CN103755828B

CN103755828B - 灵芝孢子多糖、制备方法和应用

Info

Publication number: CN103755828B
Application number: CN201410020206.0A
Authority: CN
Inventors: 吕龙; 江艳; 杨佳琰; 曹义苗; 项玉华; 丁志刚
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2034-01-16
Also published as: CN103755828A

Abstract

本发明涉及一种灵芝孢子多糖、制备方法和应用，该灵芝孢子多糖是一种水溶性葡聚糖，分子量在700～10000Da范围内，其中分子量2000～4900Da的部分占60～85%。系用无机酸或有机酸溶液热处理灵芝孢子粉，减压蒸干溶剂，随后用水浸泡灵芝孢子粉，滤取浸泡液加入有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥获得灵芝孢子多糖。该灵芝孢子多糖可以用于制备具有抗肿瘤和免疫增强功能的药物或保健品。

Description

灵芝孢子多糖、制备方法和应用

发明领域

本发明是一种灵芝孢子多糖、制备方法和应用。该水溶性灵芝孢子多糖是一种葡聚糖，分子量700～10000Da，其中分子量2000～4900Da的部分占60～85％。

技术背景

灵芝孢子是担子菌纲多孔菌科赤芝或紫芝的孢子。灵芝孢子呈褐色卵形，一端平截，大小(8.5～11.2)μm×(5.2～6.9)μm，具有双层壁结构。灵芝孢子的化学成分主要有以下几类：蛋白质和氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类、内酯和无机离子等。灵芝孢子中富含多糖和寡糖，但由于其坚韧的双层壁结构，孢子内的活性成分难以释放提取。

常见的孢子多糖提取工艺获得的多糖分子量大、颜色深、杂质含量高。吕龙等人报道了“灵芝孢子粉多糖、生产方法和用途”[ZL03141851.1]，该灵芝孢子多糖是由11个β-1,3连接葡萄糖为主链，主链上有两条β-1,3,6连接葡萄糖分支，两条支链分别是→1)-β-Glcp-(6→1)-α-Glcp和→1)-β-Glcp-(6→1)-α-Glcp-(4→1)-α-Glcp，分子量范围5000-11000Da，而且该发明采用微波软化处理获得灵芝孢子多糖，在实际生产中，由于微波的穿透性问题，限制了微波装置的放大，影响了其工业化，因而一种能替代微波处理获得灵芝孢子多糖的方法更具应用前景。

发明内容

本发明提供一种灵芝孢子多糖、制备方法和用于制备具有抗肿瘤和免疫增强功能的药物和保健品的应用。

本发明是从有机酸或无机酸热处理后的灵芝孢子粉中提取获得的多糖，该多糖为水溶性葡聚糖，分子量在700～10000Da范围内，其中分子量2000～4900Da的部分占60～85％，具有α-Glcp(1→、→4)-α-Glcp-(1→、β-Glcp-(1→、→6)-β-Glcp-(1→、→3)-β-Glcp-(1→、→3,6)-β-Glcp-(1→六种连接方式，其摩尔比为1:5:2:3:4:3。

本发明的灵芝孢子多糖具有如下结构式：

其中n＝1～2，Glcp为吡喃型葡萄糖，β-Glcp-(1→为β构型的末端葡萄糖，α-Glcp-(1→为α构型的末端葡萄糖，→6)-β-Glcp-(1→为1,6连接的β构型的葡萄糖，→3,6)-β-Glcp-(1→为1,3,6连接的β构型的葡萄糖，→4)-α-Glcp-(1→为1,4连接的α构型的葡萄糖。

该多糖水中溶解度可达到90mg/mL。

针对灵芝孢子多糖难以提取的状况，本发明提供了一种低成本的灵芝孢子多糖的制备方法。采用本方法可规模化生产质量稳定的灵芝孢子多糖。该灵芝孢子多糖可以用于制备具有抗肿瘤和免疫增强功能的药物或保健品。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的：

酸在加热条件下穿透灵芝孢子粉双层壁，使孢子壁上形成许多微孔，酸溶液进入微孔降解孢子粉内部大分子多糖，降解后的多糖分子量降低、水溶性增加，水溶性多糖类成分可通过微孔释放，再用水提醇沉的方法提取和纯化灵芝孢子多糖。

