CN103755826A - 一种从黄乳海参提取海参精多糖的方法 - Google Patents

一种从黄乳海参提取海参精多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术，具体的说是一种从黄乳海参（Holothuia fuscogliva）提取海参精多糖的方法。将去除内脏、破壁后的海参经酶解搅拌离心，酶解上清液中加入乙醇并离心收集，收集沉淀得海参粗多糖；海参粗多糖溶解后调节至碱性，而后加入H2O2反应至乳白色，冷却、离心上清液调节至酸性，离心向上清液中加入KAc后静置，沉淀用乙醇洗涤后冷冻干燥即得到海参精多糖。本发明具快速、简便易产业化等特点，为实现黄乳海参精多糖的高值化利用提供了重要的技术支持。

Description

一种从黄乳海参提取海参精多糖的方法
技术领域
本发明涉及生物技术，具体的说是一种从黄乳海参（Holothuiafuscogliva）提取海参精多糖的方法。
背景技术
黄乳海参（Holothuia fuscogliva），属棘皮动物门（Echinodermata），海参纲（Holothuroidea），楯手目（Aspidochirotida），海参科（Holothuriidae），海参属（Holothuria）。多分布于西沙群岛和新喀里多尼亚；生活在珊珊礁内,水深约10-45m；大形种,长度可达500mm,宽130mm。体壁厚而粗糙。口腹位,周围有疣襟部,具触手20个。背面散布很小的疣足和管足,身体两侧各有5-6个很大的乳房状突起。体壁内骨片丰富,包括桌形体和扣状体。桌形体有两种:一种底盘边缘平滑,塔部顶端齿少;另一种桌形体底盘边缘有瘤状突起,顶端齿多。有的桌形体大,有立柱5-6个,顶端齿多,几乎把整个盘都盖满。扣状体有的简单,有的复杂,形成有孔中空纺锤形穿孔体。背面灰褐色,并带小的白色斑块,两侧有大的白色斑块;腹面为浅的栗子褐色。
海参多糖主要存在于海参体壁中，是海参体壁的重要功效成分。目前发现存在于海参体壁的多糖主要分两类：一类是海参糖胺聚糖，由N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸、L-岩藻糖和硫酸酯基的重复单位组成，另一类是海参岩藻多糖，由L-岩藻糖构成，分别称为海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯，两者的组成糖基不同，但糖链上都有部分羟基发生硫酸酯化。海参多糖具有非常多的生物活性例如抗肿瘤活性、抗凝血活性、抗氧化活性、提高免疫力、降血脂、抗衰老、促进干细胞增殖、抗病毒等。因此，海参多糖在功能性食品、医药方面展现出良好的应用前景，且黄乳海参是大型参，体积大、产量高、营养丰富，研究黄乳海参中多糖的提取制备工艺能够为海参多糖食用和药用以及黄乳海参的高值化利用等方面的应用提供有力支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种从黄乳海参提取海参精多糖的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种从黄乳海参提取海参精多糖的方法，将去除内脏、破壁后的海参经酶解搅拌离心，酶解上清液中加入乙醇并离心收集，收集沉淀得海参粗多糖；海参粗多糖溶解后调节至碱性，而后加入H2O2反应至乳白色，冷却、离心上清液调节至酸性，离心向上清液中加入KAc后静置，沉淀用乙醇洗涤后冷冻干燥即得到海参精多糖。
将去除内脏的海参体壁建成小块并磨成粉末，每克海参干粉中加入10-30mL,0.1M pH6.9NaAc，5mM EDTA,5mM半胱氨酸和50-100mg木瓜蛋白酶，于60℃下搅拌反应24h-36h，反应后5000-7000rpm离心5-15min，取海参酶解上清液；待用。
向海参酶解上清液中加入其2-3倍体积的95%乙醇，4℃静置12-36h，5000-7000rpm离心5-15min取沉淀；沉淀用95%乙醇洗涤2-4次，冷冻干燥后即得海参粗多糖。
所述海参粗多糖经水溶解，溶解液用KOH调节pH至9-11，然后加入海参粗多糖溶液的1/7-1/5体积30%H2O2，50-60℃反应4-6h至反应液为乳白色；然后将反应液冷却后5000-7000rpm离心5-15min，收集上清液，待用。
将反应至乳白色的反应液离心后上清液冷却至0℃，并用HCl调节pH至1-3，而后5000-7000rpm离心5-15min，收集上清液并加入KAc至终浓度为1.0-1.5M,4℃静置12-36h，5000-7000rpm离心5-15min，将沉淀分别用95%和100%乙醇洗涤，冷冻干燥即可得到海参精多糖。
本发明的优点：
1.本发明是一种简单、快速制备高品质海参精多糖的方法，适合工业化生产。
2.本发明获得的海参精多糖分子量低，生物活性强。
附图说明
图1为本发明实施例提供的黄乳海参精多糖的单糖组分分析图。
图2本发明实施例提供黄乳海参精多糖HPLC分子量测定图。
图3本发明实施例提供的红外光谱测定图。
具体实施例
实施例1：
