CN111393537A - 一种海参中生物活性物质的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种海参中生物活性物质的提取方法，包含原材料预处理、溶剂提取、亲脂溶剂除脂、油脂回收、正丁醇萃取、树脂富集纯化、除醇酶解、灭酶、离心除杂、粗多糖沉淀、离心分离、超滤纯化、活性炭吸附脱色、纳滤除盐工艺过程。本发明通过一套完整的工艺从海参中提取分离了海参多糖、海参皂苷、海参脂质及海参多肽，解决了现有技术中无法同时分离提取四种成分的问题。与现有工艺相比，本发明不仅降低了海参原料的损耗，而且提高了收率和提取物纯度，本发明提供的方法严谨科学，操作性较强，易于实现工业化，为后续海参高效综合利用提供了新的制备方法。

Description

一种海参中生物活性物质的提取方法
技术领域
本发明属于生物提取领域，具体涉及一种海参中生物活性物质的提取方法。
背景技术
海参(Sea cucumber)属于棘皮动物门、海参纲，其生存已有5000万年之久，广泛分布于世界各大海洋中，全球现有海参1100种，我国约100多种。海参不仅美味可口，而且药物营养价值极高，是传统的滋补佳品。海参于明代后收入本草，列为补益药。《本草纲目拾遗》中药籍记载“海参性温补，足抵人参，顾名海参；味甘咸，补肾经，益精髓，消痰炎，摄小便，壮阳疗疾，杀疮虫”。
大量研究发现，海参中含有海参多糖、海参蛋白、海参皂苷、海参脂质等多种活性物质，每种组分都有其特殊的功效。海参黏多糖，是海参体壁中重要功能成分，其含量最高可占干海参有机物的31％，现代药理学研究表明：海参黏多糖有多种药理活性，包括抗肿瘤、免疫调节、抗凝血与降血脂等作用；海参蛋白，主要为海参胶原蛋白，含量达到55％以上，集中在海参体壁中，这种蛋白在营养成分上可以与中药阿胶、鹿角相媲美，通过分子生物酶技术将海参胶原蛋白转变为小分子活性肽，在保留蛋白营养成分的同时提高了蛋白吸收率；海参素，又称海参皂苷，多为三萜皂苷，主要集中在海参的体壁、内脏和腺体等组织中，能够抑制某些癌细胞生长，同时具有很强的抗菌作用，可以阻断神经传导，对于中风引起的痉挛性麻痹有治疗作用；海参脂质，主要以磷脂成分为主，其中人体必需多不饱和脂肪酸花生四烯酸和EPA占据脂质成分的40％以上，具有调节脂质代谢，抑制血小板凝聚，减少血栓形成等作用。
海参活性物质提取物是海参中的高精产品，每种提取物都具有其特殊的功效，可以根据适宜人群开发高效利用型海参功能性食品，比传统方法单独食用海参利用率提高数倍。现有海参提取工艺以酶解为主，提取物纯度低，多为多肽、多糖、脂质及皂苷等混合物，没有实现活性物质成分有效分离，无法进一步开发特种海参食品。现有海参纯品成分提取工艺过程复杂繁琐，致原料损耗大、提取物收率低，考虑到食品开发成本，很难实现工业化。
发明内容
本发明的目的是提供一种海参中生物活性物质的提取方法，通过一套完整的工艺提取出海参多糖、海参皂苷、海参脂质及海参多肽，解决了现有工艺提取过程中海参原料损耗大，提取产物纯度不高，难实现工业化的缺点。
为了实现上述目的，本发明提供了一下技术方案：
一种海参中生物活性物质的提取方法，所述方法包括以下步骤：
(1)、原料预处理：取新鲜海参清洗去除内脏，剪碎后打成碎渣，研磨成海参浆；
(2)、溶剂提取：向海参浆中加入乙醇水溶液，加热回流，得到乙醇提取液和固体；
(3)、亲脂溶剂除脂：将乙醇提取液浓缩至干，加水溶解，用亲脂溶剂萃取，得到脱脂水溶液层与亲脂溶剂层；
(4)、脂质回收：将亲脂溶剂层减压蒸干，得到海参脂质；
(5)、正丁醇萃取：用氨水调节脱脂水溶液层pH，加入饱和正丁醇，充分振荡，静止分层，收集上层正丁醇层，得到正丁醇萃取液，浓缩至干，得粗皂苷粉末；
(6)、树脂富集纯化：将粗皂苷粉末溶于水，用树脂吸附，乙醇水溶液洗脱，将洗脱液浓缩至干，得海参皂苷；
