CN103265642A - 一种从海参加工废弃物中提取活性物质的方法 - Google Patents
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本发明涉及活性物质的提取方法，具体的说是一种从海参加工废弃物中提取活性物质的方法。以海参内脏团为原料，经过预处理、酶解、回流提取、微波提取、醇沉、脱色、离心、盐沉、透析、精制等工艺得到精制海参多糖；醇沉后的上清液经过旋转蒸发、萃取脱脂、水饱和正丁醇萃取、旋转蒸发、大孔吸附树脂色谱等工艺得到精制海参总皂甙；水饱和正丁醇萃取后的水溶液经过脱色、灭菌等技术得到抗氧化活性海参多肽。从而将海参内脏团变废为宝，得到海参多糖、海参皂甙、抗氧化活性海参多肽三种产品。
Description
技术领域
本发明涉及活性物质的提取方法，具体的说是一种从海参加工废弃物中提取活性物质的方法。
背景技术
自古以来，海参就是保健食品和营养食品。明代《食物本草》中指出海参有主补元气、滋益五脏六腑和祛虚损的养生功能，清代《本草纲目拾遗》中药典籍则将海参列为补益药物，其载“海参性温补，足敌人参，故名海参；味甘咸，补肾经，益精髓，消痰延，摄小便，壮阳疗痿，杀疮虫”。近年来先后有中医提出以海参单用或组方治疗肿瘤、再生障碍性贫血和糖尿病，取得了良好效果，同时在辅佐如癫痫、胃及十二指肠溃疡、慢性乙型肝炎、慢性肾炎、高血压、肺结核、神经衰弱、静脉血拴、痔疮、脱肛和便秘等常见病治疗，及为一般病后或产后康复过程中所拟订的各种药膳或食疗组方中，海参均得到了广泛的认同和应用。
近年来，随着国内外运用现代科学技术对海参生物活性物质的分离、鉴定及其生物医学作用等研究的不断深入，人们发现海参含有许多具有重要生物学活性的物质，如海参毒素、海参多糖、海参皂甙、脂肪酸、多肽、海参神经节苷酯等，这些生物活性物质具有抗肿瘤、抗凝血、镇痛、提高免疫力、抗真菌、降血脂、防治类风湿关节炎、关节强硬性脊椎炎和骨性关节炎等作用。从海参各类生物活性物质中寻找和开发新药，以及加工功能性食品已经成为海参深度开发利用的重要方向。
海参蛋白质的组成种类繁多,包括甘氨酸,谷氨酸,天门冬氨酸,丙氨酸,胱氨酸,精氨酸等近20种,且多为人体必须氨基酸。海参内脏团中含有丰富的蛋白质,是制备生物活性多肽的理想原料。海参多肽具有良好的溶解性和稳定性的特点,易消化吸收,食用安全,而且具有降血压、预防心脑血管疾病、抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等生物活性。
海参多糖是海参体壁真皮结缔组织、体腔、内腺管及内脏中的重要成分之一。现代研究表明，海参含有的酸性粘多糖对人体的生长、愈创、成骨和预防组织老化、预防血栓和动脉硬化，降低血液粘度等有着特殊功能，还可以预防和抑制肿瘤，提高机体免疫能力，保护神经组织，预防老年痴呆，降低放化疗副作用。由于海参多糖特殊的生物活性，因此海参多糖在医药方面的应用越来越受到人们的关注。其化学组成也能直接反应海参的品质。
海参由于环境温度低，生长期长，海参素含量丰富，海参素又名海参皂甙。自然界动物的的皂苷主要存在棘皮动物，特别是海参纲的海洋动物中。据报道，已经从50多种海参中分离出皂苷纯品。药理实验表明，海参皂苷大都具有强烈的生理活性，这些生理活性包括：抗肿瘤作用、抗真菌作用、抗放射作用、细胞毒性作用及抗胆碱作用等。海参的初加工就是刨肠，把海参的内脏全部取出来。在目前的海参加工过程当中会产生大量的内脏废弃物，而据有关研究资料显示：作为海参主要功效成分之一的海参皂甙在海参的内脏中含量非常丰富，如果不能加以有效利用，将造成极大的资源浪费。
