CN102336931A - 麦冬多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从中药麦冬中提取分离出的多糖，以及该多糖相应的制备方法，以及该多糖在制药中的应用。本发明公开的麦冬多糖，为包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖的杂多糖，其中半乳糖和葡萄糖的比例为1：1-3，阿拉伯糖含量为1-10%，重均分子量为2-10万。本发明的麦冬多糖的制备方法简单易行，成本低廉，产率高，适合于工业化生产，经过两次层析处理后所获得的麦冬多糖纯度高，容易保存，并且其具有作为活性成分用于降低血糖及其相关领域的特别功效。

Description

麦冬多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及从中药麦冬中提取分离出的多糖，以及该多糖相应的制备方法，以及该多糖在制药中的应用。

背景技术

中药麦冬是百合科（Liliaceae）多年生草本植物沿阶草属（Ophiopogon Ker Gawl）植物麦冬（Ophiopogon japonicus）（Lf）Ker Gawl的干燥块根，味甘、微苦、性微寒。入心、肺、 胃经。有养阴生津，润肺清心的功效。文献报道[周福波，牡丹江医学院学报， 27（3）：69-70 （2006）]，麦冬的主要化学成分为甾体皂甙、多糖、高异黄酮类、氨基酸等。麦冬具有多种药理作用，可以增加机体耐缺氧能力；具有抗心律失常的作用；提高机体免疫功能等作用。此外，麦冬中还含有多种多糖，而且随着提取条件的不同有所变化。目前大多的研究仅局限于其多糖的粗提物，未见有关均一多糖组分降血糖活性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供从麦冬中提取分离出具有降血糖活性成分的多糖，及其该多糖物质的制备方法和制药的相关应用。

本发明公开的麦冬多糖，为包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖的杂多糖，其中半乳糖和葡萄糖的比例为1：1-3，阿拉伯糖含量为1-10%，重均分子量为2-10万。

本发明所制备的麦冬多糖，其样品的红外吸收图谱采用KBr压片法测定，从IR图中可以得知麦冬多糖具有典型的多糖的吸收特征。经元素分析表明不含N、S等杂原子，经完全酸水解，并用标准单糖作对照，气相色谱分析表明由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，并且其含量分别是半乳糖和葡萄糖的比例为1：1-3，阿拉伯糖含量为1-10%，采用Waters 600 HPLC-GPC测得重均分子量分布为2-10万。

本发明还提供的是上述麦冬多糖的制备方法，包含下述步骤:将干燥的麦冬块根粉碎，然后浸泡在蒸馏水中，加热提取2-3次, 过滤后合并滤液，减压浓缩，去除蛋白质，乙醇沉淀，冷冻干燥得麦冬粗多糖，将麦冬粗多糖溶解后离心，取上清液经离子交换层析，用水以及0.05-1mol/L NaCl梯度洗脱，硫酸-蒽酮法检测糖峰，收集后脱盐浓缩，然后水溶解后经凝胶过滤层析，硫酸-蒽酮法检测糖峰，收集糖峰后冷冻干燥，得浅黄色固态麦冬多糖。

本发明的麦冬多糖的制备方法简单易行，成本低廉，产率高，适合于工业化生产，经过两次层析处理后所获得的麦冬多糖纯度高，容易保存，并且其具有作为活性成分用于降低血糖及其相关领域的特别功效。

麦冬多糖的制备方法优选方案是加热提取之前使用乙酸乙酯回流去杂质预处理。增加的预处理步骤可以在提取前去除杂质，使后续的提取不受杂质影响。

麦冬多糖的制备方法优选方案是麦冬与水的重量比为1:5-15，水溶液的pH 为 6-8，加热提取的时间为1-6小时。目的是考虑其回收效率，在成本和获得率之间取得平衡。

麦冬多糖的制备方法优选方案是使用Sevage法去除蛋白质。采用该方法脱蛋白可以高效去除蛋白质，防止多糖的降解。

麦冬多糖的制备方法优选方案是离子交换层析所采用的离子交换剂为DEAE-纤维素或DEAE-Sepharose或DEAE-sephadex。采用如前所述的离子交换剂对麦冬多糖起到纯化作用，减少其他化合物的影响，获得理想中的麦冬多糖。