(7)、除醇酶解：将步骤(2)所得固体，用水冲洗至无乙醇味，加入缓冲液，然后依次加入木瓜蛋白酶、乙二胺四乙酸和半胱氨酸盐酸盐，混合均匀，酶解，得到酶解液；
(8)、灭酶：将酶解液进行灭酶，冷却至室温，得到冷却灭酶料液；
(9)、离心除杂：将冷却灭酶料液离心，弃去滤渣，收集上清液；
(10)、粗多糖沉淀：向步骤(9)的上清液中加入多糖沉淀剂，静止，得到静止分层物料；
(11)、离心分离：将静止分层物料离心分离，上清液为海参粗多肽溶液，下层沉淀物为海参粗多糖；
(12)、超滤纯化：加水复溶海参粗多糖，进行超滤，得到透过液和浓缩液；
(13)、活性炭吸附脱色：将浓缩液加入活性炭，得脱色液，过滤，洗涤滤渣，得洗涤液，合并脱色液与洗涤液，干燥得到海参多糖；
(14)、纳滤除盐：将步骤(11)所得上清液与步骤(12)所得透过液合并，进行纳滤，收集浓缩液干燥得到海参多肽。
进一步的，所述步骤(2)中海参浆和乙醇水溶液的料液比为1∶2～5g/mL，乙醇水溶液的体积分数为50％-90％。
进一步的，所述步骤(3)中亲脂溶剂为石油醚、乙酸乙酯、苯或乙醚。
进一步的，所述步骤(5)中氨水调节pH值为7.5～8.5。
进一步的，所述步骤(6)中的树脂为弱极性大孔树脂，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50％-90％。
进一步的，所述步骤(7)中缓冲液为乙酸钠-乙酸缓冲液，固体与乙酸钠-乙酸缓冲液的料液比为1∶10～50g/mL，
进一步的，所述步骤(7)中木瓜蛋白酶加入量为海参中粗蛋白含量的1.0％-3.0％，加入乙二胺四乙酸、半胱氨酸盐酸盐浓度均为5～7mmol/L。
进一步的，所述步骤(10)中所述多糖沉淀剂为低级醇溶液、酮水溶液或盐溶液。
进一步的，所述步骤(13)中活性炭添加量为浓缩液固形物含量的1％-3％，脱色温度为70-80℃，脱色时间为30-60min。
进一步的，所述步骤(12)中超滤所用的超滤膜的截留分子量为10KDa。
进一步的，所述步骤(8)中灭酶温度为90-95℃，灭酶时间15-25min。
进一步的，所述步骤(7)中所述乙酸钠-乙酸缓冲液的pH为6.0～6.5，浓度为0.1mol/L。
进一步的，所述低级醇溶液为50％-70％甲醇溶液或50％-70％乙醇溶液，酮水溶液为60％-70％丙酮溶液，盐溶液为硫酸铵水溶液、氯化钠水溶液、乙酸钠水溶液或硫酸钠水溶液。
进一步的，所述步骤(14)纳滤所用的纳滤膜截留分子量为100Da。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
本发明公开了一种海参中生物活性物质的提取方法，通过一套连续的工艺同时得到四种提取物，包括海参多糖、海参皂苷、海参脂质及海参多肽，本发明克服了对海参多糖与海参多肽的分离的技术难点，从而减少后续繁琐纯化步骤。现有技术中海参多肽提取工艺提取的多肽含有部分皂苷、多糖、脂质及无机盐成分，海参多肽规格60％-90％，口感与外观欠佳。而本发明提取的海参多肽规格达到95％以上，灰分含量低，腥味与颜色比较轻淡，更容易被大众所接受。
现有技术中海参多糖、海参皂苷及海参脂质的提取工艺多见于文章，仅停留在实验室阶段，直接用于实际生产的工艺很少，并且得率比较低，考虑到普通食品及功能性食品开发工艺成本来说，很难落地转化，而本发明通过一套提取工艺可以得到海参多糖、海参皂苷、海参脂质及海参多肽，对海参中活性物质的提取具有重要的意义。
附图说明
图1为海参中生物活性物质的提取方法的工艺流程图；
图2为海参多肽液相色谱图；
图3为海参皂苷液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1
本实施例提供了一种海参中生物活性物质的提取方法，，工艺流程图见图1，所述方法包括以下步骤：