近年来，中国海参产业发展迅速，市场规模不断扩大。然而，中国海参加工的技术水平和综合利用程度还较低，加工过程中的下脚料（如海参肠、性腺等）尚未得到充分的开发利用。
发明内容
本发明目的在于提供一种从海参加工废弃物中提取活性物质的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种从海参加工废弃物中提取活性物质的方法，
以海参内脏团为原料，经过预处理、酶解、回流提取、醇沉；
醇沉后沉淀脱色、离心、盐沉、透析即得到海参多糖；
醇沉后上清液经过旋转蒸发、萃取脱脂、水饱和正丁醇萃取，水饱和正丁醇萃取所得萃取液经旋转蒸发、大孔吸附树脂色谱提取，即得到精制海参皂甙；
上述水饱和正丁醇萃取后的水溶液经过脱色、灭菌即得到抗氧化活性海参多肽。
进一步的说，具体制备过程：
1）将原料海参内脏团绞碎，加入其1-2倍体积的蒸馏水搅拌均匀，在45-55℃下恒温预热20-30min；预热后加入原料质量0.3%的复合蛋白酶，进行酶解8-10小时，酶解后加入乙醇至酶解液中乙醇浓度达到60-80%，而后于60-70℃回流提取4-5小时，然后再微波功率为850W的条件下，进行微波提取20-30min，静置过夜；
2）步骤1）醇沉回流提取静止过夜后沉淀加水溶解，使其浓度达到5-7%的水溶液，水溶液再经过滤，滤液用1%活性炭于50-60℃脱色1-2小时,脱色后加入乙酸钾至2mol/L，并冷藏过夜（除蛋白）后离心收集沉淀，沉淀经透析,透析后加入乙醇进行反复醇沉，即得到海参多糖；
3）步骤1）醇沉中回流提取的提取液，经旋转蒸发得浸膏A，浸膏A经水溶解，溶解后用乙酸乙酯萃取脱脂，脱脂后的萃取液再经水饱和的正丁醇溶液萃取，正丁醇萃取液经减压蒸馏浓缩得浸膏B，将浸膏B溶于水中，经大孔树脂依次用蒸馏水、乙醇洗脱，收集乙醇洗脱的组份，即得到精制海参总皂甙；
4）将步骤3）正丁醇萃取的水相以及经大孔树脂用蒸馏水洗脱的组份进行合并，合并后的水溶液用活性炭脱色，高温灭菌，即得到抗氧化活性海参多肽。
所述步骤2）经脱色后加入乙酸钾至2mol/L，并于4℃冷藏过夜（除蛋白）后以3000rpm/min离心10min收集沉淀，沉淀经去离子水洗涤,将沉淀配制成质量百分比为30％的水溶液,而后经48小时透析,向透析后的样品水溶液中加入乙醇作为沉淀剂,使体系中乙醇的浓度为80%,反复醇沉三次，即得到海参多糖。
所述浸膏B溶于水中经大孔树脂依次用蒸馏水、体积分数为20%的乙醇、体积分数为50%的乙醇、体积分数为70%的乙醇和体积分数为95%的乙醇洗脱洗脱。
将步骤3）正丁醇萃取的水相以及经大孔树脂用蒸馏水洗脱的组份进行合并，合并后的水溶液用质量体积比为1%的活性炭、50℃下脱色1h，高温灭菌得到抗氧化活性海参多肽。
本发明所具有的优点：
1、本发明利用酶解、回流提取、微波提取、醇沉、脱色、离心、盐沉、透析、精制、旋转蒸发、萃取、大孔吸附树脂色谱、超滤等技术为基础经过合理的路线设计，在海参加工废弃物中提取了海参多糖、海参皂甙、抗氧化活性海参多肽等活性物质。
2、由于本发明利用复合蛋白酶来酶解蛋白的同时，会使海参蛋白上的多糖降解下来，从而提高了海参多糖的提取率；本发明同时用了回流提取和微波提取的方法来提取海参皂甙，从而提高了海参皂甙的提取率，本发明研究发现复合蛋白酶对海参蛋白的水解度较大，效率较高；所以利用本发明路线提取海参多糖、海参皂甙、抗氧化活性海参多肽的得率较高。
