿笕提取物、茵陈提取物可自行提取或通过商购途径购买得到。

本发明实施例中使用的马齿笕提取物通过如下制备方法提取得到：

(1)将马齿苋除去杂质，洗净，阴干后粉碎，过50-100目筛网，称重得原料粉末；

(2)进行连续逆流提取得到提取液；

(3)将提取液进行絮凝沉淀得到澄清液；

(4)将澄清液进行超滤除杂得到超滤透过液；

(5)将超滤透过液进行冷冻干燥得到马齿笕提取物。

优选的，所述步骤(2)具体为将马齿笕粉末加水润湿均匀，用溶剂进行连续逆流提取1-3小时，得到提取液，所述溶剂选自甲醇/水混合液、乙醇/水混合液、1,3-丁二醇/水混合液中的一种或两种混合后配制成的溶剂。

优选的，马齿笕粉末润湿后含水率为30-50％，连续逆流提取温度为30-60℃。

优选的，所述步骤(3)絮凝沉淀具体为在提取液加入质量分数为3％的聚合氯化铝，搅拌1-2小时，加入质量分数为0.1％聚丙烯酰胺后搅拌20-30分钟，静置分层得到澄清液和固态混合物，过滤回收澄清液。

所述步骤(3)还包括向回收的澄清液中加入活性炭与活性白土的复配脱色剂，在室温下脱色20-40分钟，用陶瓷膜过滤掉活性炭。

所述步骤(4)超滤除杂目的是去除澄清液中的胶体和大分子杂质，微孔膜的孔径范围选自1-10μm。

本发明实施例中使用的茵陈提取物通过如下制备方法提取得到：

(1)将茵陈除去杂质，洗净，阴干后粉碎，过50-100目筛网得到原料粉末；

(2)用溶剂加热回流提取2-4次，合并提取液，浓缩得到浓缩液，加3-5倍体积的水稀释；

(3)用石油醚进行萃取，静置，回收下层水相；

(4)得到的水相采用AB-8型大孔树脂柱进行吸附，以2-6倍体积的10-30％乙醇洗脱，再以6-10倍体积的50-70％乙醇溶液洗脱，收集50-70％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到茵陈提取物。

优选的，所述步骤(2)使用的溶剂为甲醇、乙醇、氯仿或乙腈，更优选的，所述溶剂为乙醇，所述乙醇浓度为60-95％(v/v，具体如60％、70％、80％、90％或95％)。

本发明的优势在于，在原有基础培养的基础上加入马齿笕和茵陈提取物溶液能加快所培养细胞的增殖速度，另一方面，马齿笕和茵陈提取物溶液能有效抑制细胞感染，能全部或部分替代双抗的作用，而且马齿笕和茵陈提取物溶液的加入有利于细胞增长稳定性。

附图说明

图1细胞培养基对细胞毒性实验结果图

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中使用的1640培养基、DMEM(低糖)培养基、青霉素-链霉素(P-S)双抗、胎牛血清(fetal calf serum，FCS)均购自北京索莱宝科技有限公司；参与实验的RAW巨噬细胞购自ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA)；主要仪器有超净工作台、CO₂恒温细胞培养箱、Beckman coulter台式冷冻离心机、FACSCalibur流式细胞仪、WellscanMK3酶标仪。

制备例1马齿笕提取物的制备

S1：将干燥马齿苋茎叶部除去杂质，洗净，干燥后粉碎，避免阳光暴晒，过50目筛网，称重取原料粉末100g，烘干干燥至恒重；

S2：将马齿笕粉末加水润湿均匀，使粉末含水率为35％，用甲醇/水＝3:1混合液进行连续逆流提取1小时，提取温度60℃，得到提取液；

S3：向上步得到的提取液中加入质量分数为3％的聚合氯化铝，搅拌1小时，加入质量分数为0.1％聚丙烯酰胺后搅拌20分钟，静置分层得到澄清液和固态混合物，过滤回收澄清液；