具体方法通过如下的步骤1)、3)或2)、3)方法获得：

1)取灵芝孢子粉加入0.1～2mol/L的无机酸水溶液中搅拌，灵芝孢子粉与无机酸水溶液的质量体积比为100～800克/升，无机酸水溶液60～100℃搅拌10分钟至4小时，反应结束后加无机碱中和至PH5～7.5，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉；

2)取灵芝孢子粉加入50～100％的有机酸或有机酸水溶液中搅拌，灵芝孢子粉与有机酸或有机酸水溶液的质量体积比为100～800克/升，有机酸或有机酸水溶液60℃至回流反应10分钟至4小时，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉；

3)将酸处理孢子粉用水浸泡，灵芝孢子粉与水的重量比1:6～15，浸泡时间2～24小时，浸泡液浓缩或不经浓缩，加入3～8倍体积与水互溶的有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，离心上清液浓缩干燥；

上述的方法可以进一步描述如下：

方法一：

(1)取灵芝孢子粉加入60～100℃的无机酸水溶液中搅拌10分钟至4小时，灵芝孢子粉与无机酸水溶液的质量体积比为100～800克/升，无机酸在水溶液中的浓度为0.1～2mol/L，反应结束后加无机碱中和至PH5～7.5，随后减压蒸干得到酸处理孢子粉。

(2)将步骤(1)得到的酸处理孢子粉加入水中浸泡2～24小时，孢子粉与水的质量比为1：6～15，浸泡液浓缩或不浓缩，加入3～8倍体积与水互溶的有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥。

方法二：

(1)取灵芝孢子粉加入60℃至回流的有机酸或者有机酸水溶液中搅拌10分钟至4小时，灵芝孢子粉与有机酸或者有机酸水溶液的质量体积比为100～800克/升，有机酸在水溶液中的浓度(质量比)为50～100％，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉；

(2)将步骤(1)得到的酸处理孢子粉加入水中浸泡2～24小时，孢子粉与水的质量比为1：6～15，浸泡液浓缩或不浓缩，加入3-8倍体积与水互溶的有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥。

上述的无机酸包含磷酸、硫酸、盐酸或硝酸。

上述的无机碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡或碳酸钙。

上述的有机酸包含甲酸或乙酸。

上述的与水互溶的有机溶剂包括甲醇、乙醇或丙酮。

采用本方法得到的灵芝孢子多糖分子量分布集中。采用高效液相色谱，TSKgelG3000PWXL柱和TSKgelG-Oligo-PW柱串联分离，0.1mol/L硫酸钠为流动相，测得灵芝孢子多糖在色谱柱上保留时间，带入保留时间和分子量对数标准分子量曲线计算，计算得出灵芝孢子多糖的分子量分布在700～10000Da，其中分子量2000～4900Da的部分占60～85％。

本方法得到的灵芝孢子多糖产品分子量分布集中、水溶性好。

本发明制备灵芝孢子多糖的方法简单可以大规模工业化生产，质量稳定。

本方法与过去制备方法显著不同的是，在本发明中，通过酸热处理达到对灵芝孢子粉壁穿透的作用，而且酸会进一步降解孢子粉内部的多糖，促进其释放溶出，获得的灵芝孢子多糖分子量显著减小，更易溶于水。该灵芝孢子多糖可以用于制备具有抗肿瘤或增强免疫功能的药物。也可以用于制备增强免疫功能的保健品。