3、本发明的设计路线合理、科学，适合工业化生产，例如：在酶解海参蛋白的时候增加了海参多糖的得率；在用醇提取海参皂甙的时候，不但可以提取海参皂甙，而且可以使海参多糖沉淀下来，合理利用了资源；选择酶的时候，特意选择了中性蛋白酶，不但水解度较高，而且在中性条件下反应效果好，适合工业化生产。
4、本发明所得海参多糖、海参皂甙都是精制样品，纯度较高，而且复合蛋白酶水解效果较好，水解度达到了38.53%，海参多肽，具有较高抗氧化活性，有利于实际利用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的工艺流程图。
图2为本发明复合蛋白酶对海参内脏团的水解度-时间曲线图。
具体实施方式
为了对本发明进行详细的说明，现列举如下实施例进一步介绍本发明方案。下述实施例中选用的为经冰冻后的糙刺参内脏，测得其含水量约为88.33％，干物质中粗蛋白含量约为60.94％，总糖约为5.6％，灰分约为19.72％，脂肪约为7.58％，皂甙约为0.21%，以及海参内脏团干物质氨基酸含量（参见表1）；
实施例1
步骤（1）取冰冻的海参内脏团1500g流水解冻，用绞肉机绞碎，置于5000mL锥形瓶中，加入1500ml蒸馏水，匀浆;
步骤（2）用恒温震荡摇床升温至50℃，恒温预热30min，加入44g复合蛋白酶（诺维信生物技术有限公司），在140rpm/min条件下对海参内脏团的海参蛋白进行酶解，并酶提海参内脏团的海参多糖，酶解8h后，沸水浴下灭酶10min；
步骤（3）将灭酶后的样品体系，置于圆底烧瓶中，加入乙醇使体系中乙醇浓度达到60%，60℃下回流提取4h，回流提取后将体系置于850W下，微波提取30min，微波提取结束后静置过夜；
步骤（4）收集经步骤（3）回流提取后的沉淀物和提取溶液；将沉淀物用170mL蒸馏水溶解为5-7%的水溶液，将此水溶液抽滤，取上清液即为粗海参多糖溶液；
步骤（5）粗海参多糖溶液用1.7g活性炭50℃、140rpm/min下脱色1小时,再加入乙酸钾至2mol/L，4℃冷藏过夜（除蛋白）,3000rpm/min离心10min收集沉淀，沉淀经去离子水洗涤,配制成质量百分比为30％水溶液,经透析膜（3.5KDa）透析48小时,透析处理后加入136mL乙醇作为沉淀剂,进行醇沉，重复沉淀三次后冷冻干燥得6.2g精制海参多糖，多糖得率为63.26%；
步骤（6）将步骤（4）回流提取所得提取溶液，经旋转蒸发得浸膏A，浸膏A用水将其充分溶解,得到浸膏A的溶解液。溶解液中加入相当于溶解液1倍体积的乙酸乙酯进行萃取脱脂和其他脂溶性有机物，而后再用相当于溶解液2倍体积的水饱和的正丁醇溶液萃取，得水饱和的正丁醇的萃取液以及水饱和的正丁醇的萃取水相。水饱和的正丁醇的萃取液经减压蒸馏浓缩得到浸膏B。将浸膏B溶于水中，配成15mg/mL样品溶液，经大孔树脂（D101型）,依次用蒸馏水、体积分数为20%、50%、70%和95%的乙醇进行洗脱（洗脱时原料树脂比为10:1、洗脱剂用量为10倍柱体积、常温吸附和洗脱、pH为中性、流速为2mL/min）；
收集经蒸馏水洗脱下的组分将其与上述水饱和的正丁醇的萃取水相合并，即为总抗氧化活性海参多肽提取液，而后在100℃高温灭菌10min后得到抗氧化活性海参多肽溶液，TNBS法测得海参蛋白的水解度高达38.53%，冷冻干燥，得到抗氧化活性海参多肽粉，总抗氧化海参多肽得率为83%，以及相应的抗氧化性参见表2；