将去内脏后的黄乳海参（Holothuia fuscogliva）体壁切成碎块并磨成粉末，每克海参干粉中加入10mL,0.1M pH6.9NaAc，5mM EDTA,5mM半胱氨酸和50mg木瓜蛋白酶，于60℃下反应并搅拌24h，反应后5000rpm离心15min，取上清；向上清液中加入其2倍体积的95%乙醇，4℃静置12h,5000rpm离心15min取沉淀；将所得到的沉淀用95%乙醇洗涤2次，冷冻干燥后即得海参粗多糖。将所得到的海参粗多糖用水溶解，溶解后用KOH调节pH至9，然后向其中加入1/7体积的30%H2O2，50℃反应4h至反应液为乳白色；然后将反应液冷却后5000rpm离心15min，收集上清液冷却至0℃，并用HCl调节pH至1左右，5000rpm离心15min收集上清液加入KAc至终浓度为1.0M,4℃静置12h，5000rpm离心15min离心将沉淀分别用95%和100%乙醇洗涤，冷冻干燥即可得到海参精多糖。
将上述所得海参精多糖进行单糖组分分析，分子量测定及红外光谱。（1）单糖组成成分分析：
精确称量上述获得到的10mg海参精多糖+1ml水，加入1mL4M的TFA，封管，105-110℃水解4h。然后用NaOH将其中和至pH5-6，定容至10ml。取0.2mL海参精多糖酶解液+0.2mL内标，从中取0.1mL然后加入0.12mL0.5M PMP和0.1mL0.3M NaOH，混匀，70℃反应60min，取出放至室温，加0.1mL0.3M HCl，混匀，加0.5mL氯仿萃取，7000rpm离心5min，弃去氯仿层。最后吸取上清0.1mL进行HPLC分析。色谱柱条件:分离柱ZORBAX Eelipse XDB-C18(4.6×150mm,5μm)，检测波长250nm,流速为1.0mL/min，柱温为25℃；流动相：流动相A:15%(V/V)乙腈+50mM pH6.90PBS，流动相B：40%(V/V)乙腈+50mM pH6.90PBS，时间梯度:0-10min，浓度梯度:流动相B，进样体积:10μL。实验结果显示，通过该方法制备到的海参精多糖主要是由半乳糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和甘露糖，其摩尔百分比（mol%）分别为：1.182,、1、0.748、0.437、0.134和0.0836。
（2）分子量测定：
采用Agilent1260高效液相系统，具体分析条件如下：色谱柱：TSK-gelG4000PWxL(300×7.8mmm，6μm);检测器:示差检测器(RID)，流动相：0.2MNaCI；流速：0.5mL/min，柱温：40℃，标准品：Dextran系列标准品，采用Agilent分子量分布计算软件，得到海参精多糖峰值分子量为1453.5。
（3）红外光谱测定：
将2mg海参精多糖与200mg纯KBr研细均匀至粒度小于2微米，置于模具中，用5～10×107Pa压力在油压机上压成透明薄片，然后用红外光谱分析仪进行测定。红外谱图进一步验证了海参多糖中含有-OH、-CHO、-COOH、-SO3H、-NH2等。
因此，该方法制备的海参精多糖具有简单、快速、易于生产等特点，此外制备得到的海参精多糖分子量低、单糖组成合理，具有很好的应用前景。
实施例2：
将去内脏后的黄乳海参（Holothuia fuscogliva）体壁切成碎块并磨成粉末，每克海参干粉加入20mL,0.1M pH6.9NaAc，5mM EDTA,5mM半胱氨酸，80mg木瓜蛋白酶，于60℃下反应并搅拌30h，反应后6000rpm离心10min，取上清；向上清液中加入其2.5倍体积的95%乙醇，4℃静置24h,6000rpm离心10min取沉淀；将所得到的沉淀用95%乙醇洗涤3次，冷冻干燥后即得海参粗多糖。将所得到的海参粗多糖水溶解后，用KOH调节pH至10，然后向其中加入1/6体积的30%H2O2，55℃反应5h至反应液为乳白色；然后将反应液冷却后6000rpm离心10min，收集上清液冷却至0℃，并用HCl调节pH至2左右，6000rpm离心10min，收集上清液加入KAc至浓度为1.2M,4℃静置24h，6000rpm离心10min离心将沉淀分别用95%和100%乙醇洗涤，冷冻干燥即可得到海参精多糖。
实施例3：
将去内脏后的黄乳海参（Holothuia fuscogliva）体壁切成碎块并磨成粉末，每克海参干粉加入30mL,0.1M pH6.9NaAc，5mM EDTA,5mM半胱氨酸，100mg木瓜蛋白酶，于60℃下反应并搅拌36h，反应后7000rpm离心5min，取上清；向上清液中加入其3倍体积的95%乙醇，4℃静置36h,7000rpm离心5min取沉淀；沉淀用95%乙醇洗涤4次，冷冻干燥后即得海参粗多糖。将所得到的海参粗多糖水溶解后，用KOH调节pH至11，然后向其中加入1/5体积的30%H2O2，60℃反应6h至反应液为乳白色；然后将反应液冷却后7000rpm离心5min，收集上清液冷却至0℃，并用HCl调节pH至3左右，7000rpm离心5min，收集上清液加入KAc至浓度为1.5M,4℃静置36h，7000rpm离心5min离心将沉淀分别用95%和100%乙醇洗涤，冷冻干燥即可得到海参精多糖。