S4：向上步得到的澄清液中加入活性炭与活性白土的复配脱色剂(质量比为1:1)，在室温下脱色40分钟，用陶瓷膜过滤掉活性炭；

S5：将脱色后的澄清液进行超滤除杂，微孔膜的孔径为10μm，得到超滤透过液；

S6：将超滤透过液进行冷冻干燥得到马齿笕提取物4.7g。

制备例2茵陈提取物的制备

S1：将茵陈除去杂质，洗净，阴干后粉碎，过100目筛网，称取原料粉末200g；

S2：用浓度为70％的乙醇加热回流提取3次，合并提取液，浓缩得到浓缩液，加3倍体积的水稀释；

S3：用石油醚进行萃取，静置分层后回收下层水相；

S4：得到的水相采用AB-8型大孔树脂柱进行吸附，以2倍体积的10％乙醇洗脱，再以2倍体积的30％乙醇洗脱，再用6倍体积的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩；

S5：将上步得到的茵陈提取物减压浓缩液体进行冷冻干燥，称重，得到5.3g茵陈提取物。

实施例1组合物溶液1的制备

取马齿笕提取物10mg，茵陈提取物0.5mg，加入到10mL磷酸缓冲盐溶液中，充分摇匀，将溶液通过0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，4℃保存备用。所述溶液中马齿笕提取物浓度为1mg/mL，茵陈提取物浓度为50μg/mL。

实施例2组合物溶液2的制备

取马齿笕提取物10mg，茵陈提取物1mg，加入到10mL磷酸缓冲盐溶液中，充分摇匀，将溶液通过0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，4℃保存备用。所述溶液中马齿笕提取物浓度为1mg/mL，茵陈提取物浓度为100μg/mL。

实施例3组合物溶液3的制备

取马齿笕提取物10mg，茵陈提取物1.5mg，加入到10mL磷酸缓冲盐溶液中，充分摇匀，将溶液通过0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，4℃保存备用。所述溶液中马齿笕提取物浓度为1mg/mL，茵陈提取物浓度为150μg/mL。

实施例4组合物溶液4的制备

取马齿笕提取物10mg，茵陈提取物2mg，加入到10mL磷酸缓冲盐溶液中，充分摇匀，将溶液通过0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，4℃保存备用。所述溶液中马齿笕提取物浓度为1mg/mL，茵陈提取物浓度为200μg/mL。

实施例5培养基1的制备

在无菌操作台中，向1640培养基(90mL)中添加胎牛血清10mL，充分震荡摇匀，配制成基础培养基；向基础培养基中加入实施例1制备的组合物溶液1mL，摇匀，高温蒸汽灭菌后备用。

实施例6培养基2的制备

在无菌操作台中，向1640培养基(90mL)中添加胎牛血清10mL，丙酮酸钠11mg、3％谷氨酰胺(用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌)1mL、β-巯基乙醇0.39mg，充分震荡摇匀，配制成基础培养基；向基础培养基中加入实施例2制备的组合物溶液2mL，摇匀，高温蒸汽灭菌后备用。。

实施例7培养基3的制备

在无菌操作台中，向DMEM低糖培养基(90mL)中添加胎牛血清10mL，充分震荡摇匀，配制成基础培养基；向基础培养基中加入实施例1制备的组合物溶液5mL，摇匀，高温蒸汽灭菌后备用。

实施例8培养基4的制备

在无菌操作台中，向DMEM低糖培养基(90mL)中添加胎牛血清10mL、100×双抗(青霉素+链霉素)1mL，充分震荡摇匀，配制成基础培养基；向基础培养基中加入实施例1制备的组合物溶液1mL，摇匀，高温蒸汽灭菌后备用。

本发明制备的培养基质量检测

对实施例5-8制备的培养基进行质量检测，具体检测参数及检测方法如下，除非另有说明，检验中仅使用确认为分析纯的试剂和中华人民共和国药典2010年版中规定的纯化水。

1，澄清度的测定

称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水950mL，搅拌至溶解，补加水至1000mL，搅拌均匀，按照中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨB进行。

2，pH值的测定

称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水950mL，搅拌至溶解，补加水至1000mL，搅拌均匀，按照中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅤA进行。

3，渗透压的测定

称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水950mL，搅拌至溶解，补加水至1000mL，搅拌均匀，按照中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅤH渗透压摩尔浓度测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5％。

4，细菌内毒素的测定

按照中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅫE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。

5，微生物限度的测定

按照中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅫG微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数，检查法采用平皿法。

检测结果如下表所示：

表1培养基质量检测结果

通过上表培养基质量检测结果可以看出，在基础培养基中添加一定浓度马齿笕提取物与茵陈提取物组合物溶液对培养基的质量性能参数没有影响，本发明制备的培养基符合细胞培养基检测质量标准。如上表所示，当马齿笕提取物与茵陈提取物组合物溶液的体积浓度为1-5％时，制备的培养基pH值和渗透压等参数均没有受到不利影响。