附图说明

图1：本发明实施例1制备的灵芝孢子多糖的凝胶色谱高效液相图谱

图2：本发明实施例1制备的灵芝孢子多糖的单糖组成分析图谱

图3：本发明实施例1制备的灵芝孢子多糖的¹H-NMR谱图

图4：本发明实施例1制备的灵芝孢子多糖的碳氢二维-NMR谱图

图5：本发明实施例1制备的灵芝孢子多糖的甲基化GC-MS分析的GC图谱

图6：本发明实施例1制备的灵芝孢子多糖的甲基化GC图谱中保留时间12.655min峰的MS图谱

图7：本发明实施例1制备的灵芝孢子多糖的甲基化GC图谱中保留时间13.314min峰的MS图谱

图8：本发明实施例1制备的灵芝孢子多糖的甲基化GC图谱中保留时间13.529min峰的MS图谱

图9：本发明实施例1制备的灵芝孢子多糖的甲基化GC图谱中保留时间14.150min峰的MS图谱

图10：本发明实施例2制备的灵芝孢子多糖的凝胶色谱高效液相图谱

图11：本发明实施例3制备的灵芝孢子多糖的凝胶色谱高效液相图谱

图12：本发明实施例4制备的灵芝孢子多糖的凝胶色谱高效液相图谱

图13：本发明实施例5制备的灵芝孢子多糖的凝胶色谱高效液相图谱

图14：本发明实施例6制备的灵芝孢子多糖的凝胶色谱高效液相图谱

图15：本发明实施例7制备的灵芝孢子多糖的凝胶色谱高效液相图谱

图16：本发明实施例8制备的灵芝孢子多糖的凝胶色谱高效液相图谱

具体实施方式

通过下述实施例可以进一步理解本发明，但是不能限制本发明的内容。

实施例1

(1)取灵芝孢子粉50g加入500mL0.1mol/L的硫酸水溶液中搅拌，硫酸溶液加热至100℃搅拌4小时，反应结束后加氢氧化钡中和至PH7.5，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉。

(2)向步骤(1)的酸处理孢子粉中加入水500mL浸泡2小时，浸泡液过滤浓缩至50mL，加入150mL乙醇醇沉，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥得到灵芝孢子多糖。

(3)该灵芝孢子多糖室温在水中溶解度为90mg/mL，溶液澄清。经高效液相检测其分子量分布为850～9000Da，其中分子量2000～4900Da部分占85％。经单糖组成分析其为葡聚糖。通过GC-MS的MS图谱，GC图谱中保留时间12.655min的为D-末端葡萄糖，保留时间13.314min的为1,3-连接葡萄糖和1,4-连接葡萄糖，保留时间13.529min的为1,6-连接葡萄糖，保留时间14.150min的为1,3,6-连接葡萄糖。结合C-H二维谱图、1H-NMR谱图上推断灵芝孢子多糖中各种连接方式的摩尔比如下表：

连接方式	氢谱化学位移(ppm)	摩尔数
			α-Glcp(1→	5.07	1
→4)-α-Glcp-(1→	5.22、5.21	5
			β-Glcp-(1→	4.83	1
β-Glcp-(1→	4.50	1
			→6)-β-Glcp-(1→	4.58	3
→3)-β-Glcp-(1→	4.37	4
			→3,6)-β-Glcp-(1→	4.38	3

可以推断灵芝孢子多糖具有以下的结构单元：

，其中n＝1～2。

实施例2

(1)取灵芝孢子粉50g加入62.5mL2mol/L的磷酸水溶液中搅拌，磷酸溶液加热至60℃搅拌10分钟，反应结束后加氢氧化钠中和至PH7.0，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉。

(2)向步骤(1)的酸处理孢子粉中加入水750mL浸泡6小时，浸泡液过滤浓缩至60mL，加入300mL丙酮醇沉，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥得到灵芝孢子多糖。经高效液相检测其分子量分布为750～9000Da，其中分子量2000～4900Da部分占77％。

实施例3

(1)取灵芝孢子粉50g加入150mL1mol/L的盐酸水溶液中搅拌，盐酸溶液加热至80℃搅拌30分钟，反应结束后加碳酸钙中和至PH6.0，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉。

(2)向步骤(1)的酸处理孢子粉中加入水400mL浸泡12小时，浸泡液过滤浓缩至60mL，加入480mL甲醇醇沉，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥得到灵芝孢子多糖。经高效液相检测其分子量分布为700～10000Da，其中分子量2000～4900Da部分占65％。

实施例4

(1)取灵芝孢子粉50g加入300mL0.5mol/L的硝酸水溶液中搅拌，硝酸溶液加热至90℃搅拌1小时，反应结束后加氢氧化钾中和至PH5.0，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉。

(2)向步骤(1)的酸处理孢子粉中加入水300mL浸泡24小时，浸泡液过滤加入1500mL乙醇醇沉，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥得到灵芝孢子多糖。经高效液相检测其分子量分布为700～10000Da，其中分子量2000～4900Da部分占70％。

实施例5

(1)取灵芝孢子粉50g加入300mL100％的乙酸水溶液中搅拌，乙酸溶液加热至回流搅拌10分钟，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉。

(2)向步骤(1)的酸处理孢子粉中加入水300mL浸泡24小时，浸泡液过滤加入1500mL乙醇醇沉，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥得到灵芝孢子多糖。经高效液相检测其分子量分布为700～9500Da，其中分子量2000～4900Da部分占60％。