麦冬多糖的制备方法优选方案是凝胶过滤层析所采用的凝胶为Sephadex G型或Superose型或Bio-Gel P型或Superdex,选用的分离范围为1x10³-5x10⁵道尔顿。采用如前所述的凝胶填料对麦冬多糖起到纯化作用，获得可起到活性作用的限定分子量区间的麦冬多糖。

本发明还提供如前所述的麦冬多糖在制备降血糖的药物中的应用。

本发明还提供如前所述的麦冬多糖在制备降血糖的保健品中的应用。

本发明还提供如前所述的麦冬多糖在制备治疗糖尿病的药物中的应用。

经生物活性实验结果表明，本发明所制备的特殊结构的麦冬多糖具有明显的降血糖作用，可用于制备降血糖的药物或保健品，进一步拓展用途是可用于制备治疗糖尿病的药物。

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1 是麦冬多糖的IR吸收图谱。

图2 是麦冬多糖的完全酸水解乙酰化产物气相色谱图。

图3 是标准单糖乙酰化产物的气相色谱图。

图4 是麦冬多糖完全甲基化后气相色谱图。

图5 是麦冬多糖给药第四周大鼠胰腺组织胰岛素免疫组织化学染色病理切片（DAB显色、苏木素复染，x200），其中，图5-1为正常对照组，图5-2为糖尿病对照组，图5-3为低麦冬多糖剂量给药组，图5-4为高麦冬多糖剂量给药组。

具体实施方式

实施例1  麦冬多糖的制备

将干燥麦冬块根1kg粉碎，用乙酸乙酯回流2次，每次2小时，药渣用蒸馏水加热提取3次，每次2-3小时；过滤，合并滤液，50～60℃减压浓缩；用Sevage法除蛋白；水相加入95%乙醇至醇含量达70～80%，静置过夜；冷冻干燥，得淡黄色麦冬粗多糖。将麦冬粗多糖100g，溶于5-10 ml蒸馏水中，离心（4500r/min,10min）。取上清液上DEAE-纤维素柱，用水洗脱，再用0.05～1M NaCl 梯度洗脱，流速0.5 ml/min,每管5 ml，硫酸蒽酮法检测糖峰，收集后脱盐浓缩，然后水溶解上Sephadex G100 柱，用0.05 M的低浓度NaCl洗脱，流速0.5 ml/min,每管5ml，硫酸蒽酮法检测糖峰，收集后冷冻干燥，得浅黄色麦冬多糖纯品。

 

实施例2  麦冬多糖的结构表征

将实施例1所得样品的红外吸收图谱采用KBr压片法测定，结果如图1所示，从IR图中可见，麦冬多糖具有典型的多糖的吸收特征。

取多糖样品10mg，完全酸水解，干燥后加10mg盐酸羟胺及0.5ml吡啶，温热溶解，在90℃反应30分钟，冷至室温，加入0.5ml醋酸酐，在90℃反应30分钟，冷至室温，加入1ml水，用氯仿萃取3次，每次1ml，合并氯仿，抽干。进行气相色谱分析，结果如图2所示，并且参照图3的标准单糖气相色谱分析作对照，得出麦冬多糖主要有阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，其中半乳糖和葡萄糖的比例为1：1-3，阿拉伯糖含量为1-10%。

通过液相色谱仪Waters 600 HPLC-GPC可测得麦冬多糖重均分子量分布为2-10万。

糖残基的连接方式采用甲基化GC-MS分析法。将样品加入2 mL DMSO中，充入氮气，密闭，超声使样品溶解，加入100 mg干的NaOH粉末，充氮气，超声至大部分NaOH溶解。冰浴中加入1 mL碘甲烷，室温搅拌2 h，加入3 mL水使反应终止，透析，冷冻干燥。以上步骤重复至样品完全甲基化。完全甲基化样品中加入2ml 1mol/L TFA溶液于100℃ 反应2小时，减压蒸发至干。加甲醇3ml 再减压蒸发至干，进行GC-MS分析。结果见图4，可知麦冬多糖主要是以（1→6）、（1→4）葡萄糖和（1→6）半乳糖残基为主，含有（1→2）、（1→3）葡萄糖以及（1→4）半乳糖残基的分支。