步骤（7）收集上述分别用体积分数20%、50%、70%和95%的乙醇洗脱下的组分，而后将各组分洗脱液合并，冷冻干燥得0.3198g精制海参皂甙，得率为87%。
表1本发明所用海参内脏团干物质氨基酸含量表
表2复合蛋白酶酶解海参内脏团所得到的酶解产物，配成浓度为3mg/ml，用ABTS法测得的抗氧化率表格
本发明以海参加工废弃物内脏团为原料，根据其功效成分的组成进行产品的精细化开发，通过一系列制备工艺得到海参多糖、海参皂甙、抗氧化活性海参多肽三类活性物质。
Claims (5)
1.一种从海参加工废弃物中提取活性物质的方法，其特征在于：
以海参内脏团为原料，经过预处理、酶解、回流提取、醇沉；
醇沉后沉淀脱色、离心、盐沉、透析即得到海参多糖；
醇沉后上清液经过旋转蒸发、萃取脱脂、水饱和正丁醇萃取，水饱和正丁醇萃取所得萃取液经旋转蒸发、大孔吸附树脂色谱提取，即得到精制海参皂甙；
上述水饱和正丁醇萃取后的水溶液经过脱色、灭菌即得到抗氧化活性海参多肽。
2.按权利要求1所述的从海参加工废弃物中提取活性物质的方法，其特征在于：
1）将原料海参内脏团绞碎，加入其1-2倍体积的蒸馏水搅拌均匀，在45-55℃下恒温预热20-30min；预热后加入原料质量0.3%的复合蛋白酶，进行酶解8-10小时，酶解后加入乙醇至酶解液中乙醇浓度达到60-80%，而后于60-70℃回流提取4-5小时，然后再微波功率为850W的条件下，进行微波提取20-30min，静置过夜；
2）步骤1）醇沉回流提取静止过夜后沉淀加水溶解，使其浓度达到5-7%的水溶液，水溶液再经过滤，滤液用1%活性炭于50-60℃脱色1-2小时,脱色后加入乙酸钾至2mol/L，并冷藏过夜（除蛋白）后离心收集沉淀，沉淀经透析,透析后加入乙醇进行反复醇沉，即得到海参多糖；
3）步骤1）醇沉中回流提取的提取液，经旋转蒸发得浸膏A，浸膏A经水溶解，溶解后用乙酸乙酯萃取脱脂，脱脂后的萃取液再经水饱和的正丁醇溶液萃取，正丁醇萃取液经减压蒸馏浓缩得浸膏B，将浸膏B溶于水中，经大孔树脂依次用蒸馏水、乙醇洗脱，收集乙醇洗脱的组份，即得到精制海参总皂甙；
4）将步骤3）正丁醇萃取的水相以及经大孔树脂用蒸馏水洗脱的组份进行合并，合并后的水溶液用活性炭脱色，高温灭菌，即得到抗氧化活性海参多肽。
3.按权利要求2所述的从海参加工废弃物中提取活性物质的方法，其特征在于：所述步骤2）经脱色后加入乙酸钾至2mol/L，并于4℃冷藏过夜（除蛋白）后以3000rpm/min离心10min收集沉淀，沉淀经去离子水洗涤,将沉淀配制成质量百分比为30％的水溶液,而后经48小时透析,向透析后的样品水溶液中加入乙醇作为沉淀剂,使体系中乙醇的浓度为80%,反复醇沉三次，即得到海参多糖。
4.按权利要求2所述的从海参加工废弃物中提取活性物质的方法，其特征在于：所述浸膏B溶于水中经大孔树脂依次用蒸馏水、体积分数为20%的乙醇、体积分数为50%的乙醇、体积分数为70%的乙醇和体积分数为95%的乙醇洗脱洗脱。
5.按权利要求2所述的从海参加工废弃物中提取活性物质的方法，其特征在于：将步骤3）正丁醇萃取的水相以及经大孔树脂用蒸馏水洗脱的组份进行合并，合并后的水溶液用质量体积比为1%的活性炭、50℃下脱色1h，高温灭菌得到抗氧化活性海参多肽。
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