实施例6

(1)取灵芝孢子粉50g加入500mL80％的乙酸水溶液中搅拌，乙酸溶液加热至90℃搅拌1小时，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉。

(2)向步骤(1)的酸处理孢子粉中加入750mL浸泡2小时，浸泡液过滤浓缩至60mL，加入180mL丙酮醇沉，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥得到灵芝孢子多糖。经高效液相检测其分子量分布为700～10000Da，其中分子量2000～4900Da部分占60％。

实施例7

(1)取灵芝孢子粉50g加入62.5mL50％的甲酸水溶液中搅拌，甲酸溶液加热至60℃搅拌4小时，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉。

(2)向步骤(1)的酸处理孢子粉中加入水400mL浸泡12小时，浸泡液过滤浓缩至60mL，加入480mL甲醇醇沉，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥得到灵芝孢子多糖。经高效液相检测其分子量分布为800～10000Da，其中分子量2000～4900Da部分占67％。

实施例8

(1)取灵芝孢子粉50g加入150mL70％的甲酸水溶液中搅拌，甲酸溶液加热至70℃搅拌2小时，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉。

(2)向步骤(1)的酸处理孢子粉中加入水500mL浸泡2小时，浸泡液过滤浓缩至50mL，加入150mL甲醇醇沉，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥得到灵芝孢子多糖。经高效液相检测其分子量分布为900～9500Da，其中分子量2000～4900Da部分占75％。

实施例9灵芝孢子多糖对小鼠肉瘤S180的生物活性测试

注：^**与阴性对照组相比,p值<0.01。

实施例10灵芝孢子多糖对小鼠Lewis肺癌(足趾皮下接种)模型的疗效

注：^**与阴性对照组相比,p值<0.01。

实施例11灵芝孢子多糖对足趾皮下接种Lewis肺癌切除原发灶小鼠免疫细胞免疫功能变化影响

Claims

1.一种灵芝孢子多糖，系用有机酸或无机酸热处理孢子粉，减压蒸干溶剂，随后用水浸泡灵芝孢子粉，滤取浸泡液加入有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥方法获得灵芝孢子多糖，其特征是所述的灵芝孢子多糖是一种分子量分布在700～10000Da范围内的水溶性葡聚糖；其中2000～4900Da的部分占60-85％，灵芝孢子多糖具有α-Glcp(1→、→4)-α-Glcp-(1→、β-Glcp-(1→、→6)-β-Glcp-(1→、→3)-β-Glcp-(1→、→3,6)-β-Glcp-(1→六种连接方式，其摩尔比为1:5:2:3:4:3。

2.一种灵芝孢子多糖，其结构通式为：

，其中n＝1～2。

3.一种如权利要求1、2所述的灵芝孢子多糖的制备方法，其特征是通过如下的步骤1)、3)或2)、3)两种方法获得：

1)取灵芝孢子粉加入无机酸水溶液中搅拌，灵芝孢子粉与无机酸水溶液的质量体积比为100～800克/升，在无机酸水溶液中60℃至回流温度反应10分钟至4小时，反应结束后加无机碱中和至pH5～7.5，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉；

2)取灵芝孢子粉加入有机酸或有机酸水溶液中搅拌，灵芝孢子粉与有机酸或有机酸水溶液的质量体积比为100～800克/升，有机酸或有机酸水溶液60℃至回流搅拌10分钟至4小时，减压蒸干溶剂得到酸处理孢子粉；

3)将酸处理孢子粉用水浸泡，浸泡液浓缩或不经浓缩，用与水互溶的有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥。

4.一种如权利要求3所述的方法，其特征是步骤1)中所述的无机酸是磷酸、硫酸、盐酸、硝酸，酸的水溶液浓度0.1～2mol/L；所述的无机碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、碳酸钙。

5.一种如权利要求3所述的方法，其特征是步骤2)中所述的有机酸是甲酸或乙酸，酸的水溶液浓度50～100％。

6.如权利要求3所述的方法，其特征是：所述步骤3)中灵芝孢子粉与水浸泡的重量比是1：6～15，浸泡时间2～24小时。

7.如权利要求3所述的方法，其特征是：所述步骤3)中与水互溶的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，浸泡液与有机溶剂的体积比是1：3～8。

8.如权利要求1、2所述的灵芝孢子多糖用于制备具有抗肿瘤或增强免疫功能的药物。

9.如权利要求1、2所述的灵芝孢子多糖用于制备保健品。