1、原料预处理：取新鲜南太平洋黄玉参清洗去除内脏，剪碎后用打浆机打成碎渣，再用胶体磨把海参碎渣研磨成海参浆；
2、溶剂提取：称取海参浆575.0g(水分含量89.57％)，加入2L体积分数为60％乙醇水溶液，加热回流提取1h，重复提取3次，合并上述乙醇提取液，剩余固体备用。
3、亲脂溶剂除脂：将上述乙醇提取液浓缩至干，加200ml水溶解，滤去不溶物，用石油醚萃取3次，得到脱脂水溶液层与石油醚溶剂层。
4、脂质回收：将石油醚溶剂层减压蒸干，得到海参脂质。
5、正丁醇萃取：用氨水调节脱脂水溶液层pH为8.0，加入200ml饱和正丁醇，充分振荡，静止分层，收集上层正丁醇层，按照上述步骤重复萃取4次，合并正丁醇萃取液，50℃浓缩至干，得淡黄色或红棕色粗皂苷粉末。
6、树脂富集纯化：将粗皂苷粉末复溶于水，过D101型大孔树脂吸附，用体积分数为70％乙醇水溶液洗脱，将洗脱液浓缩至干，得海参皂苷。
7、除醇酶解：将步骤2所得固体，用大量水冲洗至无乙醇味，加入1.5L0.1mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液(pH＝6.0)分散，而后依次加入6.0g木瓜蛋白酶、2.2g乙二胺四乙酸和1.2g半胱氨酸盐酸盐，混合均匀，60℃酶解24h，得到酶解液；
8、灭酶：将酶解液置于85℃水浴中灭酶15min，冷却至室温，得到冷却灭酶料液；
9、离心除杂：将冷却灭酶料液转移至离心机中，于9000r/min离心10min，弃去滤渣，收集上清液；
10、粗多糖沉淀：向上清液中加入乙醇至含乙醇量达体积分数60％，静止12h，得到静止分层物料；
11、离心分离：将所得静止分层物料离心分离，上清液为海参粗多肽溶液，下层沉淀物为海参粗多糖；
12、超滤纯化：加水复溶海参粗多糖，控制水温35℃，选择截留分子量为10KDa的超滤膜进行多次超滤，压力控制为0.1MPa，分别收集合并透过液和浓缩液；
13、活性炭吸附脱色：将所得浓缩液加入1.5g活性炭，80℃脱色30min，得脱色液，趁热过滤，80℃水洗涤滤渣2次，得洗涤液，合并脱色液与洗涤液冷冻干燥或喷雾干燥得到海参多糖；
14、纳滤除盐：将步骤11所得上清液与步骤12所得透过液合并，选择截留分子量为100Da的纳滤膜进行纳滤，压力控制为0.5MPa-1.0MPa，收集浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥得到海参多肽。
实施例2
1、取与实施例1同样的新鲜南太平洋黄玉参清洗去除内脏，烘干、磨粉，测定海参体壁中粗蛋白、粗脂肪、灰分、海参多糖、海参皂苷的含量，其具体检测方法参照GB 5009.5-2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定、GB 5009.6-2016食品安全国家标准食品中脂肪的测定、GB 5009.4-2016食品安全国家标准食品中灰分的测定、SC T 3049-2015刺参及其制品中海参多糖的测定高效液相色谱法、保健食品检验与评价技术规范(2003年版)，检测结果见表1。
表1海参体壁组成成分
Figure BDA0002442100340000051
Figure BDA0002442100340000061
注：DM：干重。
2、取实施例1中四种提取物测定其含量及提取率，其具体检测方法海参多肽根据国标GB/T 5009.124-2003方法测定其氨基酸组成，海参脂质经GC-MS分析、海参多糖参照SCT 3049-2015刺参及其制品中海参多糖的测定高效液相色谱法、海参皂苷参照保健食品检验与评价技术规范(2003年版)，检测结果见表2。
表2四种提取物成分含量及提取率
Figure BDA0002442100340000062