效果例1培养基对细胞增殖率影响

将冻存RAW细胞的冻存管从液氮罐中取出后迅速放入37℃水浴箱中震荡，使其快速溶解，为了避免在冻存细胞时加入的DMSO影响细胞生长，将溶解的细胞液转入提前加有新鲜培养基的离心管中，放入离心机中1000rpm/min离心5min，取出后弃掉上清，将细胞转入培养瓶中，加入DMEM低糖培养基，摇匀，在37℃，含5％CO₂的培养箱中常规培养，每2天传代1次，于细胞生长活力良好时使用。

将生长状况良好的RAW细胞分别置于6组培养瓶中，每组5个，分别标记为A、B、C、D、E、F组，分别用不同培养基进行悬浮培养，置于37℃，5％CO₂恒温细胞培养箱中进行悬浮培养，于24h后收集细胞及上清备用。本实验使用的培养基成分如下表所示：

表2培养基成分

组别	基础培养基	组合物溶液
			A组	DMEM低糖培养基89mL+胎牛血清10mL	组合物溶液1 1mL
B组	DMEM低糖培养基89mL+胎牛血清10mL	组合物溶液2 1mL
			C组	DMEM低糖培养基89mL+胎牛血清10mL	组合物溶液3 1mL
D组	DMEM低糖培养基89mL+胎牛血清10mL	组合物溶液4 1mL
			E组	DMEM低糖培养基89mL+胎牛血清10mL	100×双抗(青霉素+链霉素)1mL
F组	DMEM低糖培养基90mL+胎牛血清10mL	无

收集的RAW细胞分别用对应的培养基重悬至1×10⁹cells/L，取0.5mL并加入2mL75％冻乙醇，4℃过夜，1200r/min离心5min，弃上清。PBS洗涤2次，后加入50μL RNase(5g/L)和450μL PI染料(50mg/L)，4℃避光放置30min，用流式细胞仪于492nm波长处检测。

G₀、G₁、S、G₂、M期为细胞生长5个周期，G₀/G ₁期为DNA合成前期，S期为DNA合成期，G₂/M期为有丝分裂期。细胞增殖指数计算方式为PI＝(S+G₂/M)/(G₀/G₁+S+G₂/M)×100％，指S期+G₂/M期细胞数占总细胞数的比例。本申请制备的不同培养基对应的细胞增殖指数如下表所示，并统计细胞培养期间发生污染的情况。

表3细胞增殖指数结果

经过分析和对比上表各组数据发现，与空白对照F组相比，A组和B组细胞增殖率最高，尤其是B组，细胞增殖率达到39％，说明在基础培养基相同且组合物溶液体积分数相同的情况下，当马齿笕提取物与茵陈提取物的浓度比为20:1或10:1时对细胞增殖的刺激作用最好，其中10:1是最佳比例。E组是添加双抗的培养基，与空白对照相比，添加双抗影响了细胞增殖率。分析细胞污染情况可以发现，添加双抗和组合物溶液的培养基都没有发生污染，空白对照有2瓶发生污染，说明组合物溶液的加入能有效抑制细胞培养基的污染发生。

效果例2培养基对细胞毒性影响

将生长状况良好的RAW细胞分别置于6个培养瓶中，分别标记为A、B、C、D、E、F，分别用不同培养基进行悬浮培养，置于37℃，5％CO₂恒温细胞培养箱中进行悬浮培养，每2天传代1次，4天后进行MTT实验。本实验使用的培养基成分如下表所示：

表4培养基成分

组别	基础培养基	组合物溶液	占比
				A组	DMEM低糖培养基89.5mL+胎牛血清10mL	组合物溶液1 0.5mL	0.5％
B组	DMEM低糖培养基89mL+胎牛血清10mL	组合物溶液1 1mL	1％
				C组	DMEM低糖培养基88mL+胎牛血清10mL	组合物溶液1 2mL	2％
D组	DMEM低糖培养基85mL+胎牛血清10mL	组合物溶液1 5mL	5％
				E组	DMEM低糖培养基80mL+胎牛血清10mL	组合物溶液1 10mL	10％
F组	DMEM低糖培养基70mL+胎牛血清10mL	组合物溶液1 20mL	20％