Claims (5)

1.一种从黄乳海参提取海参精多糖的方法，其特征在于：
将去除内脏、破壁后的海参经酶解搅拌离心，酶解上清液中加入乙醇并离心收集，收集沉淀得海参粗多糖；海参粗多糖溶解后调节至碱性，而后加入H2O2反应至乳白色，冷却、离心上清液调节至酸性，离心向上清液中加入KAc后静置，沉淀用乙醇洗涤后冷冻干燥即得到海参精多糖。
2.按权利要求1所述的从黄乳海参提取海参精多糖的方法，其特征在于：
将去除内脏的海参体壁建成小块并磨成粉末，每克海参干粉中加入10-30mL,0.1M pH6.9NaAc，5mM EDTA,5mM半胱氨酸和50-100mg木瓜蛋白酶，于60℃下搅拌反应24h-36h，反应后5000-7000rpm离心5-15min，取海参酶解上清液；待用。
3.按权利要求1所述的从黄乳海参提取海参精多糖的方法，其特征在：向海参酶解上清液中加入其2-3倍体积的95%乙醇，4℃静置12-36h，5000-7000rpm离心5-15min取沉淀；沉淀用95%乙醇洗涤2-4次，冷冻干燥后即得海参粗多糖。
4.按权利要求1所述的从黄乳海参提取海参精多糖的方法，其特征在：所述海参粗多糖经水溶解，溶解液用KOH调节pH至9-11，然后加入海参粗多糖溶液的1/7-1/5体积30%H2O2，50-60℃反应4-6h至反应液为乳白色；然后将反应液冷却后5000-7000rpm离心5-15min，收集上清液，待用。
5.按权利要求1所述的从黄乳海参提取海参精多糖的方法，其特征在：将反应至乳白色的反应液离心后上清液冷却至0℃，并用HCl调节pH至1-3，而后5000-7000rpm离心5-15min，收集上清液并加入KAc至终浓度为1.0-1.5M,4℃静置12-36h，5000-7000rpm离心5-15min，将沉淀分别用95%和100%乙醇洗涤，冷冻干燥即可得到海参精多糖。
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