注：提取率＝提取物质量/海参体壁中所对应有效组分质量，比如海参多肽提取率＝海参多肽质量/海参体壁中粗蛋白质质量
实施例3
1、取实施例1的提取方法得到的海参脂质，经GC-MS分析。脂肪酸分布情况和相对含量结果见表3。
表3海参脂质脂肪酸组成(相对百分含量)
Figure BDA0002442100340000063
Figure BDA0002442100340000071
注：SFA：饱和脂肪酸，MUFA：单不饱和脂肪酸，PUFA：多不饱和脂肪酸。
结果显示海参脂质中，饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸的比例是0.19∶1，不饱和脂肪酸/总脂肪酸的比例是0.84∶1。
海参脂质MUFA中C20∶1二十碳一烯酸含量为20.76％，PUFA中C20∶4二十碳四烯酸(ARA)，又称花生四烯酸占总的PUFA比例为22.55％，C20∶5二十碳五烯酸(EPA)占总的PUFA比例为60.95％，ARA和EPA之和占总脂质比例为40.62％。ARA是类花生酸类物质的前体并且是细胞膜的主要组成物质，它可以抑制血小板凝聚，减少血栓形成；EPA属于n-3系列多不饱和脂肪酸，它可以调节脂质代谢，预防冠状动脉疾病的产生。
2、取实施例1的提取方法得到的海参多肽，根据国标GB/T 5009.124-2003方法测定其氨基酸组成，分析结果见表4。
表4海参多肽氨基酸组成(总量的相对百分含量)
Figure BDA0002442100340000072
Figure BDA0002442100340000081
注：EAA：必须氨基酸，SEAA：半必须氨基酸，NEAA：非必须氨基酸。
结果显示南太平洋黄玉参(Greenfish)含有必须氨基酸：18.854％，EAA/NEAA的比率：31.66％。甘氨酸、精氨酸、谷氨酸分别可以促进NK细胞和T细胞的活化和增殖，增强免疫力。多项研究证实：较低的赖氨酸/精氨酸比率有降低胆固醇的功效。通过实例1提取的海参多肽含有较多的甘氨酸，精氨酸，谷氨酸以及较低的赖氨酸/精氨酸比率，证明此肽具有增强免疫力的功效。
根据国标GB 31645-2018食品安全国家标准胶原蛋白肽方法测定海参多肽分子质量大小及分布范围，分析结果见表5，海参多肽液相色谱图如图2。
表5海参多肽分子量分段分布(％)
分子量分段 ＞10000 5000-10000 3000-5000 1000-3000 ＜1000
百分比 3.56 0.69 2.97 16.37 76.41
3、取实施例1的提取方法得到的海参多糖，采用高效体积排阻色谱法确定海参多糖分子量分布。色谱条件：TSK-GEL G4000SW色谱柱(7.5mm*300mm)，样品浓度4mg/ml，进样量20ul，洗脱流速为0.8ml/min，柱温为35℃，流动相为0.1mol/L Na2SO4溶液，示差折光检测器(RID)。葡聚糖标准品来校正。按照上述色谱条件分析样品，然后使用GPC数据处理软件，根据相对分子质量校正曲线方程对样品的色谱图及其数据进行计算处理，即可得到样不同分子量段海参多糖的相对百分比之和，分析结果见表6。
表6海参多糖分子量分段分布(％)
分子量分段 ＞30万 15-30万 5-15万 0.5-5万
百分比 63 10.08 22.963 3.926
4、取实施例1的提取方法得到的海参皂苷，根据GB/T 33108-2016海参及其制品中海参皂苷的测定高效液相色谱法测定，其液相色谱图如图3。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）、原料预处理：取新鲜海参清洗去除内脏，剪碎后打成碎渣，研磨成海参浆；
（2）、溶剂提取：向海参浆中加入乙醇水溶液，加热回流，得到乙醇提取液和固体；