 

实施例3 麦冬多糖的生物活性研究

采用STZ诱导建立2型糖尿病模型大鼠，选取体重为100±10 g的雄性SD 大鼠给予高脂高糖饲料喂养9周诱导大鼠出现胰岛素抵抗后，腹腔多次注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）30 mg/kg，建立大鼠2型糖尿病模型，造模成功后，随机分4组：糖尿病对照组（DM）、麦冬多糖给药组（150 mg/kg/d，300 mg/kg/d，麦冬多糖溶解在生理盐水中，灌胃给药）和阳性对照组（二甲双胍：200 mg/kg/d）。给药4 周后，所有大鼠一次性处死，留取血清、肝脏和肾脏组织。观察麦冬多糖对糖尿病大鼠空腹血糖、胰岛素，体重，血脂四项水平的影响，化学比色法检测血清及肝肾组织丙二醛（MDA） 的含量、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，结果分别如下：

表1 麦冬多糖对糖尿病大鼠血糖的影响

^## P<0.01 （与正常组比较）；** P<0.01， * P<0.05 （与对照组比较）

麦冬多糖给药组与糖尿病对照组相比，具有明显的降血糖作用，尤其是低剂量麦冬多糖给药组，与对照组相比具有极显著作用。

表2 麦冬多糖对胰岛素水平的影响 (x±s)

	正常组	对照组	低麦冬组	高麦冬组	二甲双胍组
						胰岛素（IU/ml）	18.24±1.22	9.79±0.62##	20.79±1.42##**	11.44±0.86##*	17.70±1.03**

^## P<0.01，^# P<0.05 （与正常组比较）；** P<0.01， * P<0.05 （与对照组比较）

糖尿病对照组大鼠胰岛功能受到了一定的损伤，胰岛素的释放大大降低，但以麦冬多糖喂药后胰岛功能得到一定的改善，尤其是低剂量麦冬给药组，能显著提高糖尿病对照大鼠的胰岛素水平，具有明显的提升胰岛功能，促进胰岛素的分泌。

表3 麦冬多糖对糖尿病大鼠体重的影响

^## P<0.01 （与正常组比较）；** P<0.01， * P<0.05 （与对照组比较）

    糖尿病对照组大鼠，没有给予相应药物治疗的情况下日渐消瘦，体重日益减少，与正常对照组比较有显著地差异。在进行药物治疗后，虽然体重有所下降，但与对照组相比，得到了极大地改善。表明麦冬多糖对糖尿病大鼠的生理状况也有一定的改善作用。

表4 麦冬多糖对糖尿病大鼠血脂代谢的影响(x±s)

	甘油三酯(mmol/l)	总胆固醇(mmol/l)	高密度脂蛋白胆固醇(mmol/l)	低密度脂蛋白胆固醇(mmol/l)
					正常组	1.45±0.23	1.92 ±0.34	1.61±0.21	0.29±0.04
对照组	3.45±0.45##	2.72±0.49##	1.27±0.21#	0.37±0.08#
					低麦冬组	2.18±0.27##**	2.17±0.26*	1.53±0.19*	0.26±0.11*
高麦冬组	3.04±0.32##	2.32±0.25#	1.41±0.25	0.33±0.16

^## P<0.01，^# P<0.05 （与正常组比较）；** P<0.01， * P<0.05 （与对照组比较）

糖尿病对照组与正常组相比，甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇有显著地升高，而高密度脂蛋白胆固醇明显降低，这与2型糖尿病血脂代谢异常相吻合。对糖尿病大鼠进行麦冬多糖给药后，低麦冬剂量的治疗者能有效地降低甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平，并能明显提高高密度脂蛋白胆固醇水平。可见，低麦冬剂量对糖尿病大鼠血脂代谢紊乱有明显的调节作用，能预防高血脂并发症的发生，减弱脂毒性对机体的损伤,有利于机体的恢复和防止心血管并发症的产生和发展，并对相关并发症起到一定的预防作用，有利于糖尿病的病症的缓解和治疗。