MTT实验步骤：1，设计对照孔和调零孔的位置和数量，为了避免因为水分蒸发造成浓度改变后影响实验结果，在96孔板外缘一周每孔加入200μL无菌PBS。将上述培养的RAW细胞分别分散对应的培养基中制成单细胞悬液，在显微镜下进行细胞计数，以每孔5000左右个细胞将RAW细胞接种到96孔板上，每孔体积200μL，放入37℃，含5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养24h；2，细胞培养24h后用移液枪将每孔旧培养基吸出，分别再加入对应的培养基，对照孔和调零孔加新鲜培养基；3，小心称取MTT用无菌PBS配制成浓度为5mg/mL的溶液，24h后取出96孔板，每孔加入20μL MTT溶液，在培养箱中孵育4h，用无菌注射器将旧培养基吸出，再每孔加入150μL DMSO，孵育10min。4，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值A，记录结果。

通过公式：细胞活力＝(实验组A值-调零孔A值)/(对照孔A值-调零孔A值)计算出不同培养基培养下实验细胞的细胞活力，间接反映培养基对细胞的毒性作用，实验结果如图1所示。

在组合物溶液中马齿笕提取物与茵陈提取物浓度比例固定的前提下，改变组合物溶液的加入量会对培养细胞的活力产生影响。根据图中数据可以看出，当组合物溶液的体积浓度为0.5-5％时，细胞活力均较好，达到96％以上，随着组合物溶液加入量的增大，细胞活力逐渐降低，当组合物溶液体积浓度增加到20％时，细胞活力下降到70％左右。综上，本申请制备的培养基中，组合物溶液的体积浓度优选0.5-5％，最优选0.5-2％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种可提高细胞增殖活性的培养基，所述培养基是在基础培养基中加入细胞增殖活性组合物溶液配制而成，所述细胞增殖活性组合物由马齿笕提取物和茵陈提取物组成，所述马齿笕提取物与茵陈提取物质量比为5-20:1；

所述的基础培养基是在常规培养基基础上加入添加剂制备得到，所述常规培养基为DMEM、RPMI 1640、MEM、IMDM或DMEM/F12，所述添加剂选自血清、非必须氨基酸、丙酮酸钠、β-巯基乙醇中的一种或两种以上的组合。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基由1640培养基或DMEM培养基中添加胎牛血清配制而成，在所述基础培养基中，胎牛血清体积浓度为10％，所述培养基中马齿笕提取物与茵陈提取物质量比为10-20:1。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基中还包括丙酮酸钠、非必须氨基酸、β-巯基乙醇中的一种或两种以上的组合，其中，丙酮酸钠摩尔浓度为1mM、非必须氨基酸摩尔浓度为0.1mM、β-巯基乙醇摩尔浓度为50μM。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述细胞增殖活性组合物溶液是将马齿笕提取物和茵陈提取物溶于磷酸缓冲盐溶液中制备而成，其中，马齿笕提取物浓度为0.2-1mg/mL，茵陈提取物浓度为50-200μg/mL。

5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中细胞增殖活性组合物溶液体积浓度为0.5-5％。

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述细胞增殖活性组合物溶液体积浓度为0.5-2％。

7.一种权利要求1-6任一所述的可提高细胞增殖活性的培养基的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备基础培养基，在常规培养基中加入添加剂制备得到，所述添加剂选自血清、非必须氨基酸、丙酮酸钠、β-巯基乙醇中的一种或两种以上的组合；

(2)制备细胞增殖活性组合物溶液，将马齿笕提取物与茵陈提取物按照质量比为5-20:1溶于磷酸缓冲盐溶液中制备而成；

(3)将细胞增殖活性组合物溶液加入基础培养基中，摇匀，所述培养基中细胞增殖活性组合物溶液体积浓度为0.5-5％。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中常规培养基为常用的任何一种培养基，如DMEM、RPMI 1640(1640)、MEM、IMDM或DMEM/F12；步骤(2)还包括将溶液通过0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌操作；步骤(3)还包括将最终制备的培养基进行高温蒸汽灭菌。

9.一种具有细胞增殖活性的组合物溶液，所述溶液是将马齿笕提取物和茵陈提取物溶于磷酸缓冲盐溶液中制备而成，其中，马齿笕提取物浓度为0.2-1mg/mL，茵陈提取物浓度为50-200μg/mL。

10.一种具有细胞增殖活性的组合物，所述组合物由马齿笕提取物和茵陈提取物组成，所述马齿笕提取物与茵陈提取物质量比为10:1。

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