（3）、亲脂溶剂除脂：将乙醇提取液浓缩至干，加水溶解，用亲脂溶剂萃取，得到脱脂水溶液层与亲脂溶剂层；
（4）、脂质回收：将亲脂溶剂层减压蒸干，得到海参脂质；
（5）、正丁醇萃取：用氨水调节脱脂水溶液层pH，加入饱和正丁醇，充分振荡，静止分层，收集上层正丁醇层，得到正丁醇萃取液，浓缩至干，得粗皂苷粉末；
（6）、树脂富集纯化：将粗皂苷粉末溶于水，用树脂吸附，乙醇水溶液洗脱，将洗脱液浓缩至干，得海参皂苷；
（7）、除醇酶解：将步骤（2）所得固体，用水冲洗至无乙醇味，加入缓冲液，然后依次加入木瓜蛋白酶、乙二胺四乙酸和半胱氨酸盐酸盐，混合均匀，酶解，得到酶解液；
（8）、灭酶：将酶解液进行灭酶，冷却至室温，得到冷却灭酶料液；
（9）、离心除杂：将冷却灭酶料液离心，弃去滤渣，收集上清液；
（10）、粗多糖沉淀：向步骤（9）的上清液中加入多糖沉淀剂，静止，得到静止分层物料；
（11）、离心分离：将静止分层物料离心分离，上清液为海参粗多肽溶液，下层沉淀物为海参粗多糖；
（12）、超滤纯化：加水复溶海参粗多糖，进行超滤，得到透过液和浓缩液；
（13）、活性炭吸附脱色：将浓缩液加入活性炭，得脱色液，过滤，洗涤滤渣，得洗涤液，合并脱色液与洗涤液，干燥得到海参多糖；
（14）、纳滤除盐：将步骤（11）所得上清液与步骤（12）所得透过液合并，进行纳滤，收集浓缩液干燥得到海参多肽。
2.根据权利要求1所述的海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述步骤（2）中海参浆和乙醇水溶液的料液比为1:2~5g/mL，乙醇水溶液的体积分数为50%-90%。
3.根据权利要求1所述的海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中亲脂溶剂为石油醚、乙酸乙酯、苯或乙醚。
4.根据权利要求1所述的海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述步骤（5）中氨水调节pH值为7.5~8.5。
5.根据权利要求1所述的海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述步骤（6）中的树脂为弱极性大孔树脂，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50%-90%。
6.根据权利要求1所述的海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述步骤（7）中缓冲液为乙酸钠-乙酸缓冲液，固体与乙酸钠-乙酸缓冲液的料液比为1:10~50g/mL。
7.根据权利要求1所述的海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述步骤（7）中木瓜蛋白酶加入量为海参中粗蛋白含量的1.0%-3.0%，加入乙二胺四乙酸、半胱氨酸盐酸盐浓度均为5~7mmol/L。
8.根据权利要求1所述的海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述步骤（10）中所述多糖沉淀剂为低级醇溶液、酮水溶液或盐溶液。
9.根据权利要求1所述的海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述步骤（13）中活性炭添加量为浓缩液固形物含量的1%-3%，脱色温度为70-80℃，脱色时间为30-60min。
10.根据权利要求1所述的海参中生物活性物质的提取方法，其特征在于：所述步骤（12）中超滤所用的超滤膜的截留分子量为10KDa。
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