表5 麦冬多糖对SOD、GPx的酶活力及MDA含量的影响(x±s)

^## P<0.01，^# P<0.05 （与正常组比较）；** P<0.01， * P<0.05 （与对照组比较）

糖尿病对照组的血清或肝脏中SOD和GPx酶活性大大降低，同时MDA含量极大升高，表明糖尿病对照组中大鼠的抗氧化体系受到了损害，体内自由基不能有效清除。麦冬多糖给药治疗后，血清和肝组织中SOD和GPx活性显著升高，MDA浓度显著降低，具有明显的抗氧化作用，表明麦冬多糖能有效清除机体内的自由基，增强糖尿病大鼠的抗氧化能力，改善糖尿病大鼠的氧化应激，从而对胰岛细胞起到一定的保护作用。

通过免疫组化法检测胰腺组织的情况，获得如图5所示的病理切片，通过图5-1正常对照组可知，胰岛呈球形细胞团，分布于腺泡之间，胰岛细胞正常，细胞界限清晰，呈团索状分布，细胞核清楚呈卵圆形。通过图5-2与图5-1可知，糖尿病对照组胰岛镜下观察见胰岛细胞数减少，胰岛多见以淋巴细胞、单核细胞为主的炎细胞浸润。胰岛B细胞变性，呈空泡状态，有较多的细胞出现核固缩，多数核心偏位。通过图5-3、图5-4相比图5-2的糖尿病对照组可知，麦冬多糖用药组胰岛内分泌细胞结构基本正常，肿胀的细胞减少, 核仁多清晰，胞浆接近均匀，排列规则整齐，变性细胞明显减少，大小不等的空泡减少，分泌细胞密度较糖尿病对照组有较大的增加，胰岛形态有明显改善，胰岛淋巴细胞浸润显著减弱，表明麦冬多糖能避免或减轻胰岛B细胞的损伤。

Claims (10)

1.一种麦冬多糖，为包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖的杂多糖，其中半乳糖和葡萄糖的比例为1：1-3，阿拉伯糖含量为1-10%，重均分子量为2-10万。

2.一种麦冬多糖的制备方法，包含下述步骤:将干燥的麦冬块根粉碎，然后浸泡在蒸馏水中，加热提取2-3次, 过滤后合并滤液，减压浓缩，去除蛋白质，乙醇沉淀，冷冻干燥得麦冬粗多糖，将麦冬粗多糖溶解后离心，取上清液经离子交换层析，用水以及0.05-1mol/L NaCl梯度洗脱，硫酸-蒽酮法检测糖峰，收集后脱盐浓缩，然后水溶解后经凝胶过滤层析，硫酸-蒽酮法检测糖峰，收集糖峰后冷冻干燥，得浅黄色固态麦冬多糖。

3.根据权利要求2所述麦冬多糖的制备方法，加热提取之前使用乙酸乙酯回流去杂质预处理。

4.根据权利要求2所述麦冬多糖的制备方法，麦冬与水的重量比为1:5-15，水溶液的pH为6-8，加热提取的时间为1-6小时。

5.根据权利要求2所述麦冬多糖的制备方法，使用Sevage法去除蛋白质。

6.根据权利要求2所述麦冬多糖的制备方法，离子交换层析所采用的离子交换剂为DEAE-纤维素或DEAE-Sepharose或DEAE-sephadex。

7.根据权利要求2或6所述麦冬多糖的制备方法，凝胶过滤层析所采用的凝胶为Sephadex G型或Superose型或Bio-Gel P型或Superdex,选用的分离范围为1x10³-5x10⁵道尔顿。

8.权利要求1所述的麦冬多糖在制备降血糖的药物中的应用。

9.权利要求1所述的麦冬多糖在制备降血糖的保健品中的应用。

10.权利要求1所述的麦冬多糖在制备治疗糖尿病的药物中的应用。

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